Name: portal vein injection of colorectal cancer organoids to study the liver metastasis stroma
Uploaded: 2021-09-03T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma at JoVE.com

इस अध्ययन को राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (APP1156391 से D.L.W., S.L.W.) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। (APP1081852 करने के लिए D.L.W., APP1140236 S.L.W., APP1099283 करने के लिए D.L.W.,); कैंसर काउंसिल एसए बीट कैंसर परियोजना अपने दाताओं और स्वास्थ्य विभाग के माध्यम से दक्षिण ऑस्ट्रेलिया की राज्य सरकार की ओर से (MCF0418 S.L.W., D.L.W.) के माध्यम से; जापान के शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा कमीशन किए गए वैज्ञानिक अनुसंधान (बी) (20H03467 से एमटी) के लिए अनुदान-इन-एड; AMED-CREST (चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी, विकास विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए कोर अनुसंधान (19gm0810007h0104 और 19gm1210008s0101 से A.E.); कैंसर अनुसंधान और चिकित्सीय विकास के लिए परियोजना (P-CREATE) AMED से (19cm0106332h0002 से A.E.); युवा शोधकर्ताओं के लिए विज्ञान विदेशी चुनौती कार्यक्रम के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (एच.के.), टेकेडा साइंस फाउंडेशन फैलोशिप (एच.के.), ग्रेटन इंटरनेशनल पीएचडी छात्रवृत्ति (एच.के.के.के.), लायंस मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन छात्रवृत्ति (के.जी.)।
हम वेक्टर और जीनोम इंजीनियरिंग सुविधा (वीजीईएफ), बच्चों के चिकित्सा अनुसंधान संस्थान (सीएमआरआई) (एनएसडब्ल्यू, ऑस्ट्रेलिया) में डॉ लेज़ेक लिसोव्स्की को पुनः संयोजक एएवी वैक्टर के उत्पादन के लिए धन्यवाद देते हैं।

इस लेख में सभी पशु प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई और दक्षिण ऑस्ट्रेलियाई स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान संस्थान पशु नैतिकता समिति (अनुमोदन संख्या, SAM322) द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. एडेनो से जुड?...

इस अध्ययन में, हमने दिखाया है कि माउस सीआरसी ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन को फिर से विकसित किया जाता है जो फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करता है जो मानव सीआरसी यकृत मेटास्टेस...

कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) दुनिया भर में कैंसर की मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है। सीआरसी रोगियों के आधे से अधिक यकृत मेटास्टेसिस विकसित करते हैं जो पोर्टल शिरा प्रसार1 के माध्यम से होता है। वर्तमान में, कोई प्रभावी चिकित्सीय नहीं है जो उन्नत यकृत मेटास्टेसिस का इलाज कर सकता है, और अधिकांश रोगी मेटास्टैटिक बीमारी से पीड़ित हैं।
मेटास्टैटिक आला या ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट प्रसारित सीआरसी कोशिकाओं के एनग्राफ्टमेंट और विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाताहै। कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ), ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का एक प्रमुख घटक, विकास कारकों को स्रावित करने, बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) को फिर से तैयार करने और प्रतिरक्षा परिदृश्य और एंजियोजेनेसिस 3,4,5 को संशोधित करने के माध्यम से कैंसर की प्रगति को बढ़ावा देने या रोकने के लिए। सीएएफ भी chemotherapys और immunotherapys 3 के लिए प्रतिरोध प्रदान करतेहैं। इसके अलावा, सीएएफ सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस की दीक्षा और प्रगति को विनियमित करते हैं और सीआरसी 3,6,7,8 वाले रोगियों में पूर्वानुमान की भविष्यवाणी करते हैं। इस प्रकार, सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस को बाधित करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए सीएएफ से संबंधित कारकों का शोषण किया जा सकता है। हालांकि, मेटास्टैटिक ट्यूमर स्ट्रोमा का अध्ययन करने के लिए संतोषजनक माउस मॉडल की कमी स्ट्रोमा-लक्षित उपचार विकसित करने के लिए एक बड़ी बाधा रही है।
वर्तमान में, सीआरसी लिवर मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल में प्राथमिक सीआरसी मॉडल शामिल हैं जो अनायास यकृत मेटास्टेसिस और कैंसर सेल प्रत्यारोपण मॉडल को जिगर में विकसित करते हैं। प्राथमिक सीआरसी माउस मॉडल, जैसे आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल और कैंसर कोशिकाओं के कोलोनिक इंजेक्शन, शायद ही कभी जिगरको मेटास्टेसिस दिखाते हैं 9,10,11,12। इसके अलावा, यहां तक कि अगर एक जिगर मेटास्टेसिस मनाया जाता है, तो ये मॉडल प्राथमिक ट्यूमर प्रेरण से मेटास्टेसिस तक लंबी विलंबता दिखाते हैं, और संभावित रूप से प्राथमिक ट्यूमर के बोझ से मर जातेहैं। कुशलतापूर्वक सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करने के लिए, सुसंस्कृत सीआरसी कोशिकाओं को तीन इंजेक्शन दृष्टिकोणों का उपयोग करके जिगर में प्रत्यारोपित किया जाता है: इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन, जिगर में प्रत्यक्ष इंट्रा-पैरेन्काइमल इंजेक्शन, और पोर्टल शिरा इंजेक्शन। इंट्रा-स्प्लेनिक रूप से इंजेक्ट की गई कैंसर कोशिकाएं प्लीहा नस, पोर्टल नस, और अंततः जिगर13,14 में फैल जाती हैं। हालांकि, इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन अन्य प्रत्यारोपण मॉडल15,16 की तुलना में कम ट्यूमर लेने का अनुपात पैदा करता है। इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन के साथ, प्लीहा के सर्जिकल हटाने को प्लीहा में कैंसर के विकास से बचने के लिए किया जाता है, जो संभावित रूप से प्रतिरक्षा कोशिका परिपक्वता से समझौता कर सकताहै 17। इसके अलावा, इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन के परिणामस्वरूप प्लीहा और उदर गुहा18 में अनपेक्षित ट्यूमर की वृद्धि भी हो सकती है, जो यकृत मेटास्टेसिस विश्लेषण को जटिल बनाती है। जिगर में प्रत्यक्ष इंट्रा-पैरेन्काइमल इंजेक्शन कुशलतापूर्वक यकृत मेटास्टेसिस 16,19,20 को प्रेरित करता है। फिर भी, यह दृष्टिकोण पूरी तरह से यकृत मेटास्टेसिस के जैविक चरण को दोहराता नहीं है जो स्वाभाविक रूप से पोर्टल शिरा प्रसार के माध्यम से होता है। जिगर में सीधे इंजेक्शन का उपयोग करना, एक गैर-पोर्टल में कैंसर कोशिकाओं का प्रवेश, लेकिन प्रणालीगत परिसंचरण के परिणामस्वरूप कई बड़े फेफड़ों के मेटास्टेसिस भी हो सकतेहैं। हालांकि सीआरसी लिवर मेटास्टेसिस वाले अधिकांश रोगी जिगर21 में कई ट्यूमर नोड्यूल दिखाते हैं, एक विशिष्ट यकृत लोब में प्रत्यक्ष इंजेक्शन एक एकल ट्यूमर द्रव्यमान19,20 उत्पन्न करता है। पोर्टल शिरा इंजेक्शन या mesenteric शिरा इंजेक्शन, हालांकि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, जिगर में ट्यूमर कोशिकाओं के कुशल वितरण की अनुमति देता है एक तरह से है कि रोगियों में देखा विकास पैटर्न recapitulates17. यह रणनीति माध्यमिक-साइट मेटास्टेसिस की संभावना को कम कर सकती है और जिगर में कैंसर कोशिकाओं के तेजी से विकास को सक्षम बनाती है, जिससे माउस अस्तित्व विश्लेषण को सरल बनाया जा सकता है।
ऐतिहासिक रूप से, कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों जैसे माउस एमसी -38, मानव एचटी -29, और एसडब्ल्यू -620 का उपयोग यकृत मेटास्टेसिस22,23 के माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए किया गया था। हालांकि, ये कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनें एक डेस्मोप्लास्टिक स्ट्रोमल प्रतिक्रिया को प्रेरित नहीं करती हैं। ट्यूमर में कम स्ट्रोमल सामग्री कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट की जैविक भूमिकाओं की जांच करना मुश्किल बनाती है। सीआरसी ऑर्गेनोइड्स और उनके प्रत्यारोपण में हाल की प्रगति ने कैंसर की प्रगतिमें स्ट्रोमा की महत्वपूर्ण भूमिकाओं का आकलन करने के लिए उपयोगी प्लेटफार्मों की पेशकश की है। सीआरसी ऑर्गेनोइड्स का यकृत प्रत्यारोपण एक फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट उत्पन्न करता है और स्ट्रोमल अनुसंधान 6,25 में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। वर्तमान में, ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल या मेसेन्टेरिक शिरा इंजेक्शन सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस 6,25,26,27,28 उत्पन्न करने के लिए एक स्वर्ण मानक दृष्टिकोण बन गया है। फिर भी, हमारे ज्ञान के लिए, किसी भी पिछले कागजात ने कोलोरेक्टल ट्यूमरोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन के लिए विस्तृत तरीकों का वर्णन नहीं किया है। यहां, हम उपन्यास एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) -मध्यस्थता स्ट्रोमा-निर्देशित चिकित्सा विकसित करने के लिए सीआरसी ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन का उपयोग करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं।
