Name: portal vein injection of colorectal cancer organoids to study the liver metastasis stroma
Uploaded: 2021-09-03T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi'nden (APP1156391 to D.L.W., S.L.W.) hibelerle desteklenmiştir. (APP1081852 ila D.L.W., APP1140236 ila S.L.W., APP1099283 ila D.L.W.,); Kanser Konseyi SA, bağışçıları ve Güney Avustralya Eyalet Hükümeti adına Sağlık Bakanlığı (MCF0418 to S.L.W., D.L.W.); Japonya Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından görevlendirilen Bilimsel Araştırma Yardımı (B) (M.T.'ye 20H03467); AMED-CREST (Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı, Evrimsel Bilim ve Teknoloji için Temel Araştırma (19gm0810007h0104 ve 19gm1210008s0101'den A.E.'ye); AMED'den Kanser Araştırma ve Terapötik Evrim Projesi (P-CREATE) (19cm0106332h0002'den A.E.'ye); Japonya Genç Araştırmacılar için Bilimi Teşvik Yurtdışı Mücadele Programı Derneği (HK'ye), Takeda Bilim Vakfı Bursu (HK'ye), Greaton Uluslararası Doktora Bursu (HK'ye), Lions Tıbbi Araştırma Vakfı Bursu (K.G.'ye).
Rekombinant AAV vektörleri ürettiği için Vektör ve Genom Mühendisliği Tesisi'nden (VGEF), Çocuk Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nden (CMRI) (NSW, AVUSTRALYA) Dr. Leszek Lisowski'ye teşekkür ederiz.

Bu makaledeki tüm hayvan prosedürleri, Güney Avustralya Sağlık ve Tıbbi Araştırma Enstitüsü Hayvan Etiği Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (Onay numarası, SAM322).
1. Adeno ilişkili virüsün kuyruk damarı enjeksiyonu
NOT: Adeno ilişkili virüs (AAV), Biyogüvenlik Seviye 1 kılavuzları kapsamında biyolojik tehlike olarak ele alınmalıdır. Lütfen AAV hazırlama, saflaştırma ve titrasyon33 için ...

Bu çalışmada, fare CRC organoidlerinin portal ven enjeksiyonunun, insan KRK hepatik metastazlarının histolojik özelliklerini taklit eden fibroblasttan zengin karaciğer metastazlarını tekrarlayan bir şekilde ürettiğini gösterdik. Ayrıca, AAV8 aracılı gen terapisi gibi stroma yönelimli terapötiklerle birleştirildiğinde, bu klinik öncesi model, fare sağkalımı ve tümör büyümesi üzerindeki terapötik etkileri değerlendirmek için yararlı bir araç olarak hizmet eder.
...

