Name: portal vein injection of colorectal cancer organoids to study the liver metastasis stroma
Uploaded: 2021-09-03T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Health and Medical Research Council (APP1156391 aan D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 naar D.L.W., APP1140236 naar S.L.W., APP1099283 naar D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project namens zijn donoren en de staatsregering van Zuid-Australië via het ministerie van Volksgezondheid (MCF0418 tot S.L.W., D.L.W.); een grant-in-aid voor wetenschappelijk onderzoek (B) (20H03467 aan M.T.) in opdracht van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan; AMED-CREST (Japan Agency for Medical Research and Development, Core Research for Evolutional Science and Technology (19gm0810007h0104 en 19gm1210008s0101 to A.E.); het Project for Cancer Research and Therapeutic Evolution (P-CREATE) van AMED (19cm0106332h0002 tot A.E.); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (to H.K.), Takeda Science Foundation Fellowship (to H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (to H.K.), Lions Medical Research Foundation Scholarship (to K.G.).
We bedanken Dr. Leszek Lisowski van Vector and Genome Engineering Facility (VGEF), Children's Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIË) voor het produceren van recombinante AAV-vectoren.

Alle dierprocedures in dit artikel zijn beoordeeld en goedgekeurd door de South Australian Health and Medical Research Institute Animal Ethics Committee (goedkeuringsnummer, SAM322).
1. Staartader injectie van adeno-geassocieerd virus
OPMERKING: Adeno-geassocieerd virus (AAV) moet worden behandeld als een biorisico volgens de richtlijnen van bioveiligheidsniveau 1. Raadpleeg het gepubliceerde protocol voor AAV-bereiding, -zuivering en -titratie33</su...

In deze studie hebben we aangetoond dat poortaderinjectie van CRC-organoïden van muizen reproduceerbaar fibroblastrijke levermetastasen genereert die histologische kenmerken van menselijke CRC-levermetastasen nabootsen. Bovendien, in combinatie met stroma-gerichte therapieën zoals AAV8-gemedieerde gentherapie, dient dit preklinische model als een nuttig hulpmiddel om therapeutische effecten op de overleving van muizen en tumorgroei te beoordelen.
Er zijn in ieder geval twee cruciale stappen ...

