Name: portal vein injection of colorectal cancer organoids to study the liver metastasis stroma
Uploaded: 2021-09-03T13:45:00
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这项研究得到了国家卫生和医学研究委员会（APP1156391至D.L.W.，S.L.W.）的资助。（APP1081852 到 D.L.W.， APP1140236 到 S.L.W.， APP1099283 到 D.L.W.，）;癌症委员会SA击败癌症项目代表其捐助者和南澳大利亚州政府通过卫生部（MCF0418至S.L.W.，D.L.W.）;a 由日本文部科学省委托的科学研究补助金（B）（20H03467给M.T.）;AMED-CREST（日本医学研究开发厅，进化科学技术核心研究（19gm0810007h0104和19gm1210008s0101至A.E.）;癌症研究与治疗进化项目（P-CREATE）从AMED（19cm0106332h0002到A.E.）;日本科学促进会海外青年研究人员挑战计划（香港），武田科学财团奖学金（香港），大通国际博士奖学金（香港），狮子会医学研究基金会奖学金（K.G.）。
我们感谢儿童医学研究所（CMRI）（澳大利亚新南威尔士州）矢量和基因组工程设施（VGEF）的Leszek Lisowski博士生产重组AAV载体。

本文中的所有动物程序均由南澳大利亚州健康和医学研究所动物伦理委员会（批准号，SAM322）审查和批准。
1. 尾静脉注射腺相关病毒
注：腺相关病毒（AAV）应根据生物安全1级指南作为生物危害处理。请参阅已发布的 AAV 制备、纯化和滴定方案33。肝细胞 - 热带AAV，AAV834，编码巨细胞病毒（CMV）启动子Islr 基因，用?...

在这项研究中，我们已经表明，门静脉注射小鼠CRC类器官可重复地产生富含成纤维细胞的肝脏转移，其类似于人CRC肝转移的组织学特征。此外，当与基质靶向治疗（如AAV8介导的基因治疗）结合使用时，该临床前模型可作为评估对小鼠生存和肿瘤生长的治疗效果的有用工具。
协议中至少有两个关键步骤。首先，重要的是通过完全胰蛋白酶消化类器官并使用网状过滤器去除细胞?...