Kolorektal kanser (KRK) tüm dünyada kanser mortalitesinin önemli bir nedenidir1. KRK hastalarının yarısından fazlasında portal ven yayılımı yoluyla ortaya çıkan hepatik metastaz gelişir1. Günümüzde, ilerlemiş karaciğer metastazını tedavi edebilecek etkili bir terapötik yoktur ve çoğu hasta metastatik hastalığa yenik düşmektedir.
Metastatik niş veya tümör mikroçevresi, yayılmış KRK hücrelerinin engraftasyonunda ve büyümesinde anahtar rol oynar2. Tümör mikroçevresinin önemli bir bileşeni olan kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'lar), büyüme faktörlerinin salgılanması, hücre dışı matrisin (ECM) yeniden şekillendirilmesi ve bağışıklık manzaralarının ve anjiyogenezin modüle edilmesi yoluyla kanser ilerlemesini teşvik eder veya kısıtlar 3,4,5. CAF'lar ayrıca kemoterapilere ve immünoterapilere direnç kazandırır3. Ayrıca, CAF'lar KRK karaciğer metastazının başlamasını ve ilerlemesini düzenler ve KRK'lı hastalarda prognozu öngörür 3,6,7,8. Bu nedenle, KRK karaciğer metastazını inhibe etmek için terapötik stratejilerin geliştirilmesinde CAF ile ilişkili faktörlerden yararlanılabilir. Bununla birlikte, metastatik tümör stromasını incelemek için tatmin edici fare modellerinin bulunmaması, stroma hedefli tedavilerin geliştirilmesinde büyük bir engel olmuştur.
Şu anda, KRK karaciğer metastazını incelemek için hayvan modelleri, karaciğer metastazı ve karaciğere kanser hücresi transplantasyon modellerini kendiliğinden geliştiren birincil KRK modellerini içermektedir. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri ve kanser hücrelerinin kolonik enjeksiyonu gibi birincil CRC fare modelleri, nadiren karaciğere metastaz gösterir 9,10,11,12. Dahası, karaciğer metastazı gözlense bile, bu modeller primer tümör indüksiyonundan metastaza kadar uzun gecikme süresi gösterir ve potansiyel olarak primer tümör yükünden ölür12. CRC karaciğer metastazlarını verimli bir şekilde üretmek için, kültürlenmiş CRC hücreleri üç enjeksiyon yaklaşımı kullanılarak karaciğere nakledilir: intra-dalak enjeksiyonu, karaciğere doğrudan intra-parankimal enjeksiyon ve portal ven enjeksiyonu. İntra-dalak enjekte edilen kanser hücreleri dalak damarına, portal vene ve nihayetinde karaciğere yayıldı13,14. Bununla birlikte, intra-dalak enjeksiyonu, diğer transplantasyon modellerine kıyasla daha düşük bir tümör alım oranı sağlar15,16. İntra-dalak enjeksiyonu ile, dalakta kanser büyümesini önlemek için dalağın cerrahi olarak çıkarılması gerçekleştirilir, bu da potansiyel olarak bağışıklık hücresi olgunlaşmasını tehlikeye atabilir17. Ayrıca, intra-dalak enjeksiyonu, dalak ve karın boşluğu18'de istenmeyen tümör büyümesine neden olarak karaciğer metastazı analizlerini zorlaştırabilir. Karaciğere doğrudan intraparankimal enjeksiyon etkili bir şekilde hepatik metastazı indükler16,19,20. Bununla birlikte, bu yaklaşım, portal ven yayılımı yoluyla doğal olarak ortaya çıkan karaciğer metastazının biyolojik bir adımını tam olarak özetlememektedir. Karaciğere doğrudan enjeksiyon kullanılarak, kanser hücrelerinin portal olmayan bir sisteme girmesi, ancak sistemik dolaşım da çoklu büyük akciğer metastazlarına neden olabilir16. KRK karaciğer metastazı olan hastaların çoğunda karaciğer21'de birden fazla tümör nodülü göstermesine rağmen, spesifik bir karaciğer lobuna doğrudan enjeksiyon tek bir tümör kitlesi oluşturur 19,20. Portal ven enjeksiyonu veya mezenterik ven enjeksiyonu, teknik olarak zor olsa da, tümör hücrelerinin karaciğere etkili bir şekilde verilmesine izin verir ve bu da hastalarda görülen büyüme modellerini özetler17. Bu strateji, ikincil bölge metastazı olasılığını en aza indirebilir ve karaciğerdeki kanser hücrelerinin hızlı büyümesini sağlayarak fare hayatta kalma analizlerini basitleştirebilir.
Tarihsel olarak, fare MC-38, insan HT-29 ve SW-620 gibi kolorektal kanser hücre çizgileri, hepatik metastaz 22,23'ün fare modellerini oluşturmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu kolorektal kanser hücre hatları desmoplastik stromal reaksiyona neden olmaz. Tümörlerdeki düşük stromal içerik, kanserle ilişkili fibroblastların biyolojik rollerinin araştırılmasını zorlaştırmaktadır. KRK organoidleri ve transplantasyonlarındaki son gelişmeler, stromanın kanser progresyonundaki hayati rollerini değerlendirmek için yararlı platformlar sunmuştur24. KRK organoidlerinin karaciğer transplantasyonu, fibroblast bakımından zengin bir tümör mikroçevresi oluşturur ve stromal araştırmalara yeni bakış açıları sağlamıştır 6,25. Günümüzde organoidlerin portal veya mezenterik ven enjeksiyonu, KRK karaciğer metastazı 6,25,26,27,28 oluşturmak için altın standart bir yaklaşım haline gelmiştir. Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, daha önce hiçbir makale kolorektal tümöroidlerin portal ven enjeksiyonu için ayrıntılı yöntemler tanımlamamıştır. Burada, yeni adeno ilişkili virüs (AAV) aracılı stroma yönelimli tedavi geliştirmek için KRK organoidlerinin portal ven enjeksiyonunu kullanmak için bir metodoloji sunuyoruz.
