Name: portal vein injection of colorectal cancer organoids to study the liver metastasis stroma
Uploaded: 2021-09-03T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (APP1156391 ל- D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 עד D.L.W., APP1140236 עד S.L.W., APP1099283 עד D.L.W.,); מועצת הסרטן SA ניצחה את פרויקט הסרטן בשם התורמים שלה וממשלת המדינה של דרום אוסטרליה באמצעות מחלקת הבריאות (MCF0418 ל- S.L.W., D.L.W.); מענק סיוע למחקר מדעי (B) (20H03467 ל- M.T.) שהוזמן על ידי משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן; AMED-CREST (הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי, מחקר ליבה למדע וטכנולוגיה אבולוציונית (19gm0810007h0104 ו- 19gm1210008s0101 עד A.E.); הפרויקט לחקר הסרטן ואבולוציה טיפולית (P-CREATE) מ- AMED (19cm0106332h0002 עד A.E.); האגודה היפנית לקידום המדע בחו"ל תוכנית אתגר לחוקרים צעירים (ל- H.K.), מלגת קרן טקדה למדע (ל- H.K.), מלגת הדוקטורט הבינלאומית של גרייטון (ל- H.K.), מלגת קרן המחקר הרפואי של ליונס (ל- K.G.).
אנו מודים לד"ר לזק ליסובסקי במתקן להנדסת וקטורים וגנום (VGEF), מכון המחקר הרפואי לילדים (CMRI) (NSW, אוסטרליה) על ייצור וקטורים רקומביננטיים AAV.

כל ההליכים בבעלי חיים במאמר זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לאתיקה של בעלי חיים במכון הבריאות והמחקר הרפואי של דרום אוסטרליה (מספר אישור, SAM322).
1. הזרקת וריד זנב של וירוס הקשור לאדנו
הערה: יש לטפל בנגיף הקשור ל-Adeno (AAV) כביו-האזרד תחת הנחיות בטיחות ביולוגית ברמה 1. אנא...

במחקר זה, הראינו כי הזרקת ורידים פורטליים של אורגנואידים CRC של עכברים יוצרת באופן משוחזר גרורות כבד עשירות בפיברובלסטים המחקות תכונות היסטולוגיות של גרורות כבד CRC אנושיות. יתר על כן, בשילוב עם טיפולים מכווני סטרומה כגון ריפוי גנטי בתיווך AAV8, מודל פרה-קליני זה משמש ככלי שימושי להערכת השפעות...

