Name: extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por los fondos de inicio de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Estatal de Illinois, la Subvención de la Iniciativa de Nueva Facultad de la Universidad Estatal de Illinois y la subvención del NIAID R15AI164585 (a J.-U. D.). G.M.A. fue apoyado por el Programa de Apoyo a la Investigación de Pregrado de la Universidad Estatal de Illinois (a G.M.A.). K. P. H. fue apoyado por una beca RISE proporcionada por el Servicio Alemán de Intercambio Académico (DAAD). Los autores agradecen al Dr. Uwe Landau y al Dr. Carsten Meyer de Largentech Vertriebs GmbH por proporcionar el polvo AGXX. Las Figuras 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4y Figura 5 se generaron con Biorender.

1. Tratamiento de estrés de las cepas de E. coli MG1655 y CFT073
<ol><li>Inocular 5 ml de caldo de lisogenia (LB) medio con una sola colonia de cepa commensal de E. coli MG1655 y cepa uropatógena de E. coli (UPEC) CFT073, respectivamente, e incubar durante 14-16 h (durante la noche) a 37 °C y 300 rpm. NOTA: Escherichia coli CFT073 es un patógeno humano. El manejo de CFT073 debe realizarse con las medidas de bioseguridad apropiadas en un laboratorio certificado de Bioseguridad ...

<ol>
	<li>Dahl, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria.">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li><li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid.">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).</li><li>Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions.">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li><li>Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants.">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever.">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).</li><li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+life+on+the+verge+of+death.">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li><li>Van Loi, V., Busche, T., Preu&#223;, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AGXX+&#174;+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus.">The AGXX &#174; antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).</li><li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding.">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+in+bacteria.">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone.">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li><li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tam&#225;s, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties.">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554 (2016).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding.">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).</li><li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Th&#252;ring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus.">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).</li><li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells.">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li><li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-F&#246;hn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles.">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li><li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast.">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li><li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli.">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li><li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress:+Lessons+from+a+model+bacterium.">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li><li>M&#252;hlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins.">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li><li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria.">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP60/10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs,+natural+products,+and+known+bioactive+molecules.">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus.">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li></ol>

Este protocolo describe una metodología optimizada para el análisis de la formación de agregados proteicos después del tratamiento de diferentes cepas de E. coli con un antimicrobiano proteotóxico. El protocolo permite la extracción simultánea de fracciones de proteínas insolubles y solubles de células de E. coli tratadas y no tratadas. En comparación con los protocolos existentes para el aislamiento de agregados de proteínas de las células14,<su...