Hepatositler karaciğerdeki metastatik tümör mikroçevresinin önemli bir bileşenidir ve metastatik kanser progresyonunda kritik bir rol oynamaktadır29. Neoplastik olmayan hastalarda hepatositlerde protein ekspresyonunu indüklemek için AAV gen tedavisi yaklaşımlarının başarısından esinlenerek30,31, benzer bir yaklaşımı araştırdık, ancak KRK25'te karaciğer tümörü mikroçevresini değiştirmeyi amaçladık. Bu nedenle, burada karaciğer tümörü mikro ortamını değiştirmek için anti-tümörojenik proteinlerin ekspresyonunu indüklemek için AAV8'in kuyruk damarı enjeksiyonunu da açıklıyoruz. Virüs üretimi sırasında viral kapsid proteininin seçimi ile belirlenen AAV8 serotipi, özellikle hepatositlerin (yani, karaciğer tümörü mikroortamında hedeflenen gen ekspresyonu) yüksek transdüksiyon verimliliğine yol açar32. Daha önce Islr'nin (lösin bakımından zengin tekrar içeren immünoglobulin süper ailesi), kemik morfogenetik protein (BMP) sinyalini indükleyen, CRC tümöroid büyümesini azaltan ve Lgr5 + bağırsak kök hücre farklılaşmasını teşvik eden CAF'ye özgü bir gen olduğunu göstermiştik25. Hepatositlerde kanseri kısıtlayan stromal gen Islr'nin AAV8 aracılı aşırı ekspresyonunun, AAV8-Islr ile tedavi edilen farelerde CRC tümöroidlerinin portal ven enjeksiyonunu gerçekleştirerek hepatik metastaz ilerlemesini azaltıp azaltamayacağını test ettik.
Bu yazıda ilk olarak karaciğer tropik AAV'nin kuyruk veni enjeksiyon yöntemi anlatılmaktadır. Daha sonra, tümöroid hücre hazırlığı ve AAV ile tedavi edilen farelere portal ven enjeksiyonu için bir yöntem tanımladık. Son olarak, stroma yönelimli terapötiklerin etkinliğini değerlendirmek için metastatik tümör progresyonunu izlemek için yaklaşımlar sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle</td>
			<td>TSK</td>
			<td>LDS-33013</td>
			<td>For portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 vicryl suture</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>J494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40-&#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302130</td>
			<td>Used to apply saline to the intestine after portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS*50LE</td>
			<td>Luer lock syringe for perfusion fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Isopropyl alcohol wipe</td>
			<td>Briemar</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia machine</td>
			<td>Darvall</td>
			<td>9356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0851</td>
			<td>Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>TROY</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ilium Temvet Injection, 300 &#181;g/ml Buprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Johnson&#39;s pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>HAMILTON</td>
			<td>81020</td>
			<td>For portal vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat box (animal warming chamber)</td>
			<td>Datesand</td>
			<td>MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic sponge</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0891-04-015</td>
			<td>Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>Talens</td>
			<td>44727000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe and needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>326769</td>
			<td>For tail vein injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islr probe (RNAscope)</td>
			<td>ACD</td>
			<td>450041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>988-3244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI fibrosis tool</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope kit</td>
			<td>ACD</td>
			<td>322300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-Cas9 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>024858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>PHA19042010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sold by multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin staplers</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59028</td>
			<td>9 mm wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler applicator</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59026</td>
			<td>9 mm wound clip applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler remover</td>
			<td>Able Scientific</td>
			<td>AS59037</td>
			<td>Wound clip remover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Multigate</td>
			<td>29-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>Sentry Medical</td>
			<td>GS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical anesthesia cream</td>
			<td>EMLA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605028</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

