Name: application of crispr interference (crispri) for gene silencing in pathogenic species of leptospira
Uploaded: 2021-08-14T15:00:00
Duration: 14 min 49 s
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美国农业部是一个机会均等的提供者和雇主。本出版物中提及商号或商业产品只是为了提供具体信息，并不意味着美国农业部的建议或认可。巴西FAPESP机构（赠款2014/50981-0）在财政上支持这项工作;LGVF 由 FAPESP （2017/06731-8 和 2019/20302-8） 提供研究金资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿编写方面没有作用。作者还感谢美国农业部视觉服务部的汉娜·希尔和亚历山大·格里姆斯拍摄和编辑视频协议。

1. 原空间器定义和质粒结构
注：本节中，介绍了选择合适的原始空间器来构建 sgRNA 和进一步结合到 pMaOri.dCas9 的第一步（图 1）。此原空间序列由 20 个核苷酸序列组成，对准所需的目标。
<ol><li>获得基因沉默感兴趣的基因的核苷酸序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）。将其提交给 CHOPCHOP 网络服务器（http://chopchop.cbu.uib.no/），在选择"Fasta 目标"后，定义了链球菌皮质Cas9 和原空间器相邻主题 NGG 的参数。将参数定义为"CRISPR/Cas9"和 PAM（原空间相邻图案）NGG。</li>
	<li>根据获得的结果，选择具有最佳分数的原空间器（绿色箭头），这些原空间器尽可能靠近编码区域的 5'end，最重要的是，包含在模板（减去）链中，因为 sgRNA 必须与基因的编码链配对才能完成基因沉默。 注：NGG 主题不包括在最后的 sgRNA 序列中。</li>
	<li>使用lipL32促进器来表达单导RNA，该RNA在5'末端包含可变20核苷酸序列和保存的dCas9脚手架序列。将 20nt 序列（称为原空间器）合并到lipL32 发起器（在其 5'端）和 sgRNA 脚手架（3'端）（图 1B）。 注：对于定义明确的 lipL32发起人，利用由-334组成的发起区域到 TSS（转录启动站点，基于朱科娃等人）。检查 补充文件 ，查看最终的 sgRNA 盒式磁带。</li>
	<li>按顺序 PCR5 生成 sgRNA 盒式磁带，或者由商业提供商合成。</li>
	<li>获得盒式磁带后，将其放入pMaOri.dCas9质粒在XmaI限制网站两端（cccggg）4。<ol>
<li>消化 sgRNA 盒式磁带和 pMaOri.dCas9 质粒与XmaI 限制酶，并继续结结（图 1B）。</li>
		<li>执行克隆步骤在 dT 辅助大 肠杆 菌菌株 +11 10，由于 pmaori11 （和延伸， pMaori.dCas9） 复制的起源， R6K-伽马. 注：有关连体和克隆选择的详细协议，请参阅费尔南德斯和纳西门托12号先前的出版物。sgRNA 引导的 dCas9 将与所选感兴趣基因的编码链结合，因此会阻碍 RNA 聚合酶拉长 （图1C），导致基因沉默。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 通过结合进行 瘦身 转化
注：此步骤的图形方案在图 2中显示。要制作 HAN 媒体和 HAN 板，请参阅霍恩斯比等人13和费尔南德斯等人。
<ol><li>在 HAN 介质 13 中，通过在1：100稀释新鲜 HAN 中的饱和培养物，在 29 或 37 °C 下生长致病性瘦素细胞;通常， L. 审讯塞罗瓦尔哥本哈根菌株菲奥克鲁兹 L1 - 130 需要 4 - 6 天才能达到适当的细胞密度。<ol>
<li>确保培养物在用于结合之前，在 420 nm（2 到 5 x 10 8 细胞/mL）处达到0.2-0.4 的 O.D.。 注：由于HAN介质随着细胞密度的增加（由于DMEM介质中所含的酚红色），离心机（4，000 x，15 分钟，室温）1 mL 的培养基介质去除瘦素，并应用超高分子作为测量 O.D. 的空白。</li>
	</ol></li>
	<li>将共生 大肠杆菌 菌株 α2163（二恶原）与含有 sgRNA 盒式磁带的质粒 pMaOri.dCas9 进行转化。对于 E. 大肠杆菌 转化，使用热冲击协议或电击。包括与质粒 pmaori. dcas9 的转换， 没有 sgrna 盒式磁带作为控制。<ol>
<li>对于热冲击转化，将质粒DNA（100 ng）与化学能力 强的大肠杆菌 细胞混合，在冰上孵育30分钟。在 42 °C 下执行 90 秒的热冲击，并再次将其放在冰上 5 分钟。通过添加 1 mL 的 LB 介质来恢复细胞，在 37 °C 下孵育 1 小时，然后继续电镀。</li>
		<li>对于电聚变，使用与100ng质粒DNA混合的电能细胞。使用以下参数进行脉冲：1.8 kV、100 Ω和 25 μF。</li>
		<li>在LB agar介质中用二氨基甲酸（DAP）（0.3 mM）和光谱霉素（40微克/mL）补充转化的供体 大肠杆菌 细胞，以选择质粒。</li>
