Name: portal vein injection of colorectal cancer organoids to study the liver metastasis stroma
Uploaded: 2021-09-03T13:45:00
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Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del National Health and Medical Research Council (APP1156391 a D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 a D.L.W., APP1140236 a S.L.W., APP1099283 a D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project per conto dei suoi donatori e del governo statale dell'Australia meridionale attraverso il Dipartimento della Salute (MCF0418 to S.L.W., D.L.W.); una sovvenzione in aiuto per la ricerca scientifica (B) (20H03467 a M.T.) commissionata dal Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia del Giappone; AMED-CREST (Japan Agency for Medical Research and Development, Core Research for Evolutional Science and Technology (19gm0810007h0104 e 19gm1210008s0101 to A.E.); il Project for Cancer Research and Therapeutic Evolution (P-CREATE) da AMED (19cm0106332h0002 a A.E.); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (a H.K.), Takeda Science Foundation Fellowship (a H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (a H.K.), Lions Medical Research Foundation Scholarship (a K.G.).
Ringraziamo il Dr. Leszek Lisowski presso vector and genome Engineering Facility (VGEF), Children's Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIA) per la produzione di vettori AAV ricombinanti.

Tutte le procedure animali in questo articolo sono state esaminate e approvate dal Comitato etico animale del South Australian Health and Medical Research Institute (numero di approvazione, SAM322).
1. Iniezione della vena della coda del virus adeno-associato
NOTA: il virus adeno-associato (AAV) deve essere trattato come un rischio biologico secondo le linee guida di livello 1 per la biosicurezza. Si prega di fare riferimento al protocollo pubblicato per la preparazio...

In questo studio, abbiamo dimostrato che l'iniezione della vena porta di organoidi CRC di topo genera in modo riproducibile metastasi epatiche ricche di fibroblasti che imitano le caratteristiche istologiche delle metastasi epatiche CRC umane. Inoltre, se combinato con terapie dirette dallo stroma come la terapia genica mediata da AAV8, questo modello preclinico funge da strumento utile per valutare gli effetti terapeutici sulla sopravvivenza del topo e sulla crescita del tumore.
Ci sono, alme...