Colorectale kanker (CRC) is wereldwijd een belangrijke oorzaak van kankersterfte1. Meer dan de helft van de CRC-patiënten ontwikkelt levermetastase die optreedt via de poortaderverspreiding1. Momenteel zijn er geen effectieve therapieën die geavanceerde levermetastasen kunnen genezen en de meeste patiënten bezwijken aan gemetastaseerde ziekte.
De gemetastaseerde niche of tumormicro-omgeving speelt een sleutelrol bij de engraftment en groei van gedissemineerde CRC-cellen2. Kankergeassocieerde fibroblasten (CAFs), een prominent onderdeel van de tumormicro-omgeving, bevorderen of beperken de progressie van kanker door groeifactoren af te scheiden, de extracellulaire matrix (ECM) te hermodelleren en immuunlandschappen en angiogenese te moduleren 3,4,5. CAFs verlenen ook resistentie tegen chemotherapieën en immunotherapieën3. Bovendien reguleren CAFs de initiatie en progressie van CRC-levermetastase en voorspellen ze de prognose bij patiënten met CRC 3,6,7,8. CAF-gerelateerde factoren kunnen dus worden gebruikt voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën om CRC-levermetastasen te remmen. Het gebrek aan bevredigende muismodellen om het gemetastaseerde tumorstroma te bestuderen, is echter een groot obstakel geweest voor het ontwikkelen van stroma-gerichte therapieën.
Momenteel omvatten diermodellen om CRC-levermetastasen te bestuderen primaire CRC-modellen die spontaan levermetastase en kankerceltransplantatiemodellen in de lever ontwikkelen. Primaire CRC-muismodellen, zoals genetisch gemanipuleerde muismodellen en coloninjectie van kankercellen, tonen zelden metastase aan de lever 9,10,11,12. Bovendien, zelfs als een levermetastase wordt waargenomen, vertonen deze modellen een lange latentie van de primaire tumorinductie tot metastase en sterven ze mogelijk aan primaire tumorlast12. Om efficiënt CRC-levermetastasen te genereren, worden gekweekte CRC-cellen in de lever getransplanteerd met behulp van drie injectiebenaderingen: intra-miltinjectie, directe intra-parenchymale injectie in de lever en poortaderinjectie. Intra-splenisch geïnjecteerde kankercellen verspreidden zich in de miltader, de poortader en uiteindelijk naar de lever13,14. De intra-miltinjectie levert echter een lagere tumoropnameratio op in vergelijking met andere transplantatiemodellen15,16. Met intra-miltinjectie wordt chirurgische verwijdering van de milt uitgevoerd om kankergroei in de milt te voorkomen, wat mogelijk de rijping van immuuncellen in gevaar kan brengen17. Bovendien kan intra-miltinjectie ook leiden tot onbedoelde tumorgroei in de milt en buikholte18, wat levermetastaseanalyses bemoeilijkt. Directe intra-parenchymale injectie in de lever induceert efficiënt levermetastase 16,19,20. Niettemin vat deze benadering een biologische stap van levermetastase die van nature voorkomt via verspreiding van poortaders niet volledig samen. Met behulp van directe injectie in de lever, het binnendringen van kankercellen in een niet-portale, maar systemische circulatie kan ook resulteren in meerdere grote longmetastasen16. Hoewel een meerderheid van de patiënten met CRC-levermetastase meerdere tumorknobbels in de leververtoont 21, genereert directe injectie in een specifieke leverkwab een enkele tumormassa19,20. Portale aderinjectie of mesenteriale aderinjectie, hoewel technisch uitdagend, maakt efficiënte afgifte van tumorcellen in de lever mogelijk op een manier die de groeipatronen bij patiëntenvan 17 samenvat. Deze strategie kan de mogelijkheid van secundaire metastasen minimaliseren en maakt een snelle groei van kankercellen in de lever mogelijk, waardoor de overlevingsanalyses van muizen worden vereenvoudigd.
Historisch gezien werden colorectale kankercellijnen zoals muis MC-38, humaan HT-29 en SW-620 gebruikt om muismodellen van levermetastase te genereren22,23. Deze colorectale kankercellijnen induceren echter geen desmoplastische stromale reactie. Een laag stromaal gehalte in de tumoren maakt het moeilijk om de biologische rollen van kanker-geassocieerde fibroblasten te onderzoeken. Recente ontwikkelingen in CRC-organoïden en hun transplantatie hebben nuttige platforms geboden om de vitale rollen van het stroma in de progressie van kanker te beoordelen24. Levertransplantatie van CRC-organoïden genereert een fibroblastrijke tumormicro-omgeving en heeft nieuwe inzichten opgeleverd in stromaal onderzoek 6,25. Momenteel is portale of mesenteriale aderinjectie van organoïden een gouden standaardbenadering geworden om CRC-levermetastase te genereren 6,25,26,27,28. Niettemin, voor zover wij weten, hebben geen eerdere artikelen gedetailleerde methoden beschreven voor de poortaderinjectie van colorectale tumoroïden. Hier presenteren we een methodologie voor het gebruik van portale aderininjectie van CRC-organoïden om nieuwe adeno-geassocieerde virus (AAV) -gemedieerde stroma-gerichte therapie te ontwikkelen.
Hepatocyten zijn een belangrijk bestanddeel van de gemetastaseerde tumormicro-omgeving in de lever en spelen een cruciale rol bij de progressie van gemetastaseerde kanker29. Geïnspireerd door het succes van AAV-gentherapiebenaderingen om eiwitexpressie in hepatocyten te induceren bij niet-neoplastische patiënten30,31, onderzochten we een vergelijkbare aanpak, maar gericht op het wijzigen van de micro-omgeving van de levertumor in CRC25. Als zodanig beschrijven we hierin ook de staartaderinjectie van AAV8 om expressie van anti-tumorogene eiwitten te induceren om de micro-omgeving van de levertumor te wijzigen. Het AAV8-serotype, aangeduid door de keuze van virale capsid-eiwit tijdens de virusproductie, leidt tot een hoge transductie-efficiëntie, met name van hepatocyten (d.w.z. gerichte genexpressie in de micro-omgeving van de levertumor)32. We hebben eerder aangetoond dat Islr (immunoglobuline superfamilie met leucine-rijke herhaling) een CAF-specifiek gen is dat botmorfogenetisch eiwit (BMP) signalering induceert, CRC tumoroïde groei vermindert en Lgr5 + intestinale stamceldifferentiatiebevordert 25. We testten of AAV8-gemedieerde overexpressie van het kankerbeperkende stromale gen, Islr, in hepatocyten de progressie van levermetastase kon verzwakken door portale aderininjectie van CRC-tumoroïden uit te voeren in met AAV8-Islr behandelde muizen.
In dit artikel beschrijven we eerst de staartaderinjectieprocedure van levertropeskeer AAV. Vervolgens beschrijven we een methode voor tumoroïde celvoorbereiding en poortaderinjectie in de met AAV behandelde muizen. Ten slotte presenteren we benaderingen om de progressie van gemetastaseerde tumoren te volgen om de werkzaamheid van stroma-gerichte therapieën te beoordelen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle</td>
			<td>TSK</td>
			<td>LDS-33013</td>
			<td>For portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 vicryl suture</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>J494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40-&#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302130</td>
			<td>Used to apply saline to the intestine after portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS*50LE</td>
			<td>Luer lock syringe for perfusion fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Isopropyl alcohol wipe</td>
			<td>Briemar</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia machine</td>
			<td>Darvall</td>
			<td>9356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0851</td>
			<td>Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>TROY</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ilium Temvet Injection, 300 &#181;g/ml Buprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Johnson&#39;s pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>HAMILTON</td>
			<td>81020</td>
			<td>For portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat box (animal warming chamber)</td>
			<td>Datesand</td>
			<td>MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic sponge</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0891-04-015</td>
			<td>Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>Talens</td>
			<td>44727000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe and needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>326769</td>
			<td>For tail vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islr probe (RNAscope)</td>
			<td>ACD</td>
			<td>450041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>988-3244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI fibrosis tool</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope kit</td>
			<td>ACD</td>
			<td>322300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-Cas9 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>024858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>PHA19042010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin staplers</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59028</td>
			<td>9 mm wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler applicator</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59026</td>
			<td>9 mm wound clip applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler remover</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59037</td>
			<td>Wound clip remover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Multigate</td>
			<td>29-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>Sentry Medical</td>
			<td>GS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical anesthesia cream</td>
			<td>EMLA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605028</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

