Name: extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00
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Este trabalho foi apoiado pelos fundos de startup da Illinois State University School of Biological Sciences, Illinois State University New Faculty Initiative Grant, e o NIAID grant R15AI164585 (para J.-U. D.). G.M.A. foi apoiado pelo Programa de Apoio à Pesquisa de Graduação da Universidade Estadual de Illinois (para G.M.A.). K. P. H. foi apoiado por uma bolsa rise fornecida pelo Serviço Alemão de Intercâmbio Acadêmico (DAAD). Os autores agradecem ao Dr. Uwe Landau e ao Dr. Carsten Meyer da Largentech Vertriebs GmbH por fornecerem o pó AGXX. Foram geradas as Figuras 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4e Figura 5 com Biorender.

1. Tratamento de estresse de E. coli cepas MG1655 e CFT073
<ol><li>Inocula 5 mL de caldo de lisogenia (LB) médio com uma única colônia de cepa E. coli commensal MG1655 e uropatogenic E. coli (UPEC) cepa CFT073, respectivamente, e incubar por 14-16 h (durante a noite) a 37 °C e 300 rpm. NOTA: Escherichia coli CFT073 é um patógeno humano. O manuseio do CFT073 deve ser realizado com medidas de biossegurança adequadas em um laboratório certificado de Biossegurança Nível-2.</...

<ol>
	<li>Dahl, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria.">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li><li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid.">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).</li><li>Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions.">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li><li>Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants.">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever.">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).</li><li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+life+on+the+verge+of+death.">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li><li>Van Loi, V., Busche, T., Preu&#223;, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AGXX+&#174;+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus.">The AGXX &#174; antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).</li><li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding.">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+in+bacteria.">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone.">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li><li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tam&#225;s, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties.">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554 (2016).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding.">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).</li><li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Th&#252;ring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus.">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).</li><li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells.">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li><li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-F&#246;hn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles.">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li><li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast.">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li><li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli.">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li><li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress:+Lessons+from+a+model+bacterium.">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li><li>M&#252;hlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins.">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li><li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria.">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP60/10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs,+natural+products,+and+known+bioactive+molecules.">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus.">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li></ol>

Este protocolo descreve uma metodologia otimizada para a análise da formação de agregado de proteínas após o tratamento de diferentes cepas de E. coli com um antimicrobiano proteotóxico. O protocolo permite a extração simultânea de frações proteicas insolúveis e solúveis de células E. coli tratadas e não tratadas. Em comparação com os protocolos existentes para o isolamento agregado de proteínas das células14,15,<su...

As bactérias são inevitavelmente expostas a uma miríade de estresses ambientais, incluindo pH baixo (por exemplo, no estômago dos mamíferos)1,2, oxigênio reativo e espécies de cloro (ROS/RCS) (por exemplo, durante a explosão oxidativa em fagocitos)3,4,5, temperaturas elevadas (por exemplo, em fontes termais ou durante o choque térmico)6,7, e vários antimicrobianos potentes (por exemplo, AGXX usados neste protocolo)8. As proteínas são particularmente vulneráveis a qualquer um desses estressores, e a exposição pode provocar a não-/misfolding de proteínas que, em seguida, a agregação de sementes. Todos os organismos empregam sistemas de proteção que lhes permitem lidar com o erro de proteína9. No entanto, o estresse severo pode sobrecarregar o maquinário de controle de qualidade proteica e interromper a estrutura secundária e/ou terciária das proteínas, o que acaba inativando proteínas. Como consequência, os agregados proteicos podem prejudicar severamente as funções celulares críticas necessárias para o crescimento e sobrevivência bacteriana, resistência ao estresse e virulência10. Portanto, pesquisas com foco na agregação de proteínas e suas consequências nas bactérias são um tema relevante devido ao seu potencial impacto no controle de doenças infecciosas.
O desdobramento e a agregação de proteínas induzidas pelo calor são muitas vezes reversíveis7. Em contraste, outras tensões proteotoxiais, como o estresse oxidativo, podem causar modificações proteicas irreversíveis através da oxidação de cadeias laterais específicas de aminoácidos resultando em proteínas não-/misfolding e, eventualmente, agregação deproteínas 4. A formação induzida pelo estresse de agregados proteicos insolúveis tem sido extensivamente estudada no contexto de acompanhantes moleculares e suas funções protetoras na levedura e bactérias11,12,13. Vários protocolos foram publicados que utilizam uma variedade de técnicas bioquímicas para o isolamento e análise dos agregados de proteínas insolúveis14,15,16,17. Os protocolos existentes têm sido usados principalmente para estudar a agregação de proteínas bacterianas mediante choque térmico e/ou identificação de acompanhantes moleculares. Embora esses protocolos tenham sido certamente um avanço para o campo, há alguns grandes inconvenientes nos procedimentos experimentais porque exigem (i) um grande volume de cultura bacteriana de até 10 L14,17, (ii) complicados processos de interrupção física, incluindo o uso de disruptores celulares, imprensa francesa e/ou sonicação14,15,17, ou (iii) demorado repetidos lalavís e incubação etapas15,16,17.
Este artigo descreve um protocolo modificado que visa abordar as limitações das abordagens anteriores e permite a análise da quantidade de agregados proteicos formados em duas cepas diferentes de Escherichia coli após o tratamento com um revestimento de superfície antimicrobiana proteotoxic. O revestimento é composto de metal-prata (Ag) e rutênio (Ru)-condicionado com ácido ascórbico, e sua atividade antimicrobiana é alcançada pela geração de espécies reativas de oxigênio8,18. Aqui está uma descrição detalhada da preparação da cultura bacteriana após o tratamento com o composto antimicrobiano e uma comparação do estado de agregação de proteínas após a exposição de duas cepas de E. coli com perfis distintos de suscetibilidade ao aumento da concentração do antimicrobiano. O método descrito é barato, rápido e reprodutível e pode ser usado para estudar a agregação de proteínas na presença de outros compostos proteotóxicos. Além disso, o protocolo pode ser modificado para analisar o impacto que exclusões genéticas específicas têm na agregação de proteínas em uma variedade de bactérias diferentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals/Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>P008-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>B-092-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>821616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBT9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>G-630-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402893-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3522-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>L-040-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T9281-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Trichloroacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>JABG-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (125 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (500 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer: -80 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1107-9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z216MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Axygen Maxiclear Microtubes</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-377-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>RS7235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer plates (1 mm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>3339053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor

