Name: extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Illinois State University School of Biological Sciences startfonder, Illinois State University New Faculty Initiative Grant och NIAID-bidraget R15AI164585 (till J.-U. D.). G.M.A. stöddes av Illinois State University Undergraduate Research Support Program (till G.M.A.). K. P. H. stöttades av ett RISE-stipendium från den tyska akademiska växlingstjänsten (DAAD). Författarna tackar Dr. Uwe Landau och Dr. Carsten Meyer från Largentech Vertriebs GmbH för att tillhandahålla AGXX pulver. Figur 1, Figur 2, Figur 3, Figur 4och Figur 5 genererades med Biorender.

1. Stressbehandling av E. coli-stammar MG1655 och CFT073
<ol><li>Inokulera 5 ml lysogenbuljong (LB) medium med en enda koloni av kommensal E. coli stam MG1655 och uropathogenic E. coli (UPEC) stam CFT073, respektive, och inkubera för 14-16 h (över natten) vid 37 °C och 300 rpm. OBS: Escherichia coli CFT073 är en human patogen. Hantering av CFT073 måste utföras med lämpliga biosäkerhetsåtgärder i ett Biosafety Level-2-certifierat labb.</li>
	<li>Späd varje stam i en 500 ...

<ol>
	<li>Dahl, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria.">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li><li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid.">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).</li><li>Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions.">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li><li>Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants.">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever.">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).</li><li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+life+on+the+verge+of+death.">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li><li>Van Loi, V., Busche, T., Preu&#223;, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AGXX+&#174;+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus.">The AGXX &#174; antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).</li><li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding.">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+in+bacteria.">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone.">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li><li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tam&#225;s, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties.">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554 (2016).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding.">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).</li><li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Th&#252;ring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus.">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).</li><li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells.">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li><li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-F&#246;hn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles.">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li><li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast.">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li><li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli.">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li><li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress:+Lessons+from+a+model+bacterium.">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li><li>M&#252;hlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins.">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li><li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria.">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP60/10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs,+natural+products,+and+known+bioactive+molecules.">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus.">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li></ol>

Detta protokoll beskriver en optimerad metodik för analys av proteinaggregatbildning efter behandling av olika E. coli stammar med en proteotoxic antimikrobiell. Protokollet tillåter samtidig extraktion av olösliga och lösliga proteinfraktioner från behandlade och obehandlade E. coli-celler. Jämfört med befintliga protokoll för proteinaggregatisolering fråncellerna 14,15,16,<sup class="xref"...