portal vein injection of colorectal cancer organoids to study the liver metastasis stroma

Levermetastase van colorectale kanker (CRC) is een belangrijke oorzaak van kankergerelateerde sterfte. Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs), een belangrijk onderdeel van de tumormicro-omgeving, spelen een cruciale rol bij gemetastaseerde CRC-progressie en voorspellen een slechte prognose van de patiënt. Er is echter een gebrek aan bevredigende muismodellen om de kruisverwijzing tussen gemetastaseerde kankercellen en CAFs te bestuderen. Hier presenteren we een methode om te onderzoeken hoe levermetastaseprogressie wordt gereguleerd door de metastatische niche en mogelijk kan worden beperkt door stroma-gerichte therapie. Poortaderinjectie van CRC-organoïden genereerde een desmoplastische reactie, die de fibroblastrijke histologie van menselijke CRC-levermetastasen getrouw samenvatte. Dit model was weefselspecifiek met een hogere tumorbelasting in de lever in vergelijking met een intra-miltinjectiemodel, waardoor overlevingsanalyses van muizen werden vereenvoudigd. Door luciferase-tot expressie brengende tumororganoïden te injecteren, kon de tumorgroeikinetiek worden gevolgd door in vivo beeldvorming. Bovendien biedt dit preklinische model een nuttig platform om de werkzaamheid van therapeutica gericht op het tumormes te beoordelen. We beschrijven methoden om te onderzoeken of adeno-geassocieerde virus-gemedieerde levering van een tumorremmend stromaal gen aan hepatocyten de tumormicro-omgeving zou kunnen hermodelleren en de overleving van muizen zou kunnen verbeteren. Deze aanpak maakt de ontwikkeling en beoordeling van nieuwe therapeutische strategieën mogelijk om levermetastase van CRC te remmen.

Om AAV-gemedieerde overexpressie van een tumor-remmend stromaal gen, Islr 4,25,43,44, in hepatocyten te induceren, injecteerden we intraveneus Islr-coderende AAV8. 1,0 x 1011 virale genomen (vg) van AAV8-Islr, of als controlemiddel, AAV8-mRuby2, werd geïnjecteerd in de volwassen muizenstaartader (figuur 1A). Twee weke...

Watch this Scientific Journal Video about Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma at JoVE.com

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Portale ader injectie van colorectale kanker (CRC) organoïden genereert stroma-rijke levermetastase. Dit muismodel van CRC-levermetastase vertegenwoordigt een nuttig hulpmiddel om tumor-stroma-interacties te bestuderen en nieuwe stroma-gerichte therapieën te ontwikkelen, zoals adeno-geassocieerde virus-gemedieerde gentherapieën.