A exposição de organismos vivos a estresses ambientais e celulares muitas vezes causa interrupções na homeostase proteica e pode resultar em agregação de proteínas. O acúmulo de agregados proteicos em células bacterianas pode levar a alterações significativas no comportamento fenotípico celular, incluindo uma redução nas taxas de crescimento, resistência ao estresse e virulência. Existem vários procedimentos experimentais para o exame desses fenótipos mediados pelo estressor. Este artigo descreve um ensaio otimizado para a extração e visualização de proteínas agregadas e solúveis de diferentes cepas de Escherichia coli após o tratamento com um antimicrobiano contendo prata-rutênio. Este composto é conhecido por gerar espécies reativas de oxigênio e causa agregação generalizada de proteínas. 
O método combina uma separação baseada em centrifugação de agregados proteicos e proteínas solúveis de células tratadas e não tratadas com posterior separação e visualização por eletroforese de gel de sulfato-poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE) e coloração coomassie. Esta abordagem é simples, rápida e permite uma comparação qualitativa da formação de proteína agregada em diferentes cepas de E. coli. A metodologia possui uma ampla gama de aplicações, incluindo a possibilidade de investigar o impacto de outros antimicrobianos proteotóicos na agregação de proteínas in vivo em uma ampla gama de bactérias. Além disso, o protocolo pode ser usado para identificar genes que contribuem para o aumento da resistência às substâncias proteotoxias. Bandas de gel podem ser usadas para a identificação subsequente de proteínas particularmente propensas à agregação.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> Figura 6: Resultados representativos da agregação de proteínas induzidas por antimicrobianos na cepa Escherichia coli commensal MG1655 e cepa UPEC CFT073. As cepas E. coli MG1655 e CFT073 foram cultivadas a 37 °C e 300 rpm a OD600= 0,5-0,55 na mídia MOPS-g antes de serem tratadas com as concentrações indicadas (-, 0 mg/mL; ...

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Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Este protocolo descreve a extração e visualização de proteínas agregadas e solúveis de Escherichia coli após o tratamento com um antimicrobiano proteotóxico. Após este procedimento permite uma comparação qualitativa da formação de agregado de proteínas in vivo em diferentes cepas bacterianas e/ou entre os tratamentos.

Extração e Visualização de Agregados proteicos após tratamento de Escherichia coli com um Estressor Proteotóxico