סרטן המעי הגס (CRC) הוא הגורם העיקרי לתמותה מסרטן ברחבי העולם1. יותר ממחצית מחולי ה-CRC מפתחים גרורות בכבד המתרחשות באמצעות הפצת וריד הפורטל1. נכון לעכשיו, אין טיפולים יעילים שיכולים לרפא גרורות מתקדמות בכבד, ורוב החולים נכנעים למחלה גרורתית.
הנישה הגרורתית או המיקרו-סביבה של הגידול ממלאת תפקיד מפתח בהשתקה ובצמיחה של תאי CRC מופצים2. פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs), מרכיב בולט במיקרו-סביבה של הגידול, מקדמים או מרסנים את התקדמות הסרטן באמצעות הפרשת גורמי גדילה, שיפוץ המטריצה החוץ-תאית (ECM) וויסות נופי מערכת החיסון והאנגיוגנזה 3,4,5. CAFs גם מעניקים עמידות לכימותרפיה ולאימונותרפיות3. יתר על כן, CAFs מווסתים את ההתחלה וההתקדמות של גרורות בכבד CRC ומנבאים פרוגנוזה בחולים עם CRC 3,6,7,8. לפיכך, גורמים הקשורים ל- CAF יכולים להיות מנוצלים לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות לעיכוב גרורות בכבד CRC. עם זאת, היעדר מודלים משביעי רצון של עכברים לחקר סטרומה של הגידול הגרורתי היווה מכשול מרכזי לפיתוח טיפולים ממוקדי סטרומה.
נכון לעכשיו, מודלים של בעלי חיים לחקר גרורות בכבד CRC כוללים מודלים ראשוניים של CRC המפתחים באופן ספונטני גרורות בכבד ומודלים של השתלת תאים סרטניים לתוך הכבד. מודלים ראשוניים של עכברי CRC, כגון מודלים של עכברים מהונדסים גנטית והזרקה מעי גסה של תאים סרטניים, מראים רק לעתים רחוקות גרורות לכבד 9,10,11,12. יתר על כן, גם אם נצפתה גרורתה בכבד, מודלים אלה מראים חביון ארוך מהאינדוקציה של הגידול הראשוני ועד גרורות, ועלולים למות מנטל הגידול הראשוני12. כדי ליצור ביעילות גרורות בכבד CRC, תאי CRC בתרבית מושתלים בכבד באמצעות שלוש גישות הזרקה: הזרקה תוך-הטחולית, הזרקה תוך-פרנכימית ישירה לתוך הכבד והזרקת וריד פורטלי. תאים סרטניים שהוזרקו באופן תוך-ספלני התפשטו לווריד הטחול, לווריד הפורטלי, ובסופו של דבר לכבד13,14. עם זאת, הזריקה התוך-טחולית מניבה יחס נטילת גידול נמוך יותר בהשוואה למודלים אחרים של השתלה15,16. עם הזרקה תוך-טחולית, הסרה כירורגית של הטחול מבוצעת כדי למנוע צמיחת סרטן בטחול, מה שעלול לפגוע בהבשלת תאי מערכת החיסון17. יתר על כן, הזרקה תוך-טחולית יכולה גם לגרום לצמיחה לא מכוונת של הגידול בטחול ובחלל הבטן18, מה שמסבך את ניתוחי הגרורות בכבד. הזרקה תוך-פרנכימלית ישירה לתוך הכבד גורמת ביעילות לגרורות בכבד 16,19,20. עם זאת, גישה זו אינה משחזרת באופן מלא שלב ביולוגי של גרורות בכבד המתרחש באופן טבעי באמצעות הפצת ורידים בפורטל. באמצעות הזרקה ישירה לתוך הכבד, כניסה של תאים סרטניים לתוך לא פורטל, אבל מחזור הדם המערכתי יכול גם לגרום למספר גרורות ריאה גדולות16. למרות שרוב החולים עם גרורות בכבד CRC מראים מספר גושים של גידולים בכבד21, הזרקה ישירה לאונת כבד ספציפית מייצרת מסת גידול אחת19,20. הזרקת וריד פורטלי או הזרקת ורידים מזנטריים, למרות שהיא מאתגרת מבחינה טכנית, מאפשרת העברה יעילה של תאי גידול לתוך הכבד באופן שמשחזר את דפוסי הגדילה שנראו בחולים17. אסטרטגיה זו יכולה למזער את האפשרות של גרורות באתר משני ומאפשרת צמיחה מהירה של תאים סרטניים בכבד, תוך פישוט ניתוחי הישרדות של עכברים.
מבחינה היסטורית, קווי תאים של סרטן המעי הגס כגון עכבר MC-38, HT-29 אנושי ו- SW-620 שימשו ליצירת מודלים של עכברים של גרורות בכבד22,23. עם זאת, קווי תאים אלה של סרטן המעי הגס אינם גורמים לתגובה סטרומלית דסמופלסטית. תכולה סטרומלית נמוכה בגידולים מקשה על חקר התפקידים הביולוגיים של פיברובלסטים הקשורים לסרטן. ההתקדמות האחרונה באורגנואידים של CRC ובהשתלתם הציעה פלטפורמות שימושיות להערכת תפקידים חיוניים של הסטרומה בהתקדמות הסרטן24. השתלת כבד של אורגנואידים CRC מייצרת מיקרו-סביבה של גידול עשיר בפיברובלסטים וסיפקה תובנות חדשניות על מחקר סטרומלי 6,25. נכון לעכשיו, הזרקת ורידים פורטלית או מזנטרית של אורגנואידים הפכה לגישה סטנדרטית זהב ליצירת גרורות בכבד CRC 6,25,26,27,28. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אף מאמר קודם לא תיאר שיטות מפורטות להזרקת ורידים פורטליים של גידולים במעי הגס. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה לשימוש בהזרקת ורידים פורטלית של אורגנואידים מסוג CRC כדי לפתח טיפול חדשני בהכוונת סטרומה בתיווך נגיף אדנו (AAV).