हेपेटोसाइट्स यकृत में मेटास्टैटिक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का एक महत्वपूर्ण घटक है और मेटास्टैटिक कैंसर की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाताहै। गैर-नियोप्लास्टिक रोगियों30,31 में हेपेटोसाइट्स में प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए एएवी जीन थेरेपी दृष्टिकोण की सफलता से प्रेरित होकर, हमने एक समान दृष्टिकोण की जांच की, लेकिन सीआरसी25 में यकृत ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को संशोधित करने का उद्देश्य। इस प्रकार, हम यकृत ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को संशोधित करने के लिए एंटी-ट्यूमरजेनिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए एएवी 8 के पूंछ शिरा इंजेक्शन का भी वर्णन करते हैं। AAV8 serotype, वायरस उत्पादन के दौरान वायरल capsid प्रोटीन की पसंद द्वारा नामित, हेपेटोसाइट्स की विशेष रूप से उच्च transduction दक्षता की ओर जाता है (यानी, जिगर ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में लक्षित जीन अभिव्यक्ति)32. हमने पहले दिखाया है कि Islr (इम्युनोग्लोबुलिन superfamily जिसमें ल्यूसीन-समृद्ध दोहराव होता है) एक सीएएफ-विशिष्ट जीन है जो हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) सिग्नलिंग को प्रेरित करता है, सीआरसी ट्यूमरोइड विकास को कम करता है, और Lgr5 + आंतों के स्टेम सेल भेदभाव को बढ़ावा देताहै। हमने परीक्षण किया कि क्या एएवी 8-हेपेटोसाइट्स में कैंसर-निरोधक स्ट्रोमल जीन, इसएलआर के मध्यस्थता ओवरएक्सप्रेशन, एएवी 8-इस्लर-उपचारित चूहों में सीआरसी ट्यूमरोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन का प्रदर्शन करके यकृत मेटास्टेसिस प्रगति को क्षीण कर सकता है।
इस पेपर में, हम पहले जिगर उष्णकटिबंधीय एएवी की पूंछ शिरा इंजेक्शन प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। फिर, हम एएवी-उपचारित चूहों में ट्यूमरॉइड सेल तैयारी और पोर्टल शिरा इंजेक्शन के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। अंत में, हम स्ट्रोमा-निर्देशित चिकित्सीय की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए मेटास्टैटिक ट्यूमर प्रगति की निगरानी करने के लिए दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle</td>
			<td>TSK</td>
			<td>LDS-33013</td>
			<td>For portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 vicryl suture</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>J494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40-&#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302130</td>
			<td>Used to apply saline to the intestine after portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS*50LE</td>
			<td>Luer lock syringe for perfusion fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Isopropyl alcohol wipe</td>
			<td>Briemar</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia machine</td>
			<td>Darvall</td>
			<td>9356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0851</td>
			<td>Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>TROY</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ilium Temvet Injection, 300 &#181;g/ml Buprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Johnson&#39;s pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>HAMILTON</td>
			<td>81020</td>
			<td>For portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat box (animal warming chamber)</td>
			<td>Datesand</td>
			<td>MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic sponge</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0891-04-015</td>
			<td>Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>Talens</td>
			<td>44727000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe and needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>326769</td>
			<td>For tail vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islr probe (RNAscope)</td>
			<td>ACD</td>
			<td>450041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>988-3244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI fibrosis tool</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope kit</td>
			<td>ACD</td>
			<td>322300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-Cas9 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>024858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>PHA19042010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin staplers</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59028</td>
			<td>9 mm wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler applicator</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59026</td>
			<td>9 mm wound clip applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler remover</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59037</td>
			<td>Wound clip remover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Multigate</td>
			<td>29-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>Sentry Medical</td>
			<td>GS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical anesthesia cream</td>
			<td>EMLA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605028</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