portal vein injection of colorectal cancer organoids to study the liver metastasis stroma

Kolorektal kanserin hepatik metastazı (KRK) kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir. Tümör mikroçevresinin önemli bir bileşeni olan kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'lar), metastatik KRK progresyonunda çok önemli bir rol oynar ve kötü hasta prognozunu tahmin eder. Bununla birlikte, metastatik kanser hücreleri ve CAF'lar arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için tatmin edici fare modellerinin eksikliği vardır. Burada, karaciğer metastazı progresyonunun metastatik niş tarafından nasıl düzenlendiğini ve muhtemelen stroma yönelimli tedavi ile nasıl kısıtlanabileceğini araştırmak için bir yöntem sunuyoruz. CRC organoidlerinin portal ven enjeksiyonu, insan CRC karaciğer metastazlarının fibroblast bakımından zengin histolojisini sadık bir şekilde özetleyen desmoplastik bir reaksiyon üretti. Bu model, intra-dalak enjeksiyon modeline kıyasla karaciğerde daha yüksek bir tümör yüküne sahip dokuya özgüydü ve fare sağkalım analizlerini basitleştirdi. Lusiferaz eksprese eden tümör organoidleri enjekte edilerek, tümör büyüme kinetiği in vivo görüntüleme ile izlenebilir. Ayrıca, bu preklinik model, tümör mezenkimini hedef alan terapötiklerin etkinliğini değerlendirmek için yararlı bir platform sağlar. Tümör inhibe edici stromal genin hepatositlere adeno ilişkili virüs aracılı olarak verilmesinin tümör mikroçevresini yeniden şekillendirip şekillendiremeyeceğini ve fare sağkalımını iyileştirip iyileştiremeyeceğini incelemek için yöntemler açıklıyoruz. Bu yaklaşım, KRK'nın hepatik metastazını inhibe etmek için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini ve değerlendirilmesini sağlar.

Hepatositlerde tümör kısıtlayıcı stromal gen Islr 4,25,43,44'ün AAV aracılı aşırı ekspresyonunu indüklemek için, intravenöz olarak Islr kodlayıcı AAV8'i enjekte ettik. AAV8-Islr'nin 1.0 x 10 11 viral genomu (vg) veya bir kontrol olarak AAV8-mRuby2, yetişkin fare kuyruğu damarına enjekte edildi (Şekil 1A</st...

Watch this Scientific Journal Video about Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma at JoVE.com

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Kolorektal kanser (KRK) organoidlerinin portal ven enjeksiyonu stroma bakımından zengin karaciğer metastazı oluşturur. CRC hepatik metastazının bu fare modeli, tümör-stroma etkileşimlerini incelemek ve adeno ilişkili virüs aracılı gen terapileri gibi yeni stroma yönelimli terapötikler geliştirmek için yararlı bir araçtır.

Karaciğer Metastazı Stromasını İncelemek için Kolorektal Kanser Organoidlerinin Portal Ven Enjeksiyonu

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...