	</ol></li>
	<li>对于结合，请在结合前一天从每个板块中选择一个菌落（这取决于监测瘦身文化的 O.D.）。<ol>
<li>从空的 pMaOri.dCas9 中选择一组 大肠杆菌 2163，从 pMaori.dCas9sgRNA 板中选择一个。允许他们在 10 mL 的 LB 加上 DAP 和光谱霉素在 37 °C 下通宵生长。</li>
		<li>第二天，稀释饱和培养物1：100在10ml的新鲜LB加DAP（不包括抗生素在这里），直到OD420nm 的0.2-0.4。通常， 大肠杆菌 达到这些密度需要 2-3 小时。</li>
	</ol></li>
	<li>在 BSL2 生物安全罩内，将直径为 25 mm、0.1 μm 孔径的混合纤维素酯膜过滤器放在玻璃底座顶部，组装过滤装置。将 15 毫升玻璃漏斗放在顶部，并夹住两个弹簧夹件。将玻璃连接到真空泵，并将培养物添加到漏斗中进行过滤。</li>
	<li>在漏斗中加入 5 mL 的 莱普托斯皮拉 文化。添加大 肠杆菌 卷，根据两种文化的 OD420nm 值构成 1：1 的比例。打开真空泵，通过过滤浓缩细胞。细胞浓度在膜过滤器中后，小心地取回。确保介质通过膜过滤。 注：过滤需要 5 到 10 分钟。</li>
	<li>将过滤器放在市售的 EMJH 板（参见 材料表）上，辅以 DAP（0.3 mM）。确保细菌侧向上。在 29 °C 下孵育板，24 小时。 注：如果使用HAN或补充内部EMJH14板，大肠杆菌可以增殖和克服预期的1：1比例，这反过来又会降低结合效率5。</li>
	<li>24 小时后，从板中回收滤镜，并将每个过滤器放入 50 mL 圆锥管中。</li>
	<li>使用 1 mL 液体 HAN 介质通过广泛的管道和涡流将细胞从过滤表面释放出来。</li>
	<li>通过暗场显微镜可视化回收的混合细菌溶液，以检查细胞的可行性和活力，以及大肠杆菌比例。 注：在这个阶段，可以看到大 肠杆菌 和 瘦多司的 等量。</li>
	<li>将这种培养物的 100-200 μL 传播到 HAN 板上，其中含有 0.4% 灭活兔血清和 40 μg/mL 光谱霉素。在 3% CO2 大气中在 37 °C 下孵育板。 注：通常情况下 ，L.询问者 血清瓦尔哥本哈根菌株Fiocruz L1-130细胞形成菌落在5-7天控制板和8-10天在光谱霉素板。在这个阶段， 大肠杆菌 不会生长，因为它们是DAB的辅助营养。</li>
	<li>作为一种对照，在104 列普托斯皮里斯/mL稀释培养物，并在没有抗生素的板上加入100微升，用于监测瘦子皮质生长。</li>
</ol>3. 殖民地选择和跨共振生长和验证
注：殖民地应该在10日之前显现出来。但是，它们不是太容易可视化。通常在这个时间点，HAN板是有点不透明，因为干燥的细胞被传播和 Leptospira 殖民地可以显示为一个透明的光环对白色背景。因此，建议从不同角度查看板块，以实现不同的光发生率，从而使菌落更加明显。在更长的孵化时间，殖民地可以获得更密集的外观，在这种情况下，它们呈现为乳白色光环在黑暗的背景。
<ol><li>在每 1.5 mL 微管中加入 100 μL 液体 HAN 介质以恢复突变体。从每个盘子中取出至少3个菌落。<ol>
<li>在微管尖的帮助下，"挖掘"了从盘子中取回菌落的阿加，因为卵石菌落可以是地下的。 注：阿加预计将在现阶段被带走。菌落应从包含空 pMaOri.dCas9 质粒的控制板和含有质粒的麻花板中取出，这些板表示 dCas9 和单导 RNA，专为目标基因设计。</li>
		<li>在 1.5 mL 微管中将收集的菌落以 100 μL 的 HAN 介质中分配，并大力实现均质化。在这个阶段，确保最大限度的打破醋的完整性释放细胞。漩涡暂停 10s 。</li>
	</ol>
</li>
	<li>通过暗场显微镜在 200-400 倍的放大倍率下，将回收的细胞可视化，在玻璃滑梯上添加 5 μL 的掉落，然后立即用盖片覆盖样品。<ol>
<li>确认从殖民地中恢复的活体和可行的卵石的存在。</li>
		<li>可视化和确认可行的瘦肉精后，将 100 μL 细胞转移到含有 40 μg/mL 光谱霉素的液体 HAN 介质中。</li>
	</ol>
</li>
	<li>液体HAN介质生长后，评估质粒的存在与引物pMaori2 F（ACGCAATTATCGATACCGAC）和R（阿塔格特加格塔格CCCC）的存在，承认区域侧翼的sgRNA盒式磁带。<ol>
<li>收集 200 μL 的培养物、离心机（4，000 x g，15 分钟），丢弃超高颗粒，并将产生的颗粒重新注入 20 μL 水中。</li>
		<li>使用此悬架作为模板进行额外的 PCR，无需 DNA 提取12。 注：与含有质粒的细胞相比，pMaOri.dCas9 的细胞将呈现 281 bp 的放大器，而含有质粒的细胞将呈现 723 bp 的放大器。</li>
	</ol>
</li>
	<li>为了确认基因沉默，使用只含有pMaOri.dCas9（负控制）和pMaOri.dCas9sgRNA的转构剂的细胞提取物进行免疫膨胀。<ol>
<li>应用相当于5×107 细胞每车道的硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶。</li>
		<li>电传蛋白到膜上，用适当的抗体孵化。除了对目标基因的抗体进行沉默外，还要使用另一种抗体进行加载控制。</li>