结直肠癌（CRC）是全球癌症死亡的主要原因1.超过一半的CRC患者发生肝转移，通过门静脉播散1发生。目前，尚无有效的治疗方法可以治愈晚期肝转移，大多数患者死于转移性疾病。
转移性生态位或肿瘤微环境在播散性CRC细胞的移植和生长中起关键作用2。癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境的重要成分，通过分泌生长因子，重塑细胞外基质（ECM）以及调节免疫景观和血管生成来促进或抑制癌症进展3，4，5。CAFs还赋予化疗和免疫疗法耐药性3。此外，CAF 调节结直肠癌肝转移的开始和进展，并预测结直肠癌3、6、7、8 患者的预后。因此，CAF相关因子可用于开发抑制CRC肝转移的治疗策略。然而，缺乏令人满意的小鼠模型来研究转移性肿瘤基质一直是开发基质靶向疗法的主要障碍。
目前，研究CRC肝转移的动物模型包括自发发生肝转移的原发性CRC模型和癌细胞移植到肝脏的模型。原代CRC小鼠模型，如基因工程小鼠模型和癌细胞结肠注射，很少显示向肝脏转移9，10，11，12。此外，即使观察到肝转移，这些模型也显示出从原发性肿瘤诱导到转移的长潜伏期，并且可能死于原发性肿瘤负担12。为了有效地产生CRC肝转移，使用三种注射方法将培养的CRC细胞移植到肝脏中：脾内注射，直接在实质内注射到肝脏和门静脉注射。脾内注射癌细胞扩散到脾静脉，门静脉，并最终扩散到肝脏13，14。然而，与其他移植模型相比，脾内注射产生的肿瘤摄取率较低15，16。通过脾内注射，进行脾脏手术切除以避免脾脏中的癌症生长，这可能潜在地损害免疫细胞成熟17。此外，脾内注射也会导致脾脏和腹腔18中意外的肿瘤生长，使肝转移分析复杂化。直接在实质内注射到肝脏中有效诱导肝转移16，19，20。然而，这种方法并不能完全概括通过门静脉播散自然发生的肝转移的生物学步骤。使用直接注射到肝脏，癌细胞进入非门户，但体循环也可导致多个大的肺转移16。虽然大多数CRC肝转移患者在肝脏中显示多个肿瘤结节21，但直接注射到特定的肝叶中会产生单个肿瘤肿块19，20。门静脉注射或肠系膜静脉注射虽然在技术上具有挑战性，但允许肿瘤细胞以一种概括患者生长模式的方式有效地将肿瘤细胞递送到肝脏中17.该策略可以最大限度地减少继发部位转移的可能性，并使肝脏中癌细胞的快速生长，简化小鼠存活分析。
从历史上看，使用小鼠MC-38，人HT-29和SW-620等结直肠癌细胞系来生成肝脏转移的小鼠模型22，23。然而，这些结直肠癌细胞系不会诱导促成膜基质反应。肿瘤中的低基质含量使得难以研究癌症相关成纤维细胞的生物学作用。CRC类器官及其移植的最新进展为评估基质在癌症进展中的重要作用提供了有用的平台24。CRC类器官的肝移植产生富含成纤维细胞的肿瘤微环境，并为基质研究提供了新的见解6，25。目前，门静脉或肠系膜静脉注射类器官已成为产生CRC肝转移的金标准方法6，25，26，27，28。尽管如此，据我们所知，以前的论文都没有描述结肠直肠类肿瘤门静脉注射的详细方法。在这里，我们提出了一种使用CRC类器官的门静脉注射来开发新型腺相关病毒（AAV）介导的基质导向疗法的方法。
肝细胞是肝脏转移性肿瘤微环境的重要组成部分，在转移性癌症进展中起关键作用29。受AAV基因治疗方法在非肿瘤患者30，31中诱导肝细胞中蛋白质表达的成功启发，我们研究了类似的方法，但旨在改变CRC25中的肝肿瘤微环境。因此，我们还在本文中描述了尾静脉注射AAV8以诱导抗肿瘤蛋白的表达以修饰肝脏肿瘤的微环境。AAV8血清型，通过在病毒产生过程中选择病毒衣壳蛋白来指定，导致肝细胞特异性的高转导效率（即，肝肿瘤微环境中的靶向基因表达）32。我们之前已经证明Islr（含有富含亮氨酸的免疫球蛋白超家族重复序列）是一种CAF特异性基因，可诱导骨形态发生蛋白（BMP）信号传导，减少CRC类瘤生长，并促进LGR5 +肠道干细胞分化25。我们测试了AAV8介导的肝细胞中抑制癌基质基因Islr的过表达是否可以通过在AAV8-Islr处理的小鼠中进行CRC类肿瘤的门静脉注射来减弱肝转移进展。
在本文中，我们首先描述了肝热带AAV的尾静脉注射程序。然后，我们描述了一种用于拟肿瘤细胞制备和门静脉注射到AAV处理的小鼠中的方法。最后，我们提出了监测转移性肿瘤进展的方法，以评估基质靶向治疗的疗效。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle</td>
			<td>TSK</td>
			<td>LDS-33013</td>
			<td>For portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 vicryl suture</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>J494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40-&#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302130</td>
			<td>Used to apply saline to the intestine after portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS*50LE</td>
			<td>Luer lock syringe for perfusion fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Isopropyl alcohol wipe</td>
			<td>Briemar</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia machine</td>
			<td>Darvall</td>
			<td>9356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0851</td>
			<td>Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>TROY</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ilium Temvet Injection, 300 &#181;g/ml Buprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Johnson&#39;s pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>HAMILTON</td>
			<td>81020</td>
			<td>For portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat box (animal warming chamber)</td>
			<td>Datesand</td>
			<td>MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic sponge</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0891-04-015</td>
			<td>Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>Talens</td>
			<td>44727000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe and needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>326769</td>
			<td>For tail vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islr probe (RNAscope)</td>
			<td>ACD</td>
			<td>450041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>988-3244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI fibrosis tool</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope kit</td>
			<td>ACD</td>
			<td>322300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-Cas9 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>024858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>PHA19042010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin staplers</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59028</td>
			<td>9 mm wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler applicator</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59026</td>
			<td>9 mm wound clip applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler remover</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59037</td>
			<td>Wound clip remover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Multigate</td>
			<td>29-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>Sentry Medical</td>
			<td>GS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical anesthesia cream</td>
			<td>EMLA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605028</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

portal vein injection of colorectal cancer organoids to study the liver metastasis stroma