Bakterier utsätts oundvikligen för en myriad av miljöbelastningar, inklusive lågt pH-kort (t.ex. i däggdjursmagen)1,2,reaktivt syre och klorarter (ROS/RCS) (t.ex. under oxidativ bristning i fagocyter)3,4,5, förhöjda temperaturer (t.ex. i varma källor eller under värmechock)6,7och potenta antimikrobiella medel (t.ex. AGXX som används i detta protokoll)8. Proteiner är särskilt sårbara för någon av dessa stressfaktorer, och exponering kan prova protein som inte/felveckas som sedan frön aggregering. Alla organismer använder skyddssystem som gör det möjligt för dem att klara av protein felvecka9. Allvarlig stress kan dock överväldiga proteinkvalitetskontrollmaskineriet och störa proteinstrukturen och/eller tertiärstrukturen hos proteiner, vilket i slutändan inaktiverar proteiner. Som en följd av detta kan proteinaggregat allvarligt försämra kritiska cellulära funktioner som krävs för bakterietillväxt och överlevnad, stressresistens och virulens10. Därför är forskning med fokus på proteinaggregering och dess konsekvenser i bakterier ett relevant ämne på grund av dess potentiella inverkan på infektionssjukdomsbekämpning.
Värmeinducerat protein som utvecklas och aggregering är ofta reversibla7. Däremot kan andra proteotoxiska påfrestningar, såsom oxidativ stress, orsaka irreversibla proteinmodifieringar genom oxidation av specifika aminosyra sidokedjor som resulterar i protein un-/felfolding och så småningom proteinaggregering4. Stressinducerad bildning av olösliga proteinaggregat har studerats utförligt i samband med molekylära förkläde och deras skyddande funktioner i jäst och bakterier11,12,13. Flera protokoll har publicerats som använder en mängd biokemiska tekniker för isolering och analys av olösliga proteinaggregat14,15,16,17. De befintliga protokollen har huvudsakligen använts för att studera bakteriell proteinaggregering vid värmechock och/eller identifiering av molekylära förkläde. Även om dessa protokoll verkligen har varit ett framsteg på fältet, finns det några stora olägenheter i de experimentella förfarandena eftersom de kräver (i) en stor bakteriekulturell volym på upp till 10 L14,17, (ii) komplicerade fysiska störningsprocesser, inklusive användning av cellstörare, fransk press och / eller ultraljudsbehandling14,15,17eller iii) tidskrävande upprepade tvätt- och inkubationssteg15,16,17.
Detta dokument beskriver ett modifierat protokoll som syftar till att ta itu med begränsningarna i tidigare metoder och möjliggör analys av mängden proteinaggregat som bildas i två olika Escherichia coli-stammar efter behandling med en proteotoxisk antimikrobiell ytbeläggning. Beläggningen består av metall-silver (Ag) och ruthenium (Ru)-konditionerad med askorbinsyra, och dess antimikrobiella aktivitet uppnås genom generering av reaktiva syrearter8,18. Häri är en detaljerad beskrivning av beredningen av bakteriekulturen efter behandling med den antimikrobiella föreningen och en jämförelse av proteinaggregeringsstatus vid exponering av två E. coli-stammar med distinkta känslighetsprofiler för att öka koncentrationen av antimikrobiell. Den beskrivna metoden är billig, snabb och reproducerbar och kan användas för att studera proteinaggregering i närvaro av andra proteotoxiska föreningar. Dessutom kan protokollet modifieras för att analysera den inverkan som specifika genborttagningar har på proteinaggregering i en mängd olika bakterier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals/Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>P008-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>B-092-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>821616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBT9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>G-630-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402893-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3522-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>L-040-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T9281-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Trichloroacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>JABG-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (125 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (500 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer: -80 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1107-9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z216MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Axygen Maxiclear Microtubes</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-377-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>RS7235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer plates (1 mm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>3339053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor

Exponeringen av levande organismer för miljömässiga och cellulära påfrestningar orsakar ofta störningar i proteinhomeostas och kan leda till proteinaggregering. Ackumulering av proteinaggregat i bakterieceller kan leda till betydande förändringar i det cellulära fenotypiska beteendet, inklusive en minskning av tillväxthastigheter, stressresistens och virulens. Flera experimentella förfaranden finns för undersökning av dessa stressor-medierade fenotyper. Detta dokument beskriver en optimerad analys för extraktion och visualisering av aggregerade och lösliga proteiner från olika Escherichia coli stammar efter behandling med en silver-ruthenium-innehållande antimikrobiell. Denna förening är känd för att generera reaktiva syrearter och orsakar utbredd proteinaggregering. 
Metoden kombinerar en centrifugeringsbaserad separation av proteinaggregat och lösliga proteiner från behandlade och obehandlade celler med efterföljande separation och visualisering genom natriumdidcylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och Coomassie färgning. Detta tillvägagångssätt är enkelt, snabbt och möjliggör en kvalitativ jämförelse av proteinaggregatbildning i olika E. coli-stammar. Metoden har ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive möjligheten att undersöka effekten av andra proteotoxiska antimikrobiella medel på in vivo-proteinaggregering i ett brett spektrum av bakterier. Dessutom kan protokollet användas för att identifiera gener som bidrar till ökad resistens mot proteotoxiska ämnen. Gelband kan användas för efterföljande identifiering av proteiner som är särskilt benägna att aggregering.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> Figur 6: Representativa resultat av antimikrobiell inducerad proteinaggregering i kommensala Escherichia coli-stammar MG1655 och UPEC-stam CFT073. E. coli-stammarna MG1655 och CFT073 odlades vid 37 °C och 300 varv/min till OD600= 0, 5– 0,55 i MOPS- g-media innan de behandlades med de angivna koncentrationerna (-, 0 mg/ml; +, 17...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Detta protokoll beskriver extraktion och visualisering av aggregerade och lösliga proteiner från Escherichia coli efter behandling med en proteotoxisk antimikrobiell. Enligt detta förfarande möjliggör en kvalitativ jämförelse av proteinaggregatbildning in vivo i olika bakteriestammar och/eller mellan behandlingar.