portal vein injection of colorectal cancer organoids to study the liver metastasis stroma

कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) का यकृत मेटास्टेसिस कैंसर से संबंधित मृत्यु का एक प्रमुख कारण है। कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ), ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का एक प्रमुख घटक, मेटास्टैटिक सीआरसी प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और खराब रोगी के पूर्वानुमान की भविष्यवाणी करते हैं। हालांकि, मेटास्टैटिक कैंसर कोशिकाओं और सीएएफ के बीच क्रॉसस्टॉक का अध्ययन करने के लिए संतोषजनक माउस मॉडल की कमी है। यहां, हम यह जांचने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं कि यकृत मेटास्टेसिस प्रगति को मेटास्टैटिक आला द्वारा कैसे विनियमित किया जाता है और संभवतः स्ट्रोमा-निर्देशित चिकित्सा द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। सीआरसी ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन ने एक डेस्मोप्लास्टिक प्रतिक्रिया उत्पन्न की, जिसने मानव सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस के फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध हिस्टोलॉजी को ईमानदारी से दोहराया। यह मॉडल इंट्रा-प्लीहा इंजेक्शन मॉडल की तुलना में जिगर में एक उच्च ट्यूमर बोझ के साथ ऊतक-विशिष्ट था, जो माउस अस्तित्व के विश्लेषण को सरल बनाता है। लूसिफेरस-व्यक्त ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स को इंजेक्ट करके, ट्यूमर विकास कैनेटीक्स को विवो इमेजिंग में मॉनिटर किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रीक्लिनिकल मॉडल ट्यूमर मेसेनकाइम को लक्षित करने वाले चिकित्सीय की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक उपयोगी मंच प्रदान करता है। हम यह जांचने के तरीकों का वर्णन करते हैं कि क्या हेपेटोसाइट्स के लिए ट्यूमर-अवरोधक स्ट्रोमल जीन के एडेनो-संबद्ध वायरस-मध्यस्थता वितरण ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को फिर से तैयार कर सकते हैं और माउस के अस्तित्व में सुधार कर सकते हैं। यह दृष्टिकोण सीआरसी के यकृत मेटास्टेसिस को बाधित करने के लिए उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों के विकास और मूल्यांकन को सक्षम बनाता है।

एक ट्यूमर-निरोधक स्ट्रोमल जीन के एएवी-मध्यस्थता ओवरएक्सप्रेशन को प्रेरित करने के लिए, हेपेटोसाइट्स में, Islr 4,25,43,44, हम अंतःशिरा रूप से Islr-एन्कोडिंग AAV8 को इंजेक?...

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Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) ऑर्गेनोइड्स का पोर्टल शिरा इंजेक्शन स्ट्रोमा-समृद्ध यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करता है। सीआरसी हेपेटिक मेटास्टेसिस का यह माउस मॉडल ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन का अध्ययन करने और उपन्यास स्ट्रोमा-निर्देशित चिकित्सीय जैसे एडेनो-संबद्ध वायरस-मध्यस्थता जीन उपचार विकसित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

लिवर मेटास्टेसिस स्ट्रोमा का अध्ययन करने के लिए कोलोरेक्टल कैंसर ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल वेन इंजेक्शन

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...