Il cancro del colon-retto (CRC) è una delle principali cause di mortalità per cancro in tutto il mondo1. Più della metà dei pazienti con CRC sviluppa metastasi epatiche che si verificano attraverso la disseminazione della vena porta1. Attualmente, non ci sono terapie efficaci in grado di curare metastasi epatiche avanzate e la maggior parte dei pazienti soccombe alla malattia metastatica.
La nicchia metastatica o il microambiente tumorale svolge un ruolo chiave nell'attecchimento e nella crescita delle cellule CRC disseminate2. I fibroblasti associati al cancro (CAS), un componente importante del microambiente tumorale, promuovono o frenano la progressione del cancro attraverso la secrezione di fattori di crescita, il rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) e la modulazione dei paesaggi immunitari e dell'angiogenesi 3,4,5. I CAF conferiscono anche resistenza alle chemioterapie e alle immunoterapie3. Inoltre, i CAS regolano l'inizio e la progressione delle metastasi epatiche CRC e predicono la prognosi nei pazienti con CRC 3,6,7,8. Pertanto, i fattori correlati alla CAF potrebbero essere sfruttati per lo sviluppo di strategie terapeutiche per inibire le metastasi epatiche CRC. Tuttavia, la mancanza di modelli murini soddisfacenti per studiare lo stroma tumorale metastatico è stato un grosso ostacolo allo sviluppo di terapie mirate allo stroma.
Attualmente, i modelli animali per studiare le metastasi epatiche CRC includono modelli CRC primari che sviluppano spontaneamente metastasi epatiche e modelli di trapianto di cellule tumorali nel fegato. I modelli murini CRC primari, come i modelli murini geneticamente modificati e l'iniezione del colon di cellule tumorali, raramente mostrano metastasi al fegato 9,10,11,12. Inoltre, anche se si osserva una metastasi epatica, questi modelli mostrano una lunga latenza dall'induzione del tumore primario alle metastasi e potenzialmente muoiono di carico tumorale primario12. Per generare in modo efficiente metastasi epatiche CRC, le cellule CRC coltivate vengono trapiantate nel fegato utilizzando tre approcci di iniezione: iniezione intra-splenica, iniezione intra-parenchimale diretta nel fegato e iniezione della vena porta. Le cellule tumorali iniettate per via intraschiena si diffondono nella vena splenica, nella vena porta e, infine, nel fegato13,14. Tuttavia, l'iniezione intra-splenica produce un rapporto di assunzione del tumore inferiore rispetto ad altri modelli di trapianto15,16. Con l'iniezione intra-splenica, la rimozione chirurgica della milza viene eseguita per evitare la crescita del cancro nella milza, che può potenzialmente compromettere la maturazione delle cellule immunitarie17. Inoltre, l'iniezione intra-splenica può anche provocare una crescita tumorale involontaria nella milza e nella cavità addominale18, complicando le analisi delle metastasi epatiche. L'iniezione intra-parenchimale diretta nel fegato induce efficacemente metastasi epatiche 16,19,20. Tuttavia, questo approccio non ricapitola completamente una fase biologica delle metastasi epatiche che si verifica naturalmente attraverso la diffusione della vena porta. Utilizzando l'iniezione diretta nel fegato, l'ingresso di cellule tumorali in un non-portale, ma la circolazione sistemica può anche provocare più metastasi polmonari di grandi dimensioni16. Sebbene la maggior parte dei pazienti con metastasi epatiche CRC mostri più noduli tumorali nel fegato21, l'iniezione diretta in un lobo epatico specifico genera una singola massa tumorale 19,20. L'iniezione della vena porta o l'iniezione della vena mesenterica, sebbene tecnicamente impegnativa, consente una consegna efficiente delle cellule tumorali nel fegato in un modo che ricapitola i modelli di crescita osservati nei pazienti17. Questa strategia può ridurre al minimo la possibilità di metastasi secondarie e consente una rapida crescita delle cellule tumorali nel fegato, semplificando le analisi di sopravvivenza dei topi.
Storicamente, le linee cellulari del cancro del colon-retto come MC-38 di topo, HT-29 umano e SW-620 sono state utilizzate per generare modelli murini di metastasi epatiche22,23. Tuttavia, queste linee cellulari di cancro del colon-retto non inducono una reazione stromale desmoplastica. Il basso contenuto stromale nei tumori rende difficile indagare i ruoli biologici dei fibroblasti associati al cancro. I recenti progressi negli organoidi CRC e nel loro trapianto hanno offerto piattaforme utili per valutare i ruoli vitali dello stroma nella progressione del cancro24. Il trapianto di fegato di organoidi CRC genera un microambiente tumorale ricco di fibroblasti e ha fornito nuove informazioni sulla ricerca stromale 6,25. Attualmente, l'iniezione di organoidi della vena portale o mesenterica è diventata un approccio gold standard per generare metastasiepatiche CRC 6,25,26,27,28. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, nessun documento precedente ha descritto metodi dettagliati per l'iniezione della vena porta di tumoroidi del colon-retto. Qui, presentiamo una metodologia per l'utilizzo dell'iniezione della vena porta di organoidi CRC per sviluppare una nuova terapia diretta dallo stroma mediata da virus adeno-associato (AAV).
Gli epatociti sono un importante costituente del microambiente tumorale metastatico nel fegato e svolgono un ruolo fondamentale nella progressione del cancro metastatico29. Ispirati dal successo degli approcci di terapia genica AAV per indurre l'espressione proteica negli epatociti in pazienti non neoplastici30,31, abbiamo studiato un approccio simile ma volto a modificare il microambiente tumorale del fegato in CRC25. Come tale, descriviamo anche qui l'iniezione della vena della coda di AAV8 per indurre l'espressione di proteine antitumorali per modificare il microambiente tumorale del fegato. Il sierotipo AAV8, designato dalla scelta della proteina del capside virale durante la produzione del virus, porta ad un'elevata efficienza di trasduzione in particolare degli epatociti (cioè l'espressione genica mirata nel microambiente tumorale del fegato)32. Abbiamo precedentemente dimostrato che Islr (superfamiglia di immunoglobuline contenente ripetizione ricca di leucina) è un gene specifico del CAF che induce la segnalazione della proteina morfogenetica ossea (BMP), riduce la crescita dei tumori del CRC e promuove la differenziazione delle cellule staminali intestinali Lgr5+ 25. Abbiamo testato se la sovraespressione mediata da AAV8 del gene stromale che trattiene il cancro, Islr, negli epatociti potesse attenuare la progressione delle metastasi epatiche eseguendo l'iniezione della vena porta di tumori CRC in topi trattati con AAV8-Islr.
In questo articolo, descriviamo prima la procedura di iniezione della vena della coda dell'AAV tropico epatico. Quindi, descriviamo un metodo per la preparazione delle cellule tumorali e l'iniezione della vena porta nei topi trattati con AAV. Infine, presentiamo approcci per monitorare la progressione del tumore metastatico per valutare l'efficacia delle terapie dirette dallo stroma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle</td>
			<td>TSK</td>
			<td>LDS-33013</td>
			<td>For portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 vicryl suture</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>J494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40-&#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302130</td>
			<td>Used to apply saline to the intestine after portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS*50LE</td>
			<td>Luer lock syringe for perfusion fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Isopropyl alcohol wipe</td>
			<td>Briemar</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia machine</td>
			<td>Darvall</td>
			<td>9356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0851</td>
			<td>Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>TROY</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ilium Temvet Injection, 300 &#181;g/ml Buprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Johnson&#39;s pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>HAMILTON</td>
			<td>81020</td>
			<td>For portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat box (animal warming chamber)</td>
			<td>Datesand</td>
			<td>MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic sponge</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0891-04-015</td>
			<td>Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>Talens</td>
			<td>44727000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe and needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>326769</td>
			<td>For tail vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islr probe (RNAscope)</td>
			<td>ACD</td>
			<td>450041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>988-3244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI fibrosis tool</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope kit</td>
			<td>ACD</td>
			<td>322300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-Cas9 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>024858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>PHA19042010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin staplers</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59028</td>
			<td>9 mm wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler applicator</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59026</td>
			<td>9 mm wound clip applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler remover</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59037</td>
			<td>Wound clip remover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Multigate</td>
			<td>29-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>Sentry Medical</td>
			<td>GS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical anesthesia cream</td>
			<td>EMLA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605028</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