Portale ader injectie van colorectale kanker organoïden om de levermetastase stroma te bestuderen

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...

Meer dan 50% van de colorectale kankerpatiënten ontwikkelt levermetastasen door middel van poortaderverspreiding. En de huidige diermodellen om colorectale kanker levermetastasen te bestuderen, blijven ontoereikend om het biologische proces samen te vatten. Portale aderin injectie van colorectale kanker tumoroïden biedt een fibroblast-rijke tumoromgeving die onderzoek mogelijk maakt van de kruisverwijzing tussen gemetastaseerde kankercellen en CAS bij colorectale kanker levermetastase.Deze techniek biedt een platform om de werkzaamheid te beoordelen van therapeutische strategieën gericht op de tumor micro-omgeving van colorectale kanker levermetastase. Deze methode is vooral nuttig voor het onderzoeken van interacties tussen CAS, tumorcellen en de tumormicro-omgeving. Als het wattenstaafje niet correct op de injectieplaats wordt geplaatst, kan overmatig bloeden optreden na het verwijderen van de naald.Het weken van de wattenstaaf stopt zodra de injectieplaats is gelokaliseerd. Het identificeren van de poortader en het visualiseren van de injectieplaats kan moeilijk zijn zonder visuele demonstratie van deze procedure. Bereid om te beginnen een aseptisch chirurgisch gebied voor met behulp van steriele gordijnen op een verwarmingskussen.Bereid bovendien alle instrumenten voor die nodig zijn voor een operatie zoals beschreven in het tekstmanuscript. Verlicht vervolgens het operatiegebied door de positie van de lichtbron aan te passen. Injecteer vervolgens subcutaan 0,1 milligram per kilogram lichaamsgewicht buprenorfine in een muis voor chirurgische pijnbestrijding.Verdoof vervolgens de muis en scheer met behulp van een elektrisch scheerapparaat het midden naar de bovenbuik in een gebied ver weg van het aseptische chirurgische gebied om te voorkomen dat het haar de site verontreinigt. Reinig de incisieplaats afwisselend met Betadine en 80% ethanol om het operatiegebied te steriliseren. Herhaal dit drie keer.Plaats de muis in het operatiegebied op een verwarmingskussen in rugligging met isofluraan anesthesie onderhoud. Plaats vervolgens een chirurgische drape met een gat over de buik. Til de buikhuid op met een tang en maak een huidincisie van twee tot drie centimeter aan de middellijn met een schaar, snijd alleen de huid en zorg ervoor dat de incisie varieert van het midden van de buik tot het xiphoid-proces van het borstbeen en niet boven het onderste uiteinde van het xiphoid-proces.Til vervolgens de peritoneale wand volledig op met een tang en maak een vergelijkbare incisie van twee tot drie centimeter in het peritoneum met een schaar. Vermijd het doorsnijden van de darm en het middenrif. Week vervolgens een chirurgisch gaas met warme zoutoplossing en plaats het naast de incisie aan de rechterkant van de chirurg.Trek de dunne en dikke darm er voorzichtig uit met een wattenstaafje gedrenkt in zoutoplossing en plaats ze op het met zoutoplossing doordrenkte gaas. Bedek de darmen met extra nat gaas om ze vochtig te houden. Trek vervolgens voorzichtig de darm naar rechts van de chirurg met het natte gaas.Pas vervolgens zachte spanning toe om de poortader te visualiseren. Als visualisatie van de poortader moeilijk is, pas dan voorzichtig de positie van de maag aan met een nat wattenstaafje. Nadat u de tumoroïde suspensie meerdere keren voorzichtig hebt geleid om een homogene celsuspensie te verkrijgen, zuigt u 100 microliter van de celsuspensie op in een Hamilton- of een milliliterspuit die is bevestigd aan een naald van 33 gauge, waarbij luchtbellen worden vermeden.Steek de naald langzaam omhoog in de poortader met een inbrengdiepte van drie tot vier millimeter en de naaldhoek bijna parallel aan de poortader. Injecteer de tumorcellen langzaam gedurende 30 seconden om occlusie van de poortader te voorkomen. De kleur van de lever verandert tijdelijk van rood naar wit.Verwijder na de injectie de naald langzaam en oefen onmiddellijk gedurende vijf minuten zachte druk uit op de injectieplaats met een droog wattenstaafje. Verwijder het wattenstaafje en breng onmiddellijk een hemostatische spons aan op de injectieplaats. Houd de spons vast met een wattenstaafje of tang en oefen nog vijf minuten zachte druk uit.Verwijder na vijf minuten de druk op de hemostatische