Las bacterias están inevitablemente expuestas a una miríada de tensiones ambientales, incluyendo pH bajo (por ejemplo, en el estómago de los mamíferos)1,2, especies reactivas de oxígeno y cloro (ROS / RCS) (por ejemplo, durante el estallido oxidativo en los fagocitos)3,4,5, temperaturas elevadas (por ejemplo, en aguas termales o durante el choque térmico)6,7, y varios antimicrobianos potentes (por ejemplo, AGXX utilizado en este protocolo)8. Las proteínas son particularmente vulnerables a cualquiera de estos factores estresantes, y la exposición puede provocar el desplegamiento de proteínas que luego se agregan las semillas. Todos los organismos emplean sistemas de protección que les permiten hacer frente al mal plegamiento de proteínas9. Sin embargo, el estrés severo puede abrumar la maquinaria de control de calidad de proteínas e interrumpir la estructura secundaria y / o terciaria de las proteínas, que en última instancia inactiva las proteínas. Como consecuencia, los agregados de proteínas pueden afectar gravemente las funciones celulares críticas requeridas para el crecimiento y la supervivencia bacteriana, la resistencia al estrés y la virulencia10. Por lo tanto, la investigación centrada en la agregación de proteínas y sus consecuencias en las bacterias es un tema relevante debido a su impacto potencial en el control de enfermedades infecciosas.
El despliegue y la agregación de proteínas inducidas por el calor son a menudo reversibles7. Por el contrario, otras tensiones proteotóxicas, como el estrés oxidativo, pueden causar modificaciones irreversibles de las proteínas a través de la oxidación de cadenas laterales de aminoácidos específicos, lo que resulta en el desplegamiento / mal de la proteína y, eventualmente, la agregación deproteínas 4. La formación inducida por estrés de agregados de proteínas insolubles ha sido ampliamente estudiada en el contexto de chaperonas moleculares y sus funciones protectoras en levaduras y bacterias11,12,13. Se han publicado varios protocolos que utilizan una variedad de técnicas bioquímicas para el aislamiento y análisis de agregados de proteínas insolubles14,15,16,17. Los protocolos existentes se han utilizado principalmente para estudiar la agregación de proteínas bacterianas tras el choque térmico y/o la identificación de chaperonas moleculares. Si bien estos protocolos ciertamente han sido un avance en el campo, hay algunos inconvenientes importantes en los procedimientos experimentales porque requieren (i) un gran volumen de cultivo bacteriano de hasta 10 L14,17, (ii) procesos complicados de interrupción física, incluido el uso de disruptores celulares, prensa francesa y / o sonicación14,15,17o (iii) procesos repetidos que consumen mucho tiempo pasos de lavado e incubación15,16,17.
Este artículo describe un protocolo modificado que tiene como objetivo abordar las limitaciones de los enfoques anteriores y permite el análisis de la cantidad de agregados de proteínas formados en dos cepas diferentes de Escherichia coli después del tratamiento con un recubrimiento superficial antimicrobiano proteotóxico. El recubrimiento está compuesto por metal-plata (Ag) y rutenio (Ru)-acondicionado con ácido ascórbico, y su actividad antimicrobiana se logra mediante la generación de especies reactivas de oxígeno8,18. Aquí hay una descripción detallada de la preparación del cultivo bacteriano después del tratamiento con el compuesto antimicrobiano y una comparación del estado de agregación de proteínas tras la exposición de dos cepas de E. coli con perfiles de susceptibilidad distintos a la concentración creciente del antimicrobiano. El método descrito es barato, rápido y reproducible y se puede utilizar para estudiar la agregación de proteínas en presencia de otros compuestos proteotóxicos. Además, el protocolo se puede modificar para analizar el impacto que las deleciones genéticas específicas tienen en la agregación de proteínas en una variedad de bacterias diferentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals/Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>P008-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>B-092-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>821616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBT9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>G-630-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402893-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3522-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>L-040-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T9281-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Trichloroacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>JABG-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (125 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (500 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer: -80 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1107-9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z216MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Axygen Maxiclear Microtubes</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-377-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>RS7235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer plates (1 mm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>3339053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor

La exposición de los organismos vivos a tensiones ambientales y celulares a menudo causa interrupciones en la homeostasis de las proteínas y puede resultar en la agregación de proteínas. La acumulación de agregados de proteínas en las células bacterianas puede conducir a alteraciones significativas en el comportamiento fenotípico celular, incluida una reducción en las tasas de crecimiento, resistencia al estrés y virulencia. Existen varios procedimientos experimentales para el examen de estos fenotipos mediados por factores estresantes. Este artículo describe un ensayo optimizado para la extracción y visualización de proteínas agregadas y solubles de diferentes cepas de Escherichia coli después del tratamiento con un antimicrobiano que contiene plata-rutenio. Se sabe que este compuesto genera especies reactivas de oxígeno y causa una agregación generalizada de proteínas. 
El método combina una separación basada en centrifugación de agregados de proteínas y proteínas solubles de células tratadas y no tratadas con la posterior separación y visualización por electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y tinción de Coomassie. Este enfoque es simple, rápido y permite una comparación cualitativa de la formación de agregados proteicos en diferentes cepas de E. coli. La metodología tiene una amplia gama de aplicaciones, incluida la posibilidad de investigar el impacto de otros antimicrobianos proteotóxicos en la agregación de proteínas in vivo en una amplia gama de bacterias. Además, el protocolo se puede utilizar para identificar genes que contribuyen a aumentar la resistencia a las sustancias proteotóxicas. Las bandas de gel se pueden utilizar para la identificación posterior de proteínas que son particularmente propensas a la agregación.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> Figura 6: Resultados representativos de la agregación de proteínas inducida por antimicrobianos en la cepa commensal de Escherichia coli MG1655 y la cepa UPEC CFT073. Las cepas de E. coli MG1655 y CFT073 se cultivaron a 37 °C y 300 rpm a OD600= 0,5-0,55 en medios MOPS-g antes de ser tratadas con las concentraciones indicadas (-...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Este protocolo describe la extracción y visualización de proteínas agregadas y solubles de Escherichia coli después del tratamiento con un antimicrobiano proteotóxico. Seguir este procedimiento permite una comparación cualitativa de la formación de agregados proteicos in vivo en diferentes cepas bacterianas y/o entre tratamientos.

