Name: extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Эта работа была поддержана стартовыми фондами Школы биологических наук Университета штата Иллинойс, грантом Инициативы нового факультета Университета штата Иллинойс и грантом NIAID R15AI164585 (для J.-U. D.). G.M.A. был поддержан Программой поддержки исследований бакалавриата Университета штата Иллинойс (G.M.A.). K.P.H. была поддержана стипендией RISE, предоставленной Германской службой академических обменов (DAAD). Авторы благодарят д-ра Уве Ландау и д-ра Карстена Мейера из Largentech Vertriebs GmbH за предоставление порошка AGXX. Рисунки 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4и Рисунок 5 были сгенерированы с помощью Biorender.

1. Стресс-лечение штаммов E. coli MG1655 и CFT073
<ol><li>Инокулируют 5 мл среды лизогенезного бульона (ЛБ) одной колонией комменсального штамма E. coli MG1655 и уропатогенного штамма E. coli (УПЭК) CFT073 соответственно и инкубируют в течение 14-16 ч (ночью) при 37 °C и 300 об/мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Escherichia coli...

<ol>
	<li>Dahl, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria.">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li><li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid.">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).</li><li>Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions.">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li><li>Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants.">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever.">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).</li><li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+life+on+the+verge+of+death.">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li><li>Van Loi, V., Busche, T., Preu&#223;, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AGXX+&#174;+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus.">The AGXX &#174; antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).</li><li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding.">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+in+bacteria.">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone.">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li><li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tam&#225;s, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties.">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554 (2016).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding.">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).</li><li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Th&#252;ring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus.">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).</li><li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells.">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li><li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-F&#246;hn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles.">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li><li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast.">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li><li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli.">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li><li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress:+Lessons+from+a+model+bacterium.">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li><li>M&#252;hlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins.">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li><li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria.">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP60/10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs,+natural+products,+and+known+bioactive+molecules.">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus.">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li></ol>

Данный протокол описывает оптимизированную методологию анализа образования белковых агрегатов после обработки различных штаммов E. coli протеотоксическим противомикробным средством. Протокол допускает одновременную экстракцию нерастворимых и растворимых белковых фракций из об...

Бактерии неизбежно подвергаются воздействию множества экологических стрессов, включая низкий рН (например, в желудке млекопитающих)1,2,активные формы кислорода и хлора (ROS / RCS) (например, во время окислительного всплеска в фагоцитах)3,4,5, повышенные температуры (например, в горячих источниках или во время теплового шока)6,7и несколько мощных противомикробных препаратов (например, AGXX, используемый в этом протоколе)8. Белки особенно уязвимы к любому из этих стрессоров, и воздействие может спровоцировать несложение белка, которое затем сеет агрегацию. Все организмы используют защитные системы, которые позволяют им справляться с неправильным свораскиванием белка9. Однако сильный стресс может перегрузить механизм контроля качества белка и нарушить вторичную и /или третичную структуру белков, что в конечном итоге инактивирует белки. Как следствие, белковые агрегаты могут серьезно ухудшить критические клеточные функции, необходимые для роста и выживания бактерий, стрессоустойчивости и вирулентности10. Поэтому исследования, посвященные агрегации белка и ее последствиям у бактерий, является актуальной темой из-за ее потенциального влияния на борьбу с инфекционными заболеваниями.
Тепловое развертывание и агрегация белка часто обратимы7. Напротив, другие протеотоксические стрессы, такие как окислительный стресс, могут вызывать необратимые модификации белка путем окисления определенных аминокислотных боковых цепей, что приводит к разложению белка и, в конечном итоге, агрегации белка4. Стресс-индуцированное образование нерастворимых белковых агрегатов широко изучено в контексте молекулярных шаперонов и их защитных функций у дрожжей и бактерий11,12,13. Было опубликовано несколько протоколов, которые используют различные биохимические методы для выделения и анализа нерастворимых белковых агрегатов14,15,16,17. Существующие протоколы в основном использовались для изучения агрегации бактериального белка при тепловом шоке и/или идентификации молекулярных шаперонов. Хотя эти протоколы, безусловно, были продвижением в этой области, в экспериментальных процедурах есть некоторые серьезные неудобства, поскольку они требуют (i) большого объема бактериальной культуры до 10 л14,17, (ii) сложных процессов физического разрушения, включая использование разрушителей клеток, френч-пресса и / или ультразвуковойобработка 14,15,17или (iii) трудоемкие повторяющиеся этапы промывки и инкубации15,16,17.
В данной работе описывается модифицированный протокол, направленный на устранение ограничений предыдущих подходов и позволяющий анализировать количество белковых агрегатов, образующихся в двух различных штаммах кишечной палочки после обработки протеотоксичным антимикробным поверхностным покрытием. Покрытие состоит из металл-серебра (Ag) и рутения (Ru)-кондиционированного аскорбиновой кислотой, а его антимикробная активность достигается за счет генерации активных форм кислорода8,18. Приведено подробное описание получения бактериальной культуры после обработки антимикробным соединением и сравнение состояния агрегации белка при воздействии двух штаммов E. coli с различными профилями восприимчивости к повышению концентрации противомикробного препарата. Описанный способ является недорогим, быстрым и воспроизводимым и может быть использован для изучения агрегации белка в присутствии других протеотоксических соединений. Кроме того, протокол может быть модифицирован для анализа влияния, которое конкретные делеции генов оказывают на агрегацию белка у множества различных бактерий.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals/Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>P008-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>B-092-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>821616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBT9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>G-630-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402893-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3522-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>L-040-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T9281-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Trichloroacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>JABG-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (125 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (500 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer: -80 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1107-9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z216MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Axygen Maxiclear Microtubes</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-377-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>RS7235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer plates (1 mm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>3339053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor

Воздействие на живые организмы экологических и клеточных стрессов часто вызывает нарушения гомеостаза белка и может привести к агрегации белка. Накопление белковых агрегатов в бактериальных клетках может привести к значительным изменениям в клеточном фенотипической поведения, включая снижение темпов роста, стрессоустойчивости и вирулентности. Существует несколько экспериментальных процедур для изучения этих фенотипов, опосредованных стрессорами. В данной работе описан оптимизированный анализ для экстракции и визуализации агрегированных и растворимых белков из различных штаммов кишечной палочки после обработки серебристо-рутениемсодержащим антимикробным средством. Известно, что это соединение генерирует активные формы кислорода и вызывает широко распространенную агрегацию белка. 
Метод сочетает в себе центрифугирование на основе разделения белковых агрегатов и растворимых белков из обработанных и необработанных клеток с последующим разделением и визуализацией путем электрофореза додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия (SDS-PAGE) и окрашивания Coomassie. Такой подход прост, быстр и позволяет качественно сравнить образование белкового агрегата у разных штаммов E. coli. Методика имеет широкий спектр применения, включая возможность исследования влияния других протеотоксических противомикробных препаратов на агрегацию белка in vivo в широком спектре бактерий. Более того, протокол может быть использован для выявления генов, способствующих повышению устойчивости к протеотоксическим веществам. Гелевые полосы могут быть использованы для последующей идентификации белков, которые особенно склонны к агрегации.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> Рисунок 6:Репрезентативные результаты антимикробной агрегации белка в комменсальном штамме Escherichia coli MG1655 и штамме UPEC CFT073. Штаммы E. coli MG1655 и CFT073 выращивали при 37 °C и 300 об/мин до OD600= 0,5-...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Этот протокол описывает экстракцию и визуализацию агрегированных и растворимых белков из кишечной палочки после лечения протеотоксическим противомикробным средством. Следование этой процедуре позволяет качественно сравнивать образование белковой агрегированности in vivo в различных бактериальных штаммах и/или между обработками.

Экстракция и визуализация белковых агрегатов после лечения кишечной палочки протеотоксическим стрессором