הפטוציטים הם מרכיב חשוב של המיקרו-סביבה של הגידול הגרורתי בכבד וממלאים תפקיד קריטי בהתקדמות סרטן גרורתי29. בהשראת ההצלחה של גישות ריפוי גנטי AAV להשראת ביטוי חלבונים בהפטוציטים בחולים שאינם ניאופלסטיים30,31, חקרנו גישה דומה אך מכוונת לשנות את המיקרו-סביבה של גידולי הכבד ב-CRC25. ככזה, אנו מתארים כאן גם את הזרקת וריד הזנב של AAV8 כדי לגרום לביטוי של חלבונים אנטי-סרטניים כדי לשנות את המיקרו-סביבה של גידולי הכבד. הסרוטיפ AAV8, המיועד על ידי בחירה של חלבון קפסיד נגיפי במהלך ייצור הנגיף, מוביל ליעילות טרנסדוקציה גבוהה במיוחד של הפטוציטים (כלומר, ביטוי גנים ממוקד במיקרו-סביבה של גידולי הכבד)32. בעבר הראינו כי Islr (משפחת-על אימונוגלובולינים המכילה חזרה עשירה בלאוצין) הוא גן ספציפי ל-CAF המעורר איתות של חלבון מורפוגנטי בעצמות (BMP), מפחית את צמיחת הגידולים של CRC ומקדם התמיינות תאי גזע במעיים Lgr5+ 25. בדקנו אם ביטוי יתר בתיווך AAV8 של הגן הסטרומלי מרסן הסרטן, Islr, בהפטוציטים יכול להחליש את התקדמות גרורות הכבד על ידי ביצוע הזרקת ורידים פורטליים של גידולי CRC בעכברים שטופלו ב-AAV8-Islr.
במאמר זה, אנו מתארים לראשונה את הליך הזרקת ורידי הזנב של AAV טרופי כבד. לאחר מכן, אנו מתארים שיטה להכנת תאים סרטניים והזרקת ורידים פורטליים לעכברים שטופלו ב-AAV. לבסוף, אנו מציגים גישות לניטור התקדמות הגידול הגרורתי כדי להעריך את היעילות של טיפולים מכווני סטרומה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle</td>
			<td>TSK</td>
			<td>LDS-33013</td>
			<td>For portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 vicryl suture</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>J494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40-&#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302130</td>
			<td>Used to apply saline to the intestine after portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS*50LE</td>
			<td>Luer lock syringe for perfusion fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Isopropyl alcohol wipe</td>
			<td>Briemar</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia machine</td>
			<td>Darvall</td>
			<td>9356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0851</td>
			<td>Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>TROY</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ilium Temvet Injection, 300 &#181;g/ml Buprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Johnson&#39;s pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>HAMILTON</td>
			<td>81020</td>
			<td>For portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat box (animal warming chamber)</td>
			<td>Datesand</td>
			<td>MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic sponge</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0891-04-015</td>
			<td>Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>Talens</td>
			<td>44727000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe and needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>326769</td>
			<td>For tail vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islr probe (RNAscope)</td>
			<td>ACD</td>
			<td>450041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>988-3244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI fibrosis tool</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope kit</td>
			<td>ACD</td>
			<td>322300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-Cas9 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>024858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>PHA19042010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin staplers</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59028</td>
			<td>9 mm wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler applicator</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59026</td>
			<td>9 mm wound clip applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler remover</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59037</td>
			<td>Wound clip remover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Multigate</td>
			<td>29-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>Sentry Medical</td>
			<td>GS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical anesthesia cream</td>
			<td>EMLA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605028</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