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

A exposição ao estresse pode causar agregação de proteínas e resultar em alterações significativas no comportamento fenotípico das bactérias. O procedimento descrito neste vídeo permite a extração e visualização de agregados proteicos após o tratamento do estresse. Em contraste com outros procedimentos publicados, este protocolo exige números de células mais baixos e se abstém de processos complicados de interrupção física, bem como etapas demoradas de lavagem e incubação.Este protocolo pode ser usado para estudar a agregação de proteínas em uma grande variedade de bactérias gram-negativas e gram-positivas. Você também pode analisar o efeito das supressões genéticas ou comparar a eficácia dos compostos proteotóicos. Comece inoculando uma única colônia de e.coli cepa MG1655 e uropathogenic E.coli cepa CFT073, cada uma em cinco mililitros de caldo de lisogenia, ou LB, médio.Incubar as duas culturas de caldo a 37 graus Celsius e 300 rpm por 14 a 16 horas. Diluir cada cepa a uma densidade óptica a 600 nanômetros, ou OD600, de 0,1 em um frasco de 500 mililitros contendo 70 mililitros de mops-g médio. Incubar os frascos a 37 graus e 300 rpm até que a fase de registro médio seja atingida.Após a incubação, transfira 20 mililitros de cada cultura em três frascos pré-aquecidos de 125 mililitros, e incuba-os a 37 graus Celsius e 300 rpm por dois minutos. Prepare uma solução composta antimicrobiana de dois miligramas por mililitro no meio MOPS-g. Adicione esta solução a cada cultura para alcançar as concentrações desejadas e adicione o volume necessário de meio MOPS-g para o controle não tratado.Determine o OD600 de cada cultura após 45 minutos de tratamento de estresse. Para cada amostra, alíquota quatro mililitros de cultura com um OD600 de um em tubos centrífugas de 15 mililitros. Resuspense as pelotas de célula em 50 microliters de tampão de lise gelada.Incubar as amostras por 30 minutos no gelo. Adicione 360 microliters de tampão gelado A às amostras e misture suavemente por pipetação. Transfira as amostras para tubos de microcentrífuga de dois mililitros com cerca de 200 microlitres de contas de vidro de 0,5 milímetros.Incubar os tubos por 30 minutos a oito graus Celsius em um ThermoMixer com agitação a 1400 rpm. Incubar os tubos no gelo por cinco minutos sem tremer para assar as contas de vidro. Em seguida, transfira 200 microlitres do lysato celular em tubos de microcentrífugo de 1,7 mililitro.Centrifugar a célula lysate por 20 minutos a 16.000 vezes g e quatro graus Celsius. Recolhe o supernante, que será usado como amostra de proteína solúvel mais tarde. Use uma pipeta para resuspensar a pelota em 200 microliters de tampão gelado A.Centrifuge dos tubos a 16.000 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos.Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenatante completamente. Use uma pipeta para resususpensar cuidadosamente a pelota em 200 microliters de tampão gelado B.Centrifuge os tubos novamente, e remova cuidadosamente o sobrenante. Em seguida, repita a lavagem com o buffer A.Resuspend a pelota em 100 microliters de 1x reduzindo o buffer de amostra SDS, e ferva-a por cinco minutos em um ThermoMixer a 95 graus Celsius.Misture um volume de 100% TCA com quatro volumes da amostra de proteína solúvel coletada anteriormente, e incubar por 10 minutos a quatro graus Celsius para precipitação proteica. Centrifugar a amostra a 21.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos para obter o precipitado, e remover o sobrenante. Use 200 microliters de acetona gelada para lavar a pelota, para remover detritos celulares.Centrifugar a amostra novamente para obter o precipitado, e remover o supernatante. Para remover a acetona restante das pelotas, mantenha os tubos de microcentrifuuge no ThermoMixer a 37 graus Celsius com as tampas abertas. Em seguida, adicione 100 microliters de 1x reduzindo o buffer SDS para dissolver completamente a pelota, e ferva a amostra a 95 graus Celsius por cinco minutos.Carregue imediatamente a amostra em um gel de poliacrilamida SDS para separação, ou armazene a amostra a menos 20 graus Celsius para prosseguir mais tarde. Prepare dois géis separados como descrito no manuscrito do texto. Despeje o gel entre as placas de vidro usando uma pipeta de um mililitro, garantindo que os dois centímetros superiores estejam livres da mistura.Adicione 70% de etanol em cima do gel de separação, criando uma interface uniforme entre as duas camadas. Uma vez que os géis de separação tenham polimerizado, prepare os géis de empilhamento usando instruções no manuscrito do texto. Em seguida, retire o etanol dos géis de separação e adicione a solução de gel de empilhamento.Insira cuidadosamente um pente com o número desejado de bolsos sem introduzir bolhas de ar, e deixe o gel polimerizar por 20 a 30 minutos. Carregue quatro microliters de cada amostra, bem como a escada de proteína, em poços separados. Em seguida, execute o gel em tampão de corrida tris-glicina a 144 volts por 45 minutos em temperatura ambiente.Use a solução de Fairbanks pré-aquecida A para manchar os géis em um roqueiro por 30 minutos e a solução pré-aquecida de Fairbanks D para descolorir os géis em um roqueiro até que o fundo desejado seja alcançado. Observou-se aumento na quantidade de proteína agregada formada quando as células foram tratadas com 175 microgramas por mililitro e 200 microgramas por mililitro do antimicrobiano, em comparação com células não tratadas. O aumento da fração de proteína insolúvel foi mais acentuado na cepa MG1655 mais sensível.Observou-se diminuição na quantidade de proteínas solúveis quando as células foram tratadas com 175 microgramas por mililitro e 200 microgramas por mililitro do antimicrobiano, em comparação com células não tratadas. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que a normalização da densidade óptica a 600 nanômetros é importante para comparação da extensão da agregação de proteínas nas amostras.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Concepção, produção e purificação

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Bioquímica

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantificação de abundância e carregamento níveis de RNAs de transferência em Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Produção em grande escala de RNAs recombinantes em um andaime Circular usando um sistema derivado de Viroid em Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutagenesis local-dirigido para In Vitro e In Vivo experimentos exemplificados com interações de RNA em Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caracterização de agregados proteicos individuais por Nanoespectroscopia infravermelha e microscopia de força atômica

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Lysine Acetilation specific de Histones para Reconstituição Nucleososome usando Expansão do Código Genético em Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...