	</ol>
</li>
	<li>保持HAN媒体中的突变文化加上光谱霉素，以保持质粒。如果没有抗生素应用于介质，可以观察到至少三段5的基因沉默。</li>
</ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-temperature+protein+G+is+an+essential+virulence+factor+of+Leptospira+interrogans.">High-temperature protein G is an essential virulence factor of Leptospira interrogans.</a> Infections and Immunity. 82 (3), 1123-1131 (2014).</li><li>Lambert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlaA+proteins+in+Leptospira+interrogans+are+essential+for+motility+and+virulence+but+are+not+required+for+formation+of+the+flagellum+sheath.">FlaA proteins in Leptospira interrogans are essential for motility and virulence but are not required for formation of the flagellum sheath.</a> Infections and Immunity. 80 (6), 2019-2025 (2012).</li><li>Murray, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptospira+interrogans+requires+heme+oxygenase+for+disease+pathogenesis.">Leptospira interrogans requires heme oxygenase for disease pathogenesis.</a> Microbes and Infections. 11 (2), 311-314 (2009).</li><li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence.">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathogens. 3 (7), 97 (2007).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptospiral+flagellar+sheath+protein+FcpA+interacts+with+FlaA2+and+FlaB1+in+Leptospira+biflexa.">Leptospiral flagellar sheath protein FcpA interacts with FlaA2 and FlaB1 in Leptospira biflexa.</a> PLoS One. 13 (4), 0194923 (2018).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. 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作者没有什么可透露的。

在对病原体15、16、17、18和沙氏19种瘦素进行早期测序后，基因组数据挖掘揭示了瘦素发病机制的几个方面。在大多数情况下，蛋白质功能是利用假定表面暴露蛋白的重组对应物和随后对原生蛋白质功能20 、 21 、 22 、 23 、 24 、 25 、 26的推测来探索的。 
突变体的生成和各自表型的评价是功能基因组分析的关键组成部分。最初尝试在Leptospira spp.中产生突变体是通过随机突变体27，28，29，30实现的：然而，经过广泛和艰苦的分析，推断被破坏的基因的身份，它注意到，只有15%的所有基因在L.审讯者血清瓦马尼拉被中断27。目标基因敲除是进一步实现同源重组利用自杀质粒提供抗生素耐药性盒式侧翼同源武器在所需的目标31，32。
通过应用这些技术，探索了瘦素基础生物学和毒性的几个方面，分别探索了31、33、34、35、36、37。大肠杆菌-瘦素结合梭载体pMaOri 11的研制，使表皮基因沉默的成分得以传递。
先前已经表明，Cas9诱导的双链断裂对Leptospira spp.是致命的，作为替代，酶的催化不活性变异dCas9可用于在沙普罗菲和致病物种4，5中实现基因沉默。通过使用质粒 pMaOri.dCas9 作为 sgRNA 盒式结结的骨干，可以由于 dCas9 和 sgRNA 的表达而获得特定和稳定的基因沉默：dCas9 绑定 sgRNA 将引导蛋白质通过沃森 - 克里克碱基配对达到预期目标。
对于完整的基因沉默，原空间器应根据所需基因的模板链进行设计，以便 sgRNA 的基础配对与编码链发生。根据 Leptospira spp. 中 35% 的平均 C+G 含量，PAM 5'-NGG-3' 将至少每 100 bp 发生 3 次。因此， 在瘦子皮拉 的基因组中，几乎任何基因都将包含至少一个PAM。但是，如果找不到主题 NGG，则可以评估替代的 NAG 主题。