portal vein injection of colorectal cancer organoids to study the liver metastasis stroma

Le metastasi epatiche del cancro del colon-retto (CRC) sono una delle principali cause di morte correlata al cancro. I fibroblasti associati al cancro (CAS), un componente importante del microambiente tumorale, svolgono un ruolo cruciale nella progressione del CRC metastatico e predicono una prognosi sfavorevole del paziente. Tuttavia, vi è una mancanza di modelli murini soddisfacenti per studiare la diafonia tra cellule tumorali metastatiche e CAF. Qui, presentiamo un metodo per indagare su come la progressione delle metastasi epatiche è regolata dalla nicchia metastatica e possibilmente potrebbe essere limitata dalla terapia diretta dallo stroma. L'iniezione della vena porta di organoidi CRC ha generato una reazione desmoplastica, che ha ricapitolato fedelmente l'istologia ricca di fibroblasti delle metastasi epatiche CRC umane. Questo modello era tessuto-specifico con un carico tumorale più elevato nel fegato rispetto a un modello di iniezione intra-splenica, semplificando le analisi di sopravvivenza del topo. Iniettando organoidi tumorali che esprimono luciferasi, la cinetica di crescita tumorale potrebbe essere monitorata mediante imaging in vivo . Inoltre, questo modello preclinico fornisce una piattaforma utile per valutare l'efficacia delle terapie mirate al mesenchima tumorale. Descriviamo i metodi per esaminare se la consegna mediata da virus adeno-associati di un gene stromale che inibisce il tumore agli epatociti potrebbe rimodellare il microambiente tumorale e migliorare la sopravvivenza del topo. Questo approccio consente lo sviluppo e la valutazione di nuove strategie terapeutiche per inibire le metastasi epatiche del CRC.

Per indurre la sovraespressione mediata da AAV di un gene stromale che trattiene il tumore, Islr 4,25,43,44, negli epatociti, abbiamo iniettato per via endovenosa Islr-encoding AAV8. 1,0 x 1011 genomi virali (vg) di AAV8-Islr, o come controllo, AAV8-mRuby2, è stato iniettato nella vena della coda del topo adulto (Figura 1A).<e...

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Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

L'iniezione della vena porta di organoidi del cancro del colon-retto (CRC) genera metastasi epatiche ricche di stroma. Questo modello murino di metastasi epatiche CRC rappresenta uno strumento utile per studiare le interazioni tumore-stroma e sviluppare nuove terapie dirette dallo stroma come le terapie geniche mediate da virus adeno-associate.