कोलोरेक्टल कैंसर के 50% से अधिक रोगियों को पोर्टल शिरा प्रसार के माध्यम से यकृत मेटास्टेसिस विकसित होता है। और कोलोरेक्टल कैंसर यकृत मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए वर्तमान पशु मॉडल जैविक प्रक्रिया को दोहराने के लिए अपर्याप्त रहते हैं। कोलोरेक्टल कैंसर ट्यूमरोइड्स का पोर्टल शिरा इंजेक्शन एक फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध ट्यूमर वातावरण प्रदान करता है जो कोलोरेक्टल कैंसर लिवर मेटास्टेसिस में मेटास्टैटिक कैंसर कोशिकाओं और कैस के बीच क्रॉसस्टॉक की जांच की अनुमति देता है।यह तकनीक कोलोरेक्टल कैंसर यकृत मेटास्टेसिस के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को लक्षित करने वाली चिकित्सीय रणनीतियों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक मंच प्रदान करती है। यह विधि कैस, ट्यूमर कोशिकाओं और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के बीच बातचीत की जांच के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। यदि कपास की नोक को इंजेक्शन साइट पर सही ढंग से नहीं रखा गया है, तो सुई हटाने के बाद अत्यधिक रक्तस्राव हो सकता है।इंजेक्शन साइट स्थित होने के बाद कपास की नोक को भिगोना बंद हो जाता है। पोर्टल नस की पहचान करना और इंजेक्शन साइट को विज़ुअलाइज़ करना इस प्रक्रिया के दृश्य प्रदर्शन के बिना मुश्किल हो सकता है। शुरू करने के लिए, हीटिंग पैड पर बाँझ ड्रेप्स का उपयोग करके एक एसेप्टिक सर्जिकल क्षेत्र तैयार करें।इसके अतिरिक्त, पाठ पांडुलिपि में वर्णित सर्जरी के लिए आवश्यक सभी उपकरणों को तैयार करें। फिर प्रकाश स्रोत की स्थिति को समायोजित करके सर्जिकल क्षेत्र को रोशन करें। इसके बाद, चमड़े के नीचे शल्य चिकित्सा दर्द प्रबंधन के लिए माउस में buprenorphine के शरीर के वजन के प्रति किलोग्राम 0.1 मिलीग्राम इंजेक्ट करें।फिर माउस को एनेस्थेटिक करें और एक इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करके, साइट को दूषित करने वाले बालों से बचने के लिए एसेप्टिक सर्जिकल क्षेत्र से दूर के क्षेत्र में ऊपरी पेट के मध्य को शेव करें। शल्य चिकित्सा क्षेत्र को निष्फल करने के लिए Betadine और 80% इथेनॉल के साथ बारी बारी से चीरा साइट को साफ करें। इसे तीन बार दोहराएं।माउस को एक हीटिंग पैड पर सर्जिकल क्षेत्र में आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण रखरखाव के साथ एक सुपाइन स्थिति में रखें। फिर इसके पेट पर एक छेद के साथ एक सर्जिकल ड्रेप रखें। संदंश के साथ पेट की त्वचा को उठाएं और कैंची के साथ मध्यरेखा पर दो से तीन सेंटीमीटर त्वचा चीरा बनाएं, केवल त्वचा को काटते हुए, यह सुनिश्चित करें कि चीरा मध्य-पेट से उरोस्थि की xiphoid प्रक्रिया तक होता है और xiphoid प्रक्रिया के निचले छोर से ऊपर नहीं होता है।फिर पूरी तरह से संदंश के साथ पेरिटोनियल दीवार को उठाएं और कैंची के साथ पेरिटोनियम के लिए एक समान दो से तीन सेंटीमीटर चीरा बनाएं। आंत और डायाफ्राम को काटने से बचें। इसके बाद, गर्म खारा के साथ एक सर्जिकल धुंध भिगोएं और इसे सर्जन के दाईं ओर चीरा के बगल में रखें।धीरे से छोटी और बड़ी आंतों को खारा के साथ भिगोए गए कपास की कली का उपयोग करके बाहर खींचें और उन्हें खारे भिगोए हुए धुंध पर रखें। आंतों को नम रखने के लिए अतिरिक्त गीले धुंध के साथ कवर करें। इसके बाद, धीरे से आंत को गीले धुंध के साथ सर्जन के दाईं ओर खींचें।फिर पोर्टल नस की कल्पना करने के लिए कोमल तनाव लागू करें। यदि पोर्टल नस का विज़ुअलाइज़ेशन मुश्किल है, तो धीरे-धीरे एक गीली कपास की कली के साथ पेट की स्थिति को समायोजित करें। एक समरूप सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए कई बार ट्यूमरॉइड निलंबन को धीरे-धीरे पाइप करने के बाद, सेल निलंबन के 100 माइक्रोलीटर को हैमिल्टन या 33 गेज सुई से जुड़ी एक मिलीलीटर सिरिंज में तैयार करें, हवा के बुलबुले से बचें।धीरे-धीरे सुई बेवेल को पोर्टल शिरा में तीन से चार मिलीमीटर की सम्मिलन गहराई और सुई कोण पोर्टल शिरा के लगभग समानांतर के साथ डालें। पोर्टल नस के रोड़ा को रोकने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं को धीरे-धीरे 30 सेकंड से अधिक इंजेक्ट करें। जिगर का रंग अस्थायी रूप से लाल से सफेद में बदल जाता है।