以前的基因沉默技术，如锌手指和TALE（转录活化剂样的效应器），依赖于每个目标的一种不同的蛋白质的构建，使这些技术费力和昂贵的38。在CRISPRi的情况下，可变组件是sgRNA，因此只需要在5'末端更改20个基点。不仅在Leptospira第4、5页，而且在其他细菌8，39，40，41中观察到了完整、稳定和有针对性的基因沉默。
HAN介质13的发展有利于突变体的恢复，通过大幅缩短细胞群形成的孵化时间，并允许Leptospira在37°C生长。 然而，在结合过程中，不建议使用大肠杆菌，因为大肠杆菌可以在此介质中大力增殖，并克服供体细胞和受体细胞之间的预定1：1比例。在这个阶段，EMJH 加 DAP 是更好的选择，因为大肠杆菌在这个媒体中复制不良。值得一提的是，一些实验室内部补充了EMJH，其中可以包含额外的组件，可能也支持大肠杆菌细胞的生长。
这里提出的结合协议是优化为 L.审讯 塞罗瓦尔哥本哈根尼菌株Fiocruz L1-130，它也被证明是有效的转化最近分离的致病菌株从土壤样本5。最初尝试与 L.博格佩特塞尼 物种的不同血清，表明较低的结合效率与上述协议。因此，在与 Leptospira的不同物种/细胞人合作时，应根据供体：受体细胞比例、初始细胞密度、结合介质和时间（24和48小时）以经验方式确定构思的最佳条件。有理由假设不同的 利普托斯皮拉 物种和血清动物的行为会因不同的结合协议而不同。
尽管沙普罗皮 拉 菌落在板块上相对容易想象，但致病菌落可能更难观察。通常，通过使用 HAN 介质补充 0.4% 兔血清和光谱霉素，可以在第 10 天观察到变异菌落。根据我们的经验，殖民地最初是媒体表面的透明光环。在视频协议中，密集的殖民地，经过14天的生长，显示，因为透明的很难拍摄。在这个阶段，旋转板块以实现不同的光发生率，并在白色和黑暗背景之间移动，可以帮助识别殖民地。
对于突变验证，免疫印迹提供了一种简单明了的方法：然而，由于抗体并不总是针对目标蛋白质可用，可以采取替代策略来验证基因沉默。使用目标基因引数的定量反转录酶 PCR （qRT-PCR） 和构成控制可以有效地验证基因沉默，因为 sgRNA 引导的 dCas9 负责基因转录的阻塞。如果目标基因编码蛋白质凝胶中明确定义的蛋白质带，SDS-PAGE可以证明沉默，并根据 lipL32基因沉默5。如果 LPS 生物合成基因被静音，可以使用 LPS 染色：在沉默基因编码与定义明确的基质的酶的情况下，动能测定与染色基质是有效的策略：L. biflexa 的β-伽拉西达斯沉默通过使用 X-gal 和 ONPG（正交-硝基-β-加拉克托赛德）基材4来验证。
在确认基因沉默后，可以设计实验来进一步评估表型。在沉默细菌粘合剂的情况下，可以进行绑定分析;血清挑战分析证实了利加和利格B在致病性瘦素5所表现的血清存活中的作用。突变体还可用于给动物接种疫苗，以评估毒性的衰减：在这种情况下，与突变体接种的动物应与仅含有 pMaOri.dCas9 的细胞感染者进行比较。
最后，目前的协议描述了CRISPR在致病性 瘦肉 精物种中应用CRISPR基因沉默，使用HAN介质促进突变恢复在10天内。基因沉默与功能基因组分析相结合，将增进我们对 瘦素致病机制的理解，并最终导致制定更好的疾病控制预防策略。

瘦素螺旋体病是由莱普托斯皮拉属的致病性和毒性物种引起的被忽视的全球性动物病。在人类中，这种疾病占全球每年100多万例病例和6万例死亡。到目前为止，还没有针对这种疾病的长期和有效的疫苗。确定毒性因素和致病机制对于制定更好的治疗和预防策略至关重要。因此，产生基因突变和评估结果表型的能力对功能基因组分析至关重要。
迄今为止，一直认为在致病性 瘦 肉细胞中构建突变体本身效率低下、费力、成本高昂且难以实施。随着最近CRISPR干扰（CRISPRI）应用于沙可预防4 和致病性5 瘦素，这种情况发生了巨大变化。
基因沉默是通过两个组件的表达实现的： CRISPR/Cas 的变体（c光泽regularly interspaced short p阿林德罗米奇repeat /CRISPR作为社交） en 来自链球菌皮质的Cas9酶，称为催化死亡Cas9（dCas9）和单导RNA（sgRNA），可以根据所需的目标6，7，8进行编辑。dCas9蛋白，当与sgRNA结合时，由沃森和克里克碱基配对定向到特定的DNA靶点，导致RNA聚合酶拉长的模具阻塞，导致基因沉默，由于受阻的基因转录7（图1）。
这份手稿旨在描述质粒的构造，用于表达dCas9和sgRNA，捐赠者 大肠杆菌 β2163和接受者 Leptospira 细胞之间的结合，变异体恢复，最后验证选定的突变菌落。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m pore size mixed cellulose esters membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>VCWP02500</td>
			<td>Filtration for bacterial conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-Diaminopimelic acid (DAP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1377</td>