portal vein injection of colorectal cancer organoids to study the liver metastasis stroma

גרורות בכבד של סרטן המעי הגס (CRC) הן הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן. פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs), מרכיב מרכזי במיקרו-סביבה של הגידול, ממלאים תפקיד מכריע בהתקדמות CRC גרורתית ומנבאים פרוגנוזה לקויה של המטופלים. עם זאת, חסרים מודלים משביעי רצון של עכברים כדי לחקור את ההצלבה בין תאים סרטניים גרורתיים לבין CAFs. כאן אנו מציגים שיטה לחקור כיצד התקדמות גרורות בכבד מווסתת על ידי הנישה הגרורתית וייתכן שניתן לרסן אותה על ידי טיפול מכוון סטרומה. הזרקת ורידים פורטלית של אורגנואידים CRC יצרה תגובה דסמופלסטית, אשר שחזרה בנאמנות את ההיסטולוגיה העשירה בפיברובלסטים של גרורות כבד CRC אנושיות. מודל זה היה ספציפי לרקמות עם עומס גידול גבוה יותר בכבד בהשוואה למודל הזרקה תוך-טחולית, מה שמפשט את ניתוחי ההישרדות של העכברים. על ידי הזרקת אורגנואידים של גידולים המבטאים לוציפראז, ניתן היה לנטר קינטיקה של גדילת הגידול על ידי הדמיית in vivo . יתר על כן, מודל פרה-קליני זה מספק פלטפורמה שימושית להערכת היעילות של טיפולים המכוונים למזנכים של הגידול. אנו מתארים שיטות לבחון אם העברה בתיווך נגיף הקשור לנגיף של גן סטרומלי מעכב גידול להפטוציטים יכולה לשפץ את המיקרו-סביבה של הגידול ולשפר את הישרדות העכברים. גישה זו מאפשרת פיתוח והערכה של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לעיכוב גרורות בכבד של CRC.

כדי לגרום לביטוי יתר בתיווך AAV של גן סטרומלי מרסן גידול, Islr 4,25,43,44, בהפטוציטים, הזרקנו תוך ורידי AAV8 המקודד על ידי איסלר. 1.0 x 1011 גנומים נגיפיים (vg) של AAV8-Islr, או כבקרה, AAV8-mRuby2, הוזרקו לווריד זנב העכבר הבוגר (...

Watch this Scientific Journal Video about Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma at JoVE.com

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים מסרטן המעי הגס (CRC) יוצרת גרורות כבד עשירות בסטרומה. מודל עכבר זה של גרורות כבד CRC מייצג כלי שימושי לחקר אינטראקציות בין גידול לסטרומה ולפיתוח טיפולים חדשניים המכוונים לסטרומה כגון טיפולים גנטיים בתיווך וירוסים הקשורים לאדנו.

הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים לסרטן המעי הגס לחקר סטרומה גרורות בכבד

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...