Iniezione di vena porta di organoidi del cancro del colon-retto per studiare le metastasi epatiche Stroma

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...

Più del 50% dei pazienti affetti da cancro del colon-retto sviluppa metastasi epatiche attraverso la disseminazione della vena porta. E gli attuali modelli animali per studiare le metastasi epatiche del cancro del colon-retto rimangono inadeguati a ricapitolare il processo biologico. L'iniezione di vena porta di tumoroidi del cancro del colon-retto fornisce un ambiente tumorale ricco di fibroblasti che consente lo studio del crosstalk tra cellule tumorali metastatiche e CAS nelle metastasi epatiche del cancro del colon-retto.Questa tecnica fornisce una piattaforma per valutare l'efficacia delle strategie terapeutiche mirate al microambiente tumorale delle metastasi epatiche del cancro del colon-retto. Questo metodo è particolarmente utile per studiare le interazioni tra CAS, cellule tumorali e microambiente tumorale. Se la punta di cotone non viene posizionata correttamente sul sito di iniezione, può verificarsi un sanguinamento eccessivo dopo la rimozione dell'ago.L'ammollo della punta di cotone si interrompe una volta individuato il sito di iniezione. Identificare la vena porta e visualizzare il sito di iniezione può essere difficile senza la dimostrazione visiva di questa procedura. Per iniziare, preparare un'area chirurgica asettica usando tende sterili su una piastra riscaldante.Inoltre, preparare tutti gli strumenti necessari per la chirurgia come descritto nel manoscritto di testo. Quindi illuminare l'area chirurgica regolando la posizione della sorgente luminosa. Successivamente, iniettare per via sottocutanea 0,1 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo di buprenorfina in un topo per la gestione chirurgica del dolore.Quindi anestetizzare il mouse e utilizzando un rasoio elettrico, radere il centro alla parte superiore dell'addome in un'area distante dall'area chirurgica asettica per evitare che i capelli contaminino il sito. Pulire il sito di incisione alternando betadine ed etanolo all'80% per sterilizzare l'area chirurgica. Ripeti tre volte.Posizionare il mouse nell'area chirurgica su una piastra riscaldante in posizione supina con mantenimento dell'anestesia isoflurano. Quindi posizionare un drappo chirurgico con un foro sull'addome. Sollevare la pelle addominale con una pinza e fare un'incisione cutanea di due o tre centimetri sulla linea mediana con le forbici, tagliando solo la pelle, assicurandosi che l'incisione vada dal medio addome al processo xifoide dello sterno e non sopra l'estremità inferiore del processo xifoide.Quindi sollevare completamente la parete peritoneale con una pinza e fare un'incisione simile di due o tre centimetri al peritoneo con le forbici. Evitare di tagliare l'intestino e il diaframma. Quindi, immergere una garza chirurgica con soluzione salina calda e posizionarla accanto all'incisione sulla destra del chirurgo.Estrarre delicatamente l'intestino tenue e crasso usando un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione salina e posizionarli sulla garza imbevuta di soluzione salina. Coprire l'intestino con un'ulteriore garza bagnata per mantenerli umidi. Quindi, tirare delicatamente l'intestino alla destra del chirurgo con la garza bagnata.Quindi applicare una leggera tensione per visualizzare la vena porta. Se la visualizzazione della vena porta è difficile, regolare delicatamente la posizione dello stomaco con un batuffolo di cotone bagnato. Dopo aver convogliato delicatamente la sospensione tumoroide più volte per ottenere una sospensione cellulare omogenea, aspirare 100 microlitri della sospensione cellulare in una siringa Hamilton o da un millilitro attaccata a un ago calibro 33, evitando bolle d'aria.Inserire lentamente la smussatura dell'ago nella vena porta con una profondità di inserimento di tre o quattro millimetri e l'angolo dell'ago quasi parallelo alla vena porta. Iniettare le cellule tumorali lentamente per oltre 30 secondi per prevenire l'occlusione della vena porta. Il colore del fegato cambia temporaneamente da rosso a bianco.Dopo l'iniezione, rimuovere lentamente l'ago e applicare immediatamente una leggera pressione sul sito di iniezione con un batuffolo di cotone asciutto per cinque minuti. Rimuovere il batuffolo di cotone e applicare immediatamente una spugna emostatica