इंजेक्शन के बाद, सुई को धीरे-धीरे हटा दें और तुरंत पांच मिनट के लिए सूखी कपास की कली के साथ इंजेक्शन साइट पर कोमल दबाव लागू करें। कपास की कली को हटा दें और तुरंत इंजेक्शन साइट पर एक हेमोस्टैटिक स्पंज लागू करें। स्पंज को एक कपास की कली या संदंश के साथ पकड़ो और पांच और मिनट के लिए कोमल दबाव लागू करें।पांच मिनट के बाद, हेमोस्टैटिक स्पंज के दबाव को हटा दें और पुष्टि करें कि इंजेक्शन साइट से कोई रक्तस्राव नहीं हुआ है। यदि रक्तस्राव होता है, तो तुरंत लगभग 10 मिनट के लिए कपास की कली के साथ दबाव हेमोस्टेसिस करें। फिर एक और पांच मिनट के लिए एक अतिरिक्त हेमोस्टेटिक स्पंज लागू करें।यह पुष्टि करने के बाद कि कोई रक्तस्राव नहीं है, आंतों पर सर्जिकल धुंध को हटा दें। फिर खारा के पांच मिलीलीटर से भरा एक सिरिंज का उपयोग करके, अंग आसंजन को रोकने के लिए आंतों को खारा धारा निकलना। धीरे से पेट गुहा के अंदर आंतों को वापस रखें और 4-0 पॉलीग्लैक्टिन टांके का उपयोग करके पेरिटोनियम को सीवन करें।फिर संदंश के साथ त्वचा के दोनों किनारों को उठाते हुए, त्वचा के चीरे को बंद करने के लिए त्वचा स्टेपलर लागू करें, आंत को स्टेपल न करने के लिए सावधान रहें। आइसोफ्लुरेन को बंद कर दें, लेकिन ऑक्सीजन प्रवाह को चालू रखें। माउस की सावधानीपूर्वक निगरानी करें।और जब माउस जागता है, तो इसे हीटिंग पैड पर एक खाली पिंजरे में रखें। माउस की निगरानी करें जब तक कि यह सचेत न हो जाए और सामान्य रूप से एम्बुलेट न हो। सर्जरी के चार घंटे बाद, चमड़े के नीचे 0.1 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम buprenorphine इंजेक्ट करें।एक सप्ताह के लिए दैनिक माउस की सावधानीपूर्वक निगरानी करें, टांके और घाव भरने की जांच करें। सर्जरी के सात से 10 दिनों के बाद, स्टेपलर रिमूवर का उपयोग करके त्वचा स्टेपलर को हटा दें। पूंछ शिरा AAV-8 Islr इंजेक्शन जिगर में Islr के overexpression से पता चला दो सप्ताह बाद सीटू संकरण में आरएनए.AAV mRuby2 इंजेक्शन के दो सप्ताह बाद, बृहदान्त्र कैंसर organoids के एकल सेल निलंबन माउस पोर्टल नस में इंजेक्ट किया गया था। मैक्रोस्कोपिक रूप से, इस पोर्टल शिरा इंजेक्शन के परिणामस्वरूप जिगर में कई सफेद ट्यूमर नोड्यूल हुए। पोर्टल शिरा इंजेक्शन द्वारा प्रेरित कोलोरेक्टल कैंसर हेपेटिक मेटास्टेसिस के हेमटोक्सिलिन और ईओसिन स्टेनिंग ने डेस्मोप्लास्टिक स्ट्रोमल प्रतिक्रिया और परिगलन के साथ मध्यम विभेदित ट्यूबलर एडेनोकार्सिनोमा के हिस्टोपैथोलॉजी का प्रदर्शन किया।इस स्ट्रोमा-समृद्ध हिस्टोलॉजी ने मानव कोलोरेक्टल कैंसर लिवर मेटास्टेसिस को ईमानदारी से दोहराया, जिससे यह मॉडल मेटास्टैटिक ट्यूमर स्ट्रोमा की जांच करने वाले ट्रांसलेशनल शोध के लिए उपयुक्त हो गया। अल्फा चिकनी मांसपेशी एक्टिन के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स की उपस्थिति की पुष्टि की, जबकि पिक्रो-सिरियस रेड स्टेनिंग ने ट्यूमर मेसेनकाइम में प्रचुर मात्रा में एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स का प्रदर्शन किया। EPCAM के लिए Immunochemistry से पता चला है कि मेटास्टैटिक कोलोरेक्टल कैंसर ने ट्यूमर नवोदित दिखाया, जो खराब रोग का निदान कोलोरेक्टल कैंसर की एक विशेषता है।और Ki67 लेबलिंग इंडेक्स लगभग 80% था जो इंगित करता है कि अधिकांश ट्यूमर कोशिकाएं माइटोटिक रूप से सक्रिय हैं। चूहों ने पोर्टल नस में ट्यूमरोइड इंजेक्शन के बाद 57 दिनों का एक औसत अस्तित्व दिखाया। एएवी -8 Islr-उपचारित चूहों ने माउस अस्तित्व में सुधार दिखाया, ट्यूमर से विवो इमेजिंग संकेतों में कमी आई, संवर्धित हड्डी morphogenetic प्रोटीन सिग्नलिंग, और Ki67 कोशिकाओं को कम कर दिया।सुनिश्चित करें कि कपास की नोक सही इंजेक्शन साइट पर लागू की जाती है और रक्तस्राव बंद होने के बाद ही हेमोस्टैटिक स्पंज लागू किया जाता है। ट्यूमर स्थापना को आईवीआईएस इमेजिंग का उपयोग करके यह सुनिश्चित करने के लिए निगरानी की जा सकती है कि ट्यूमर कोशिकाएं जिगर के भीतर बढ़ रही हैं।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