יותר מ-50% מחולי סרטן המעי הגס מפתחים גרורות בכבד באמצעות הפצת ורידים בפורטל. והמודלים הנוכחיים של בעלי חיים לחקר גרורות בכבד של סרטן המעי הגס עדיין אינם מספיקים כדי לשחזר את התהליך הביולוגי. הזרקת ורידים פורטלית של סרטני סרטן המעי הגס מספקת סביבת גידול עשירה בפיברובלסטים המאפשרת לחקור את ההצלבה בין תאים סרטניים גרורתיים ו- CAS בגרורות כבד של סרטן המעי הגס.טכניקה זו מספקת פלטפורמה להערכת היעילות של אסטרטגיות טיפוליות המכוונות למיקרו-סביבה של הגידול של גרורות הכבד של סרטן המעי הגס. שיטה זו שימושית במיוחד לחקר אינטראקציות בין CAS, תאי גידול ומיקרו-סביבה של הגידול. אם קצה הכותנה אינו מונח כראוי באתר ההזרקה, דימום יתר עלול להתרחש לאחר הסרת המחט.ההשריה של קצה הכותנה נעצרת ברגע שמקום ההזרקה נמצא. זיהוי וריד הפורטל והדמיית אתר ההזרקה יכולים להיות קשים ללא הדגמה חזותית של הליך זה. כדי להתחיל, להכין אזור כירורגי אספטי באמצעות וילונות סטריליים על כרית חימום.בנוסף, הכינו את כל המכשירים הדרושים לניתוח כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן האר את האזור הכירורגי על ידי התאמת מיקום מקור האור. לאחר מכן, להזריק באופן תת עורי 0.1 מיליגרם לכל קילוגרם של משקל גוף של בופרנורפין לעכבר לניהול כאב כירורגי.לאחר מכן מרדימים את העכבר ומשתמשים במכונת גילוח חשמלית, גילחו את הבטן האמצעית עד העליונה באזור מרוחק מהאזור הכירורגי האספטי כדי למנוע זיהום שיער באתר. נקו את אתר החתך לסירוגין עם בטאדין ו-80% אתנול כדי לעקר את האזור הכירורגי. חזרו על הפעולה שלוש פעמים.מניחים את העכבר באזור הניתוח על משטח חימום במצב שכיבה עם תחזוקת הרדמה איזופלורנית. לאחר מכן מניחים וילון כירורגי עם חור על בטנו. הרימו את עור הבטן עם מלקחיים ועשו חתך עור של שניים עד שלושה סנטימטרים בקו האמצע עם מספריים, חותכים רק את העור, מוודאים שהחתך נע בין אמצע הבטן לתהליך ה-xiphoid של עצם החזה ולא מעל הקצה התחתון של תהליך ה-xiphoid.לאחר מכן הרימו באופן מלא את דופן הצפק עם מלקחיים ועשו חתך דומה של שניים עד שלושה סנטימטרים לצפק עם מספריים. הימנע חיתוך המעי ואת הסרעפת. לאחר מכן, משרים גזה כירורגית עם מלח חם ומניחים אותה ליד החתך מימינו של המנתח.משכו בעדינות את המעי הדק והגבוה החוצה באמצעות ניצן כותנה ספוג במי מלח והניחו אותם על הגזה הספוגה במי מלח. מכסים את המעיים בגאזה רטובה נוספת כדי לשמור עליהם לחים. לאחר מכן, בעדינות למשוך את המעי לימינו של המנתח עם הגזה הרטובה.לאחר מכן הפעל מתח עדין כדי לדמיין את וריד הפורטל. אם ההדמיה של וריד הפורטל קשה, כוונו בעדינות את מיקום הבטן עם ניצן כותנה רטוב. לאחר צנרת עדינה של תרחיף הגידול מספר פעמים כדי לקבל תרחיף תא הומוגני, משכו 100 מיקרוליטרים של תרחיף התא לתוך המילטון או מזרק מיליליטר אחד המחוברים למחט 33 מדים, תוך הימנעות מבועות אוויר.הכניסו באיטיות את המחט לתוך וריד הפורטל עם עומק הכנסה של שלושה עד ארבעה מילימטרים וזווית המחט כמעט מקבילה לווריד הפורטל. להזריק את תאי הגידול באיטיות במשך 30 שניות כדי למנוע חסימה של וריד הפורטל. צבע הכבד משתנה באופן זמני מאדום ללבן.לאחר ההזרקה, יש להסיר את המחט באיטיות ומיד להפעיל לחץ עדין על אתר ההזרקה עם ניצן כותנה יבשה למשך חמש דקות. מוציאים את ניצן הכותנה ומניחים מיד ספוג המוסטטי על מקום ההזרקה. החזיקו את הספוג עם ניצן כותנה או מלקחיים והפעילו לחץ עדין במשך חמש דקות נוספות.