sul sito di iniezione. Tenere la spugna con un batuffolo di cotone o una pinza e applicare una leggera pressione per altri cinque minuti.Dopo cinque minuti, rimuovere la pressione sulla spugna emostatica e confermare che non vi è sanguinamento dal sito di iniezione. Se si verifica sanguinamento, eseguire immediatamente l'emostasi da pressione con un batuffolo di cotone per circa 10 minuti. Quindi applicare una spugna emostatica aggiuntiva per altri cinque minuti.Dopo aver confermato che non c'è sanguinamento, rimuovere le garze chirurgiche sull'intestino. Quindi, utilizzando una siringa riempita con cinque millilitri di soluzione salina, spruzzare la soluzione salina all'intestino per prevenire l'adesione degli organi. Posizionare delicatamente l'intestino all'interno della cavità addominale e suturare il peritoneo utilizzando 4-0 suture di poliglactina.Quindi sollevare entrambi i lati della pelle con una pinza, applicare le cucitrici per chiudere l'incisione cutanea, facendo attenzione a non pinzare l'intestino. Spegnere l'isoflurano, ma mantenere il flusso di ossigeno in funzione. Monitorare attentamente il mouse.E quando il topo si sveglia, mettilo in una gabbia vuota su una piastra riscaldante. Monitorare il mouse fino a quando non è cosciente e deambulante normalmente. Quattro ore dopo l'intervento chirurgico, iniettare per via sottocutanea 0,1 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina.Monitorare attentamente il topo ogni giorno per una settimana, controllando le suture e la guarigione delle ferite. Da sette a 10 giorni dopo l'intervento chirurgico, rimuovere le cucitrici della pelle utilizzando un dispositivo di rimozione della pinzatrice. L'ibridazione di RNA in situ due settimane dopo l'iniezione di AAV-8 Islr della vena caudale ha mostrato una sovraespressione di Islr nel fegato.Due settimane dopo l'iniezione di AAV mRuby2, sospensioni monocellulari di organoidi del cancro del colon sono state iniettate nella vena porta del topo. Macroscopicamente, questa iniezione di vena porta ha provocato più noduli tumorali bianchi nel fegato. La colorazione di ematossilina ed eosina delle metastasi epatiche del cancro del colon-retto indotte dall'iniezione della vena porta ha dimostrato istopatologia di adenocarcinoma tubulare moderatamente differenziato accompagnato da una reazione stromale desmoplastica e necrosi.Questa istologia ricca di stroma ricapitolava fedelmente quella delle metastasi epatiche del cancro del colon-retto umano, rendendo questo modello adatto per la ricerca traslazionale che indaga lo stroma tumorale metastatico. L'immunoistochimica per l'actina alfa della muscolatura liscia ha confermato la presenza di fibroblasti associati al cancro, mentre la colorazione rossa di Picro-Sirius ha dimostrato un'abbondante matrice extracellulare nel mesenchima tumorale. L'immunochimica per EPCAM ha rivelato che il cancro colorettale metastatico ha mostrato un germogliamento tumorale, che è una caratteristica del cancro del colon-retto a prognosi sfavorevole.E l'indice di marcatura Ki67 era di circa l'80%, indicando che la maggior parte delle cellule tumorali sono mitoticamente attive. I topi hanno mostrato una sopravvivenza mediana di 57 giorni dopo l'iniezione di tumoroidi nella vena porta. I topi trattati con AAV-8 Islr hanno mostrato una migliore sopravvivenza del topo, una diminuzione dei segnali di imaging in vivo dai tumori, una maggiore segnalazione delle proteine morfogenetiche ossee e una diminuzione delle cellule proliferanti di Ki67.Assicurarsi che la punta di cotone venga applicata al giusto sito di iniezione e che la spugna emostatica venga applicata solo dopo che il sanguinamento si è fermato. La creazione del tumore può essere monitorata utilizzando l'imaging IVIS per assicurarsi che le cellule tumorali crescano all'interno del fegato.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Avanzato modello animale di colorettale Metastasi nel fegato: tecniche di imaging e di proprietà di metastatici cloni

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Intracarotidea Cancer Cell iniezione per produrre modelli murini di cervello Metastasi

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Modello del polmone acellulare e cellulari per lo studio di metastasi del tumore

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

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