spons en bevestig dat er geen bloeding van de injectieplaats is. Als er bloeding optreedt, voer dan onmiddellijk drukhemostase uit met een wattenstaafje gedurende ongeveer 10 minuten. Breng vervolgens nog vijf minuten een extra hemostatische spons aan.Nadat u hebt bevestigd dat er geen bloeding is, verwijdert u de chirurgische gaasjes op de darmen. Spuit vervolgens met behulp van een spuit gevuld met vijf milliliter zoutoplossing de zoutoplossing naar de darmen om orgaanaanhechting te voorkomen. Plaats de darmen voorzichtig terug in de buikholte en hecht het peritoneum met behulp van 4-0 polyglactine hechtingen.Til vervolgens beide zijden van de huid op met een tang, breng huidnietmachines aan om de huidincisie te sluiten, waarbij u voorzichtig bent om de darm niet te nieten. Schakel het isofluraan uit, maar houd de zuurstofstroom draaiende. Houd de muis zorgvuldig in de gaten.En wanneer de muis ontwaakt, plaats hem dan in een lege kooi op een verwarmingspad. Houd de muis in de gaten totdat deze bij bewustzijn is en normaal buigt. Vier uur na de operatie, subcutaan injecteren 0,1 milligram per kilogram buprenorfine.Controleer de muis dagelijks gedurende een week zorgvuldig, controleer de hechtingen en wondgenezing. Verwijder zeven tot 10 dagen na de operatie de huidnietmachines met behulp van een nietmachineverwijderaar. RNA in situ hybridisatie twee weken na staartader AAV-8 Islr injectie toonde overexpressie van Islr in de lever.Twee weken na de AAV mRuby2-injectie werden eencellige suspensies van darmkankerorganoïden geïnjecteerd in de muisportaalader. Macroscopisch resulteerde deze poortaderinjectie in meerdere witte tumorknobbels in de lever. Hematoxyline- en eosinekleuring van de hepatische metastasen van colorectale kanker geïnduceerd door de poortaderinjectie toonden histopathologie van matig gedifferentieerd tubulair adenocarcinoom vergezeld van een desmoplastische stromale reactie en necrose.Deze stromarijke histologie vatte getrouw die van menselijke colorectale kanker levermetastasen samen, waardoor dit model geschikt is voor translationeel onderzoek naar het gemetastaseerde tumorstroma. Immunohistochemie voor alfa-gladde spier actine bevestigde de aanwezigheid van kanker-geassocieerde fibroblasten, terwijl Picro-Sirius rode kleuring overvloedige extracellulaire matrix in het tumor mesenchym vertoonde. Immunochemie voor EPCAM onthulde dat de gemetastaseerde colorectale kanker tumorontluiking vertoonde, wat een kenmerk is van slechte prognose colorectale kanker.En de Ki67-etiketteringsindex was ongeveer 80%, wat aangeeft dat de meeste tumorcellen mitotisch actief zijn. De muizen vertoonden een mediane overleving van 57 dagen na tumoroïde injectie in de poortader. Met AAV-8 Islr behandelde muizen vertoonden een verbeterde overleving van muizen, verminderde in vivo beeldvormingssignalen van tumoren, verhoogde botmorfogenetische eiwitsignalering en verminderde Ki67 prolifererende cellen.Zorg ervoor dat het wattenstaafje op de juiste injectieplaats wordt aangebracht en dat de hemostatische spons pas wordt aangebracht nadat het bloeden is gestopt. Tumorvorming kan worden gecontroleerd met behulp van de IVIS-beeldvorming om ervoor te zorgen dat tumorcellen in de lever groeien.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: Imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Intracarotid Cancer Cell Injection aan muismodellen van Brain metastase Produce

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellulair en cellulaire Lung Model studie Tumor uitzaaiingen

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathologische analyse van longmetastase na laterale staartaderinjectie van tumorcellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Een biomimetisch model voor leverkanker om tumor-stroma-interacties te bestuderen in een 3D-omgeving met afstembare bio-fysische eigenschappen

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modellering van hersenmetastase via staartaderinjectie van inflammatoire borstkankercellen

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Een permanent venster voor het onderzoeken van kankermetastase naar de longen

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

Intratibiale osteosarcoomcelinjectie om orthotopisch osteosarcoom en longmetastase muismodellen te genereren

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...