לאחר חמש דקות, הסר את הלחץ לספוג המוסטטי ומאשר כי אין דימום ממקום ההזרקה. אם מתרחש דימום, מיד לבצע hemostasis בלחץ עם ניצן כותנה במשך כ 10 דקות. לאחר מכן מרחו ספוג המוסטטי נוסף למשך חמש דקות נוספות.לאחר אישור כי אין דימום, להסיר את gauzes כירורגי על המעיים. לאחר מכן באמצעות מזרק מלא בחמישה מיליליטרים של מלח, להשפריץ את המלח למעיים כדי למנוע הידבקות איברים. הניחו בעדינות את המעיים בחזרה בתוך חלל הבטן ותפרו את הצפק באמצעות תפרים של 4-0 פוליגלקטין.לאחר מכן הרמת שני צידי העור עם מלקחיים, להחיל מהדקי עור כדי לסגור את חתך העור, נזהר לא להדק את המעי. כבה את האיזופלורן, אך שמור על זרימת החמצן פועלת. נטר בזהירות את העכבר.וכאשר העכבר מתעורר, הניחו אותו בכלוב ריק על כרית חימום. עקוב אחר העכבר עד שהוא בהכרה ואמבולציה כרגיל. ארבע שעות לאחר הניתוח, להזריק באופן תת עורי 0.1 מיליגרם לקילוגרם של בופרנורפין.בזהירות לפקח על העכבר מדי יום במשך שבוע, לבדוק את התפרים ואת ריפוי הפצע. שבעה עד 10 ימים לאחר הניתוח, יש להסיר את מהדקי העור באמצעות מסיר מהדק. הכלאה של RNA in situ שבועיים לאחר הזרקת זנב AAV-8 Islr הראתה ביטוי יתר של Islr בכבד.שבועיים לאחר הזרקת AAV mRuby2, הוזרקו תרחיפים חד-תאיים של אורגנואידים מסרטן המעי הגס לווריד פורטל העכבר. באופן מקרוסקופי, הזרקת וריד פורטל זו גרמה למספר גושים של גידולים לבנים בכבד. ההמטוקסילין והכתמת אאוזין של גרורות הכבד של סרטן המעי הגס המושרות על ידי הזרקת הווריד הפורטלי הדגימו היסטופתולוגיה של אדנוקרצינומה צינורית מובחנת למדי מלווה בתגובה סטרומלית דסמופלסטית ונמק.היסטולוגיה עשירה בסטרומה זו שחזרה בנאמנות את זו של גרורות בכבד של סרטן המעי הגס האנושי, והפכה את המודל הזה למתאים למחקר תרגומי החוקר את סטרומה של הגידול הגרורתי. אימונוהיסטוכימיה של אקטין שרירי אלפא חלק אישרה את נוכחותם של פיברובלסטים הקשורים לסרטן, ואילו הכתם האדום של פיקרו-סיריוס הדגים מטריצה חוץ-תאית בשפע במזנכים של הגידול. אימונוכימיה עבור EPCAM גילתה כי סרטן המעי הגס גרורתי הראה ניצנים של הגידול, שהוא מאפיין של פרוגנוזה גרועה סרטן המעי הגס.ומדד התוויות של Ki67 היה כ-80% מה שמעיד על כך שרוב תאי הגידול פעילים באופן מיטוטי. העכברים הראו הישרדות חציונית של 57 ימים לאחר הזרקת הגידול לווריד הפורטל. עכברים שטופלו ב-AAV-8 Islr הראו שיפור בהישרדות העכברים, ירידה באותות הדמיה in vivo מגידולים, איתות מוגבר של חלבונים מורפוגנטיים בעצמות, וירידה בתאי התפשטות Ki67.יש לוודא כי קצה הכותנה מוחל על אתר ההזרקה הנכון והספוג ההמוסטטי מוחל רק לאחר שהדימום נפסק. ניתן לעקוב אחר הקמת הגידול באמצעות הדמיית IVIS כדי לוודא שתאי הגידול גדלים בתוך הכבד.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Cell הזרקת הסרטן Intracarotid לייצר מודלי עכבר של המוח גרור

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

מודל ביומימטי לסרטן הכבד לחקר אינטראקציות גידול-סטרומה בסביבה תלת מימדית עם תכונות ביו-פיזיקליות מתכווננות

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

מידול גרורות במוח באמצעות הזרקת ורידים בזנב של תאי סרטן שד דלקתיים

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

חלון קבוע לחקירת גרורות סרטן לריאה

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

הזרקת תאי אוסטאוסרקומה אינטראטיביאלית להפקת אוסטאוסרקומה אורתוטופית ומודלים של עכבר גרורות ריאות

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...