结直肠癌（CRC）的肝转移是癌症相关死亡的主要原因。癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境的主要组成部分，在转移性CRC进展中起着至关重要的作用，并预测患者预后不良。然而，缺乏令人满意的小鼠模型来研究转移性癌细胞和CAFs之间的串扰。在这里，我们提出了一种方法来研究肝转移进展如何受到转移位的调节，并且可能通过基质定向治疗来抑制。门静脉注射CRC类器官产生促肾上腺皮质反应，忠实地概括了人CRC肝转移的富含成纤维细胞的组织学。与脾内注射模型相比，该模型是组织特异性的，肝脏中的肿瘤负荷更高，简化了小鼠生存分析。通过注射表达荧光素酶的肿瘤类器官，可以通过 体内 成像监测肿瘤生长动力学。此外，这种临床前模型为评估靶向肿瘤间充质的治疗效果提供了一个有用的平台。我们描述了检查腺相关病毒介导的肿瘤抑制基质基因递送到肝细胞的方法是否可以重塑肿瘤微环境并提高小鼠存活率。这种方法能够开发和评估新的治疗策略，以抑制CRC的肝转移。

为了在肝细胞中诱导AAV介导的肿瘤抑制基质基因Islr4，25，43，44的过表达，我们静脉注射编码AAV8的Islr。将AAV8-Islr的1.0×10 11病毒基因组（vg）或作为对照，AAV8-mRuby2注射到成年小鼠尾静脉中（图1A）。尾静脉注射两周后，收获肝脏以验证Islr</em...

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Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

门静脉注射结直肠癌 （CRC） 类器官可产生富含基质的肝转移。这种CRC肝转移的小鼠模型代表了研究肿瘤 - 基质相互作用和开发新型基质导向疗法（如腺相关病毒介导的基因疗法）的有用工具。

门静脉注射结直肠癌类器官研究肝转移基质

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...