Extraktion och visualisering av proteinaggregat efter behandling av Escherichia coli med proteotoxisk stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Exponering för stress kan orsaka proteinaggregering och resultera i betydande förändringar i bakteriernas fenotypiska beteende. Förfarandet som beskrivs i denna video tillåter extraktion och visualisering av proteinaggregat efter stressbehandling. I motsats till andra publicerade förfaranden kräver detta protokoll lägre cellnummer och avstår från komplicerade fysiska störningsprocesser, liksom tidskrävande tvätt- och inkubationssteg.Detta protokoll kan användas för att studera proteinaggregering i en mängd gramnegativa och grampositiva bakterier. Du kan också analysera effekten av genborttagningar eller jämföra effekten av proteotoxiska föreningar. Börja med att inokulera en enda koloni av E.coli-stammen MG1655 och den uropatiska E.coli-stammen CFT073, var och en i fem milliliter lysogenbuljong, eller LB, medium.Inkubera de två buljongkulturerna vid 37 grader Celsius och 300 varv/min i 14 till 16 timmar. Späd varje stam till en optisk densitet vid 600 nanometer, eller OD600, på 0,1 till en 500 milliliter kolv som innehåller 70 milliliter MOPS-g medium. Inkubera kolvarna vid 37 grader och 300 varv/min tills mittloggfasen har uppnåtts.Efter inkubation, överför 20 milliliter av varje kultur till tre förvärmda 125-milliliterkolvar och inkubera dem vid 37 grader Celsius och 300 varv/min i två minuter. Bered en två milligram per milliliter antimikrobiell föreningslösning i MOPS-g medium. Tillsätt denna lösning till varje kultur för att nå önskade koncentrationer och tillsätt den önskade volymen MOPS-g-medium för den obehandlade kontrollen.Bestäm OD600 för varje kultur efter 45 minuters stressbehandling. För varje prov, alikvot fyra milliliter kultur med en OD600 av en i 15-milliliter centrifuger. Återanvänd cellpelletsen i 50 mikroliter iskyl lysbuffert.Inkubera proverna i 30 minuter på is. Tillsätt 360 mikroliter iskall buffert A till proverna och blanda försiktigt genom pipetting. Överför proverna till två milliliter mikrocentrifugrör med cirka 200 mikroliter med 0,5 millimeters glaspärlor.Inkubera rören i 30 minuter vid åtta grader Celsius i en ThermoMixer med skakningar vid 1400 varv/min. Inkubera rören på is i fem minuter utan att skaka för att lösa glaspärlorna. Överför sedan 200 mikroliter av celllysatet till 1,7 milliliter mikrocentrifugrör.Centrifugera celllysatet i 20 minuter vid 16 000 gånger g och fyra grader Celsius. Samla supernatanten, som kommer att användas som det lösliga proteinprovet senare. Använd en pipett för att återanvända pelleten i 200 mikroliter iskylbuffert A.Centrifuge av rören vid 16 000 gånger g och fyra grader Celsius i 20 minuter.Ta sedan försiktigt bort supernaten helt och hållet. Använd en pipett för att försiktigt återanvända pelleten i 200 mikroliter iskylbuffert B.Centrifuge rören igen och ta försiktigt bort supernaten. Upprepa sedan tvätten med buffert A.Resuspend pelleten i 100 mikroliter 1x reducerande SDS provbuffert och koka den i fem minuter i en ThermoMixer vid 95 grader Celsius.Blanda en volym på 100%TCA med fyra volymer av det lösliga proteinprovet som samlats in tidigare och inkubera i 10 minuter vid fyra grader Celsius för proteinutfällning. Centrifugera provet vid 21 000 gånger g och fyra grader Celsius i fem minuter för att erhålla fällningen och ta bort supernaten. Använd 200 mikroliter iskallt aceton för att tvätta pelleten för att avlägsna cellulärt skräp.Centrifugera