Extracción y visualización de agregados proteicos después del tratamiento de Escherichia coli con un estresor proteotóxico

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

La exposición al estrés puede causar agregación de proteínas y provocar alteraciones significativas en el comportamiento fenotípico de las bacterias. El procedimiento descrito en este video permite la extracción y visualización de agregados de proteínas después del tratamiento de estrés. A diferencia de otros procedimientos publicados, este protocolo requiere un menor número de células y se abstiene de complicados procesos de interrupción física, así como de pasos de lavado e incubación que consumen mucho tiempo.Este protocolo se puede utilizar para estudiar la agregación de proteínas en una amplia variedad de bacterias gramnegativas y grampositivas. También puede analizar el efecto de las deleciones de genes o comparar la eficacia de los compuestos proteotóxicos. Comience inoculando una sola colonia de cepa de E.coli MG1655 y cepa uropatógena de E.coli CFT073, cada una en cinco mililitros de caldo de lisogenia, o LB, medio.Incubar los dos cultivos de caldo a 37 grados centígrados y 300 rpm durante 14 a 16 horas. Diluya cada cepa a una densidad óptica a 600 nanómetros, u OD600, de 0,1 en un matraz de 500 mililitros que contenga 70 mililitros de medio MOPS-g. Incubar los matraces a 37 grados y 300 rpm hasta que se alcance la fase logarítrica media.Después de la incubación, transfiera 20 mililitros de cada cultivo a tres matraces precalentados de 125 mililitros e incube a 37 grados Celsius y 300 rpm durante dos minutos. Prepare una solución compuesta antimicrobiana de dos miligramos por mililitro en medio MOPS-g. Agregue esta solución a cada cultivo para alcanzar las concentraciones deseadas y agregue el volumen requerido de medio MOPS-g para el control no tratado.Determinar el OD600 de cada cultivo después de 45 minutos de tratamiento de estrés. Para cada muestra, alícuota cuatro mililitros de cultivo con un OD600 de uno en tubos de centrífuga de 15 mililitros. Resuspend los gránulos celulares en 50 microlitros de tampón de lisis helado.Incubar las muestras durante 30 minutos sobre hielo. Agregue 360 microlitros de tampón A helado a las muestras y mezcle suavemente mediante pipeteo. Transfiera las muestras a tubos de microcentrífuga de dos mililitros con alrededor de 200 microlitros de perlas de vidrio de 0,5 milímetros.Incubar los tubos durante 30 minutos a ocho grados centígrados en un ThermoMixer con agitación a 1400 rpm. Incubar los tubos en hielo durante cinco minutos sin agitar para asentar las perlas de vidrio. Luego transfiera 200 microlitros del lisato celular a tubos de microcentrífuga de 1.7 mililitros.Centrifugar el lisado celular durante 20 minutos a 16.000 veces g y cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante, que se utilizará como muestra de proteína soluble más adelante. Use una pipeta para resuspender el pellet en 200 microlitros de tampón helado A.Centrifugación de los tubos a 16, 000 veces g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos.Luego retire cuidadosamente el sobrenadante por completo. Use una pipeta para resuspender cuidadosamente el pellet en 200 microlitros de tampón helado B.Centrifugar los tubos nuevamente y retire cuidadosamente el sobrenadante. Luego repita el lavado con el tampón A.Vuelva a gastar el pellet en 100 microlitros de tampón de muestra SDS reductor 1x, y hierva durante cinco minutos en un ThermoMixer a 95 grados centígrados.Mezcle un volumen de 100% TCA con cuatro volúmenes de la muestra de proteína soluble recolectada anteriormente, e incube durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para la precipitación de proteínas. Centrifugar la muestra a 21.000 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos para obtener el precipitado, y retirar