Kolorektal kanserli hastaların %50'sinden fazlasında portal ven yayılımı yoluyla karaciğer metastazı gelişir. Kolorektal kanser karaciğer metastazını incelemek için mevcut hayvan modelleri, biyolojik süreci özetlemek için yetersiz kalmaktadır. Kolorektal kanser tümöroidlerinin portal ven enjeksiyonu, kolorektal kanser karaciğer metastazında metastatik kanser hücreleri ile CAS arasındaki çapraz etkileşimin araştırılmasına izin veren fibroblasttan zengin bir tümör ortamı sağlar.Bu teknik, kolorektal kanser karaciğer metastazının tümör mikroçevresini hedef alan terapötik stratejilerin etkinliğini değerlendirmek için bir platform sağlar. Bu yöntem özellikle CAS, tümör hücreleri ve tümör mikroçevresi arasındaki etkileşimleri araştırmak için yararlıdır. Pamuk ucu enjeksiyon bölgesine doğru şekilde yerleştirilmezse, iğnenin çıkarılmasından sonra aşırı kanama meydana gelebilir.Pamuk ucunun ıslatılması, enjeksiyon bölgesi bulunduktan sonra durur. Portal venin tanımlanması ve enjeksiyon bölgesinin görselleştirilmesi, bu prosedürün görsel olarak gösterilmesi olmadan zor olabilir. Başlamak için, bir ısıtma yastığı üzerinde steril perdeler kullanarak aseptik bir cerrahi alan hazırlayın.Ek olarak, metin yazısında açıklandığı gibi ameliyat için gerekli tüm aletleri hazırlayın. Daha sonra ışık kaynağının konumunu ayarlayarak cerrahi alanı aydınlatın. Daha sonra, cerrahi ağrı yönetimi için deri altından kilogram vücut ağırlığı başına 0.1 miligram buprenorfin enjekte edin.Daha sonra fareyi anestezi altına alın ve elektrikli tıraş makinesi kullanarak, saçların bölgeyi kirletmesini önlemek için aseptik cerrahi alandan uzak bir alanda ortayı üst karın bölgesine tıraş edin. Cerrahi bölgeyi sterilize etmek için Betadine ve% 80 etanol ile dönüşümlü olarak kesi bölgesini temizleyin. Üç kez tekrarlayın.Fareyi cerrahi alana, izofluran anestezi bakımı ile sırtüstü pozisyonda bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirin. Sonra karnının üzerinde bir delik bulunan cerrahi bir örtü yerleştirin. Karın derisini forseps ile kaldırın ve orta hatta makasla iki ila üç santimetrelik bir cilt kesisi yapın, sadece cildi kesin, insizyonun orta karın bölgesinden sternumun ksifoid sürecine kadar değiştiğinden ve ksifoid sürecin alt ucunun üzerinde olmadığından emin olun.Daha sonra forseps ile periton duvarını tamamen kaldırın ve makasla peritona benzer iki ila üç santimetrelik bir kesi yapın. Bağırsak ve diyaframı kesmekten kaçının. Daha sonra, ılık salin ile cerrahi bir gazlı bez batırın ve cerrahın sağındaki insizyonun yanına yerleştirin.Tuzlu suyla ıslatılmış bir pamuk tomurcuğu kullanarak ince ve kalın bağırsakları yavaşça dışarı çekin ve tuzlu suya batırılmış gazlı bezin üzerine yerleştirin. Bağırsakları nemli tutmak için ek ıslak gazlı bezle örtün. Daha sonra, bağırsağı ıslak gazlı bezle cerrahın sağına yavaşça çekin.Ardından portal damarı görselleştirmek için hafif gerginlik uygulayın. Portal damarın görselleştirilmesi zorsa, midenin pozisyonunu ıslak bir pamuk tomurcuğu ile yavaşça ayarlayın. Homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için tümöroid süspansiyonu birkaç kez hafifçe boruladıktan sonra, hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini bir Hamilton'a veya 33 gauge iğneye bağlı bir mililitre şırıngaya çekerek hava kabarcıklarından kaçının.İğne eğimini yavaşça üç ila dört milimetrelik bir yerleştirme derinliği ve iğne açısı portal damara neredeyse paralel olan portal damara yerleştirin. Portal venin tıkanmasını önlemek için tümör hücrelerini 30 saniye boyunca yavaşça enjekte edin. Karaciğerin rengi geçici olarak kırmızıdan beyaza değişir.Enjeksiyondan sonra, iğneyi yavaşça çıkarın ve hemen beş dakika boyunca kuru bir pamuk tomurcuğu ile enjeksiyon bölgesine hafif bir basınç uygulayın. Pamuk tomurcuğu çıkarın ve hemen enjeksiyon bölgesine hemostatik bir sünger uygulayın. Süngeri pamuklu bir tomurcuk veya forseps ile tutun ve beş dakika daha hafif basınç uygulayın.Beş dakika sonra, hemostatik süngere basıncı çıkarın ve enjeksiyon bölgesinden kanama