provet igen för att erhålla fällningen och ta bort supernaten. För att ta bort de återstående acetonerna från pelletsen, håll mikrocentrifugrören i ThermoMixer på 37 grader Celsius med locken öppna. Tillsätt sedan 100 mikroliter 1x reducerande SDS-buffert för att helt lösa upp pelleten och koka provet vid 95 grader Celsius i fem minuter.Ladda omedelbart provet på en SDS-polyakrylamidgel för separation, eller förvara provet vid minus 20 grader Celsius för att fortsätta senare. Förbered två skiljemangeler enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Häll gelén mellan glasplattorna med en en milliliter pipett, se till att de övre två centimeterna är fria från blandningen.Tillsätt 70 % etanol ovanpå avskiljgelen, vilket skapar ett jämnt gränssnitt mellan de två lagren. När de separerande gelerna har polymeriserats, förbered staplingsgelerna med hjälp av instruktioner i textmanuskriptet. Ta sedan bort etanolen från separerande geler och tillsätt staplingsgellösningen.Sätt försiktigt in en kam med önskat antal fickor utan att införa luftbubblor och låt gelén polymerisera i 20 till 30 minuter. Ladda fyra mikroliter av varje prov, liksom proteinstegen, i separata brunnar. Kör sedan gelén i tris-glycinkörningsbuffert vid 144 volt i 45 minuter vid rumstemperatur.Använd förvärmd Fairbanks-lösning A för att färga gelerna på en rocker i 30 minuter och förvärmd Fairbanks-lösning D för att avfärga gelerna på en vipp tills önskad bakgrund uppnås. En ökning observerades i mängden proteinaggregat som bildades när cellerna behandlades med 175 mikrogram per milliliter och 200 mikrogram per milliliter av det antimikrobiella, jämfört med obehandlade celler. Ökningen av den olösliga proteinfraktionen var mer uttalad i den känsligare MG1655-stammen.En minskning observerades i mängden lösliga proteiner när celler behandlades med 175 mikrogram per milliliter och 200 mikrogram per milliliter av de antimikrobiella, jämfört med obehandlade celler. När du försöker detta protokoll, kom ihåg att normalisering till den optiska densiteten vid 600 nanometer är viktigt för jämförelse av omfattningen av proteinaggregering i proverna.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Riktad Protein Förpackning inom yttre membranvesiklar från<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produktion och rening

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detektering av den pH-beroende aktivitet för<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; och<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detektion och visualisering av DNA-skada-inducerad proteinkomplex i suspensionscellkulturer med användning av Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Anrikning av tvättmedel-olösligt Protein aggregat från människahjärnan efter döden

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantifiering av överflödet och laddning nivåer av överföring RNAs i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Storskalig produktion av rekombinant RNAs på en cirkulär byggnadsställning Viroid-härledda System med i Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Webbplats riktad mutagenes för In Vitro och i Vivo experiment exemplifieras med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisera enskilda protein aggregat med infraröd Nanospektroskopi och atomkraft mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Platsspecifik lysin acetylering av histoner för nukleosomkonstitution med hjälp av genetisk kodexpansion i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...