el sobrenadante. Use 200 microlitros de acetona helada para lavar el pellet, para eliminar los desechos celulares.Centrifugar la muestra de nuevo para obtener el precipitado, y retirar el sobrenadante. Para eliminar la acetona restante de los gránulos, mantenga los tubos de la microcentrífuga en el ThermoMixer a 37 grados centígrados con las tapas abiertas. Luego agregue 100 microlitros de tampón SDS reductor 1x para disolver completamente el pellet y hierva la muestra a 95 grados Celsius durante cinco minutos.Cargue inmediatamente la muestra en un gel de poliacrilamida SDS para su separación, o almacene la muestra a menos 20 grados centígrados para continuar más tarde. Prepare dos geles separadores como se describe en el manuscrito de texto. Vierta el gel entre las placas de vidrio con una pipeta de un mililitro, asegurándose de que los dos centímetros superiores estén libres de la mezcla.Agregue 70% de etanol sobre el gel separador, creando una interfaz uniforme entre las dos capas. Una vez que los geles de separación se hayan polimerizado, prepare los geles de apilamiento utilizando las instrucciones del manuscrito de texto. Luego retire el etanol de los geles de separación y agregue la solución de gel de apilamiento.Inserte cuidadosamente un peine con el número deseado de bolsillos sin introducir burbujas de aire, y deje que el gel polimerice durante 20 a 30 minutos. Cargue cuatro microlitros de cada muestra, así como la escalera de proteínas, en pozos separados. Luego ejecute el gel en tampón de tris-glicina a 144 voltios durante 45 minutos a temperatura ambiente.Use la solución A de Fairbanks precalentada para teñir los geles en un balancín durante 30 minutos y la solución D de Fairbanks precalentada para decolorar los geles en un balancín hasta que se logre el fondo deseado. Se observó un aumento en la cantidad de agregado de proteínas formado cuando las células fueron tratadas con 175 microgramos por mililitro y 200 microgramos por mililitro del antimicrobiano, en comparación con las células no tratadas. El aumento en la fracción de proteína insoluble fue más pronunciado en la cepa MG1655 más sensible.Se observó una disminución en la cantidad de proteínas solubles cuando las células fueron tratadas con 175 microgramos por mililitro y 200 microgramos por mililitro del antimicrobiano, en comparación con las células no tratadas. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que la normalización a la densidad óptica a 600 nanómetros es importante para la comparación del alcance de la agregación de proteínas en las muestras.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Diseño, Producción y Purificación

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Investigación

Bioquímica

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detección de la actividad dependiente del pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Acompañante HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; y<em&gt; En Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano Postmortem

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Cuantificación de la abundancia y la carga de los niveles de ARN de transferencia en Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Producción a gran escala de ARN recombinante en un andamio Circular utilizando un sistema derivado de Viroide en Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutagénesis sitio-dirigida para In Vitro e In Vivo experimentos, ejemplificados con las interacciones de la ARN en Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caracterización de agregados de proteínas individuales por nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Sitio Específico De La Acetilación De Lisina De Histonas Para La Reconstitución De Nucleosomas Utilizando La Expansión Del Código Genético En Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...