超过50%的结直肠癌患者通过门静脉播散发生肝转移。目前研究结直肠癌肝转移的动物模型仍然不足以概括生物学过程。门静脉注射结直肠癌类肿瘤提供了一个富含成纤维细胞的肿瘤环境，可以研究结直肠癌肝转移中转移癌细胞和CAS之间的串扰。该技术为评估针对结直肠癌肝转移的肿瘤微环境的治疗策略的疗效提供了平台。该方法对于研究CAS，肿瘤细胞和肿瘤微环境之间的相互作用特别有用。如果棉头未正确放置在注射部位，取出针头后可能会发生过度出血。一旦找到注射部位，棉花尖端的浸泡就停止了。如果没有该过程的视觉演示，识别门静脉和可视化注射部位可能很困难。首先，使用加热垫上的无菌窗帘准备无菌手术区域。此外，按照文本手稿中所述准备手术所需的所有器械。然后通过调整光源的位置来照亮手术区域。接下来，皮下注射每公斤体重0.1毫克的丁丙诺啡到小鼠中进行手术疼痛管理。然后麻醉小鼠并使用电动剃须刀，在远离无菌手术区域的区域剃除中腹部至上腹部，以避免头发污染该部位。清洁切口部位，交替使用Betadine和80%乙醇对手术区域进行灭菌。重复三次。将小鼠置于加热垫上的手术区域，以仰卧姿势进行异氟醚麻醉维持。然后在腹部放置一个带有孔的手术垂坠。用镊子抬起腹部皮肤，用剪刀在中线做一个两到三厘米的皮肤切口，只切开皮肤，确保切口的范围从中腹部到胸骨的xiphoid过程，而不是高于xiphoid过程的下端。然后用镊子完全抬起腹膜壁，并用剪刀在腹膜上做一个类似的两到三厘米的切口。避免切开肠道和隔膜。接下来，用温盐水浸泡手术纱布，并将其放在外科医生右侧切口旁边。使用浸泡有盐水的棉签轻轻地将小肠和大肠拉出，并将它们放在浸泡过盐水的纱布上。用额外的湿纱布覆盖肠道，以保持肠道湿润。接下来，用湿纱布轻轻地将肠道拉到外科医生的右侧。然后施加轻柔的张力来观察门静脉。如果门静脉的可视化很困难，用湿棉签轻轻调整胃的位置。在将类瘤悬浮液轻轻管道数次以获得均匀的细胞悬浮液后，将100微升细胞悬浮液吸入连接到33号针头上的Hamilton或一毫升注射器中，避免气泡。缓慢地将针斜面向上插入门静脉，插入深度为三到四毫米，针角几乎平行于门静脉。在30秒内缓慢注射肿瘤细胞，以防止门静脉阻塞。肝脏的颜色暂时从红色变为白色。注射后，慢慢取下针头，立即用干燥的棉签对注射部位施加轻柔的压力五分钟。取下棉签，立即将止血海绵涂抹在注射部位。用棉签或镊子握住海绵，再轻轻按压五分钟。五分钟后，取出止血海绵的压力，并确认注射部位没有出血。如果发生出血，立即用棉签进行压力止血约10分钟。然后再使用一块止血海绵，再涂抹五分钟。确认没有出血后，取下肠道上的手术纱布。然后使用装有五毫升盐水的注射器，将盐水喷射到肠道以防止器官粘连。轻轻地将肠道放回腹腔内，并使用4-0个多乳素缝合线缝合腹膜。然后用镊子抬起皮肤的两侧，使用皮肤吻合器关闭皮肤切口，小心不要钉住肠道。关闭异氟醚，但保持氧气流动。仔细监视鼠标。当鼠标醒来时，把它放在加热垫上的空笼子里。监视鼠标，直到它有意识并正常行走。手术后四小时，皮下注射每公斤丁丙诺啡0.1毫克。每天仔细监测小鼠一周，检查缝合线和伤口愈合。手术后7至10天，使用订书机去除器去除皮肤吻合器。尾静脉AAV-8 Islr注射后两周的RNA原位杂交显示Islr在肝脏中过表达。注射AAV mRuby2两周后，将结肠癌类器官的单细胞悬浮液注射到小鼠门静脉中。从宏观上看，这种门静脉注射导致肝脏中出现多个白色肿瘤结节。由门静脉注射诱导的结直肠癌肝转移的苏木精和曙红染色显示，中度分化肾小管腺癌伴有增生性基质反应和坏死的组织病理学。这种富含基质的组织学忠实地概括了人结直肠癌肝转移，使该模型适用于研究转移性肿瘤基质的转化研究。α平滑肌肌动蛋白的免疫组织化学证实了癌症相关成纤维细胞的存在，而Picro-Sirius红染色在肿瘤间充质中显示出丰富的细胞外基质。EPCAM的免疫化学研究显示，转移性结直肠癌表现为肿瘤萌芽，这是结直肠癌预后不良的一个特征。Ki67标记指数约为80%，表明大多数肿瘤细胞具有有丝分裂活性。小鼠在将类瘤注射到门静脉后显示出57天的中位生存期。AAV-8 Islr处理的小鼠显示出小鼠存活率的改善，肿瘤的体内成像信号减少，骨形态发生蛋白信号传导增强，Ki67增殖细胞减少。确保将棉尖涂在正确的注射部位，并且仅在出血停止后才施用止血海绵。可以使用IVIS成像监测肿瘤的建立，以确保肿瘤细胞在肝脏内生长。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

肝大肠癌转移的高级动物模型：成像技术和转移性克隆性质

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

科研

癌症研究

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

门静脉注射模型来研究肝转移乳腺癌

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Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

颈动脉肿瘤细胞注射，产生脑转移瘤小鼠模型

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Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

脱细胞和细胞肺模型研究肿瘤转移

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

结合使用尾静脉转移分析与实时 Vivo 成像，以量化乳腺癌转移殖民化和肺负担

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

肿瘤细胞外侧尾静脉注射后肺转移的病理分析

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

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肝癌的仿生模型，用于研究具有可调生物物理特性的3D环境中的肿瘤-斯特罗马相互作用

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Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

研究癌症转移至肺部的永久窗口

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

胫骨肉瘤细胞注射生成原位骨肉瘤和肺转移小鼠模型

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...