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Воздействие стресса может вызвать агрегацию белка и привести к значительным изменениям в фенотипических поведения бактерий. Процедура, описанная в этом видео, позволяет экстракцию и визуализацию белковых агрегатов после лечения стресса. В отличие от других опубликованных процедур, этот протокол требует более низкого количества клеток и воздержания от сложных процессов физического нарушения, а также трудоемких этапов промывки и инкубации.Этот протокол может быть использован для изучения агрегации белка у широкого спектра грамотрицательных и грамположительных бактерий. Вы также можете проанализировать влияние делеций генов или сравнить эффективность протеотоксических соединений. Начните с инокуляции одной колонии штамма E.coli MG1655 и уропатогенного штамма E.coli CFT073, каждый в пять миллилитров лизогенного бульона, или LB, среды.Инкубировать две культуры бульона при 37 градусах Цельсия и 300 об/мин в течение 14-16 часов. Разбавьте каждый штамм до оптической плотности при 600 нанометрах, или OD600, 0,1 в 500-миллилитровую колбу, содержащую 70 миллилитров среды MOPS-g. Инкубируйте колбы при 37 градусах и 300 оборотах в минуту до достижения средней фазы бревна.После инкубации переложите по 20 миллилитров каждой культуры в три предварительно нагретые 125-миллилитровые колбы и высиживают их при 37 градусах Цельсия и 300 об/мин в течение двух минут. Приготовьте раствор антимикробного соединения с двумя миллиграммами на миллилитр в среде MOPS-g. Добавляют этот раствор в каждую культуру для достижения желаемых концентраций, и добавляют необходимый объем среды MOPS-g для необработанных элементов контроля.Определите OD600 каждой культуры после 45 минут лечения стрессом. Для каждого образца аликвотируют четыре миллилитра культуры с OD600 одного в 15-миллилитровые центрифужные трубки. Повторное суспендирование клеточных гранул в 50 микролитрах ледяного лизисного буфера.Инкубировать образцы в течение 30 минут на льду. Добавьте к образцам 360 микролитров ледяного буфера А и аккуратно перемешайте путем пипетирования. Перенесите образцы в двухмиллилитрные микроцентрифужные трубки с примерно 200 микролитрами 0,5-миллиметровых стеклянных шариков.Инкубировать трубки в течение 30 минут при восьми градусах Цельсия в термомиксе с встряхиванием при 1400 об/мин. Высиживать трубки на льду в течение пяти минут без встряхивания, чтобы осесть стеклянные шарики. Затем переложите 200 микролитров клеточного лизата в 1,7-миллилитровые микроцентрифужные трубки.Центрифугируют клеточный лисат в течение 20 минут при 16 000 раз г и четырех градусах Цельсия. Соберите супернатант, который будет использоваться в качестве образца растворимого белка позже. Используйте пипетку для повторного суспендирования гранулы в 200 микролитрах ледяного буфера А.Центрифуга из пробирок в 16 000 раз в г и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.Затем аккуратно удалите супернатант совсем. Используйте пипетку, чтобы аккуратно повторно суспендировать гранулу в 200 микролитрах ледяного буфера B.Центрифугировать трубки снова и аккуратно удалить супернатант. Затем повторите промывку с буфером A.Resuspend гранулу в 100 микролитров 1x уменьшающего буфера образца SDS и кипятите ее в течение пяти минут в ThermoMixer при 95 градусах Цельсия.Смешайте один объем 100% TCA с четырьмя объемами растворимого образца белка, собранного ранее, и инкубировать в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия для осаждения белка. Центрифугируют образец при 21 000 г и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы получить осадок, и удалите супернатант. Используйте 200 микролитров ледяного ацетона для промывки гранул, чтобы удалить клеточный мусор.Центрифугировать образец снова, чтобы получить осадок, и удалить супернатант. Чтобы удалить оставшийся ацетон из гранул, держите трубки микроцентрифуги в ThermoMixer при 37 градусах Цельсия с открытыми крышками. Затем добавьте 100 микролитров 1x уменьшающего буфера SDS, чтобы полностью растворить гранулу, и кипятите образец при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут.Немедленно загрузите образец на полиакриламидный гель SDS для разделения или сохраните образец при минус 20 градусах Цельсия, чтобы продолжить позже. Подготовьте два разделительных геля, как описано в тексте рукописи. Налейте гель между стеклянными пластинами с помощью одномиллилитровой пипетки, убедив, что верхние два сантиметра свободны от смеси.Добавьте 70% этанола поверх разделяющего геля, создавая равное взаимодействие между двумя слоями. После того, как разделяющие гели полимеризуются, подготовьте гели для укладки, используя инструкции в текстовой рукописи. Затем удалите этанол из разделяющих гелей и добавьте раствор геля для укладки.Осторожно вставьте расческу с нужным количеством карманов, не вводя пузырьков воздуха, и дайте гелю полимеризоваться в течение 20-30 минут. Загрузите четыре микролитра каждого образца, а также белковую лестницу в отдельные скважины. Затем запустите гель в трис-глициновом буфере при 144 вольтах в течение 45 минут при комнатной температуре.Используйте предварительно подогретый раствор Фэрбенкса А для окрашивания гелей на коромысле в течение 30 минут и предварительно подогретый раствор Фэрбенкса D для раскрашив гели на коромысле до тех пор, пока не будет достигнут желаемый фон. Наблюдалось увеличение количества белкового агрегата, образующегося при обработке клеток 175 микрограммами на миллилитр и 200 микрограммами на миллилитр противомикробного препарата, по сравнению с необработанными клетками. Увеличение нерастворимой белковой фракции было более выражено у более чувствительного штамма MG1655.Снижение количества растворимых белков при обработке клеток 175 микрограммами на миллилитр и 200 мкг на миллилитр антимикробного препарата по сравнению с необработанными клетками. При попытке этого протокола имейте в виду, что нормализация оптической плотности на 600 нанометров важна для сравнения степени агрегации белка в образцах.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Направленный Белок Упаковка в везикул наружной мембраны из<em&gt; Кишечная палочка</em&gt;: Проектирование, производство и очистка

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Обнаружение рН-зависимой активности<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Сопровождающий HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; и<em&gt; В Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Обнаружение и визуализация ДНК-индуцированных белковых комплексов в суспензионных клеточных культурах с использованием анализа лигирования близости

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Обогащение моющего средства нерастворимого белка агрегатов от мозга человека посмертный

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Количественная оценка изобилие и зарядки уровней передачи РНК в Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Крупномасштабное производство рекомбинантных молекул РНК на круговой лески с помощью вироиды производные системы в Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Сайт Направленный мутагенез для In Vitro и In Vivo экспериментов примером взаимодействия РНК в Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Характеристика индивидуальных белковых агрегатов с помощью инфракрасной наноспектроскопии и микроскопии атомной силы

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Сайт Конкретные лизин ацетиляции гистонов для нуклеосомы Восстановление с использованием генетического расширения кода в Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...