जिगर में कोलोरेक्टल मेटास्टेसिस के उन्नत पशु मॉडल: इमेजिंग तकनीक और metastatic क्लोन का गुण

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

एक पोर्टल नस इंजेक्शन मॉडल का अध्ययन करने के लिए स्तन कैंसर का लिवर मेटास्टेसिस

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Intracarotid कैंसर सेल इंजेक्शन मस्तिष्क मेटास्टेसिस के माउस मॉडल का उत्पादन

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellular और सेलुलर फेफड़े मॉडल ट्यूमर मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

स्तन कैंसर मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण और फेफड़ों में बोझ की मात्रा निर्धारित करने के लिए वीवो इमेजिंग में पूंछ नस मेटास्टेसिस Assays और वास्तविक समय का संयुक्त उपयोग

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

ट्यूमर कोशिकाओं के पार्श्व पूंछ-शिरा इंजेक्शन के बाद फेफड़ों के मेटास्टेसिस का पैथोलॉजिकल विश्लेषण

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

लिवर कैंसर के लिए एक बायोमिमेटिक मॉडल Tunable जैव भौतिक गुणों के साथ एक 3 डी वातावरण में ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

भड़काऊ स्तन कैंसर कोशिकाओं के टेल-वेन इंजेक्शन के माध्यम से मस्तिष्क मेटास्टेसिस मॉडलिंग

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

फेफड़ों के लिए कैंसर मेटास्टेसिस की जांच के लिए एक स्थायी खिड़की

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

ऑर्थोटोपिक ओस्टियोसारकोमा और फेफड़ों के मेटास्टेसिस माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए इंट्राटिबियल ओस्टियोसारकोमा सेल इंजेक्शन

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...