olmadığını onaylayın. Kanama meydana gelirse, hemen yaklaşık 10 dakika boyunca pamuklu bir tomurcukla basınç hemostazı uygulayın. Daha sonra beş dakika daha ek bir hemostatik sünger uygulayın.Kanama olmadığını doğruladıktan sonra, bağırsaklardaki cerrahi gazlı bezleri çıkarın. Daha sonra beş mililitre salin ile doldurulmuş bir şırınga kullanarak, organ yapışmasını önlemek için salini bağırsaklara fışkırtın. Bağırsakları nazikçe karın boşluğunun içine yerleştirin ve 4-0 poliglactin sütür kullanarak periton dikişini dikin.Daha sonra cildin her iki tarafını forseps ile kaldırın, cilt insizyonunu kapatmak için cilt zımbalayıcıları uygulayın, bağırsağı zımbalamamaya dikkat edin. İzofluranı kapatın, ancak oksijen akışını çalışır durumda tutun. Fareyi dikkatlice izleyin.Fare uyandığında, bir ısıtma yastığı üzerindeki boş bir kafese yerleştirin. Fareyi bilinçli olana ve normal şekilde yürüyene kadar izleyin. Ameliyattan dört saat sonra, deri altından kilogram buprenorfin başına 0.1 miligram enjekte edilir.Fareyi bir hafta boyunca günlük olarak dikkatlice izleyin, dikişleri ve yara iyileşmesini kontrol edin. Ameliyattan yedi ila 10 gün sonra, bir zımba sökücü kullanarak cilt zımbalayıcılarını çıkarın. Kuyruk damarı AAV-8 Islr enjeksiyonundan iki hafta sonra RNA in situ hibridizasyonu, karaciğerde Islr'nin aşırı ekspresyonunu gösterdi.AAV mRuby2 enjeksiyonundan iki hafta sonra, kolon kanseri organoidlerinin tek hücreli süspansiyonları fare portal venine enjekte edildi. Makroskopik olarak, bu portal ven enjeksiyonu karaciğerde çoklu beyaz tümör nodülleri ile sonuçlandı. Portal ven enjeksiyonu ile indüklenen kolorektal kanser hepatik metastazlarının hematoksilin ve eozin boyamaları, desmoplastik stromal reaksiyon ve nekroz eşliğinde orta derecede diferansiye tübüler adenokarsinomun histopatolojisini gösterdi.Bu stroma bakımından zengin histoloji, insan kolorektal kanser karaciğer metastazlarınınkini sadık bir şekilde özetledi ve bu modeli metastatik tümör stromasını araştıran translasyonel araştırmalar için uygun hale getirdi. Alfa düz kas aktininin immünohistokimyası, kanserle ilişkili fibroblastların varlığını doğrularken, Picro-Sirius kırmızı boyaması, tümör mezenkiminde bol miktarda hücre dışı matriks gösterdi. EPCAM için immünokimya, metastatik kolorektal kanserin, kötü prognoz kolorektal kanserin bir özelliği olan tümör tomurcuklanması gösterdiğini ortaya koymuştur.Ve Ki67 etiketleme indeksi yaklaşık% 80 idi, çoğu tümör hücresinin mitotik olarak aktif olduğunu gösteriyordu. Fareler, portal ven içine tümöroid enjeksiyonundan 57 gün sonra medyan sağkalım gösterdi. AAV-8 Islr ile tedavi edilen fareler, fare sağkalımının arttığını, tümörlerden in vivo görüntüleme sinyallerinin azaldığını, kemik morfogenetik protein sinyalinin arttığını ve Ki67 çoğalan hücrelerinin azaldığını gösterdi.Pamuk ucunun doğru enjeksiyon bölgesine uygulandığından ve hemostatik süngerin sadece kanama durduktan sonra uygulandığından emin olun. Tümör oluşumu, tümör hücrelerinin karaciğer içinde büyüdüğünden emin olmak için IVIS görüntüleme kullanılarak izlenebilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Bir Portal Ven Enjeksiyon Modeli Karaciğer Metastazı Meme Kanseri Eğitim için

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Intracarotid Kanser Hücre Enjeksiyon Beyin metastaz Fare modelleri üretmek için

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Ayarlanabilir Biyo-Fiziksel Özelliklere Sahip 3D Ortamda Tümör-Stroma Etkileşimlerini İncelemek İçin Karaciğer Kanseri için Biyomimetik Model

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

İnflamatuar Meme Kanseri Hücrelerinin Kuyruk-Ven Enjeksiyonu ile Beyin Metastazının Modellenmesi

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Akciğere Kanser Metastazını Araştırmak İçin Kalıcı Bir Pencere

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

Ortotopik Osteosarkom ve Akciğer Metastazı Fare Modelleri Oluşturmak için İntratibiyal Osteosarkom Hücre Enjeksiyonu

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...