			<td>Growth of auxotrophic E. coli &#946;2163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Noble</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214230</td>
			<td>Used for preparation of solid EMJH and HAN plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used for preparation of solid LB plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL substrate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10297-018</td>
			<td>dNTPs for PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microanalysis Filter Holder</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX1012530</td>
			<td>Filtration for bacterial conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td>Chemiluminescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>244620</td>
			<td>Lysogenic liquid medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>279510</td>
			<td>Supplementation of EMJH media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Medium Base EMJH</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>279410</td>
			<td>EMJH medium for Leptospira</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN TGX Gels 12%</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4568043</td>
			<td>Used for polyacrylamide gel eletrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical density reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M2</td>
			<td>For optical density measurements of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 7.4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td>Saline solution for washing bacterial pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0692</td>
			<td>Selection of pMaOri backbone plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0402</td>
			<td>Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Used for PCR reaction cycling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine (dT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9250</td>
			<td>Growth of auxotrophic E. coli &#960;1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XmaI restriction enzyme</td>
			<td>New Englan BioLabs</td>
			<td>R0180L</td>
			<td>Digestion of plasmids and inserts</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of crispr interference (crispri) for gene silencing in pathogenic species of leptospira

瘦身症是一种全球被忽视的动物病，每年至少造成100万例病例和近6万例死亡。这种疾病是由利普托斯皮拉属的致病性和毒性细菌引起的，要么直接接触细菌，要么间接接触受污染的水或土壤。家畜和野生动物充当感染的蓄水池宿主，通过尿液将肾脏的殖民肾管中的瘦子脱落到环境中。瘦肉精突变菌株的产生对于评估和理解感染的致病机制至关重要。CRISPR干扰（CRISPRi）已被证明是一个简单，负担得起的，和特定的工具，基因沉默在致病性瘦素。因此，将描述获得含有 dCas9 和引导 RNA 的质粒构造、通过与大肠杆菌菌株 α2163 结合将质粒输送到瘦素的方法细节，以及转造恢复和评估。此外，最近描述的霍恩斯比-阿尔特-纳利（HAN）介质允许相对快速地隔离和选择阿加板块上的突变菌落。

尽管 莱普托斯皮拉 基因组中的CG含量通常在35%左右：几乎每个基因都可能含有PAM 5'NGG 3'：这个主题需要在模板链中考虑。根据 CHOPCHOP 结果输入基因的编码序列（从头到尾）后，必须在减 （-， 模板） 链中选择原空间器。重要的是不要在 20 nt sgRNA 原空间器中包括 NGG 图案。
如果结合1：1捐赠者：接受细胞比例，在EMJH琼脂板加DAP表面24小时，200微升的回收细菌悬浮扩散到HAN加光谱霉素琼脂板，交叉结合菌落应在大约8-10天内可见。这个体积的扩散通常导致每盘20-40个菌落（图3A）。为了检查结合后细胞的生存能力，细胞可以扩散到HAN板上，无需选择抗生素。在这种情况下，殖民地可以观察到，只要7天。HAN 板在 3% CO2 大气中变淡黄色。
在液体介质加上光谱霉素的菌落采摘和生长后，使用全细胞和pMaOri2引物的PCR可用于对转构体进行初始质量检查（图3B）。含有对照pMaOri.dCas9质粒的瘦身细胞应产生281个基点的放大剂，而含有质粒的细胞，即含有dCas9和sgRNA的细胞，应产生723个基点的安培。pMaOri2 F 和 R 引物设计为侧翼 XmaI 限制站点，这是 sgRNA 盒式磁带连体期间使用的站点。
确认质粒的存在后，细胞可以从介质中采集，用PBS洗两次，然后用于准备用于免疫印迹的全细胞提取物。如果沉默发生，目标蛋白，在这种情况下，无论是LipL32或LigA和LigB，只应观察到野生类型细胞和那些含有pMaOri.dCas9：即使暴露时间较高，在含有pMaOri.dCas9sgRNA（图3C）的细胞中也不应看到相应的蛋白质。
如果计划进行基因沉默后评估瘦素毒性的实验，用于结合的培养物应该是低通量毒性 瘦素。基因沉默被确认后，可以冻结几个阿利库特作为备份。如果沉默基因具有可测量的表型，例如，根据以前对重组蛋白的工作，培养物可用于验证，在这种情况下，仅包含 pMaOri.dCas9 的细胞可以作为负对照。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62631/62631fig01.jpg"> 图1：在目标基因的模板链中选择dCas9和sgRNA表达质粒（A）一个20nt长的原生空间器，然后是S.pyogenes dCas9 PAM 5'-NGG-3'，因此随后的sgRNA可以执行沃森和克里克碱基配对到相应的编码链，从而产生完整的基因沉默。（B） sgRNA 盒式磁带由lipL32发起器、20nt 原空间器和 dCas9 脚手架组成。pMaOri.dCas9 质粒用作XmaI 限制站点 sgRNA 盒式连带的骨干。由此产生的质粒，称为pMaOri.dCas9sgRNA被输送到瘦子，dCas9和sgRNA的表达是基因沉默的原因。（C） sgRNA 定向 dCas9 作为 RNA 聚合酶拉长的物理屏障，因此会阻碍转录。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/62631fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62631/62631fig02.jpg"> 图2：结合协议的示意图表示。所需的Leptospira物种生长在HAN介质中，在搅拌下，直到在420纳米的0.2-0.4（中日相）的O.D.。在结合的前一天，从LB+DAP+Spc琼脂板中挑选出一群重组捐赠者大肠杆菌β2163，这些细胞在液体LB中生长过夜，并辅以同样的补充剂。第二天，饱和E.大肠杆菌培养物在 Lb 加 Dap 中稀释， 生长到 420 nm 的 O.2-0.4。捐赠者大肠杆菌和受体Leptospira均在负压下被过滤装置以1：1细胞比例混合到0.1μm过滤器表面。然后，过滤器被放置在 EMJH 琼脂板的顶部，辅以 DAP，孵化在 29 °C 下进行 24 小时的孵化。 EMJH的使用限制了大肠杆菌的扩散，并维持了预定的1：1比例。细菌通过用 1 mL HAN 介质从过滤器中回收，悬架在暗场显微镜下可视化。最后，每个悬浮的100-200微升被播种到HAN Agar板含有0.4%的兔血清，并在37°C的3%CO2孵育。在这个阶段，DAP被省略，因此，辅助性大肠杆菌不会生长。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/62631fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62631/62631fig03.jpg"> 图3：突变体评价的代表结果。（A ）含有瘦肉精的板块的菌落，用空pMaOri.dCas9（进一步实验的负控制）和质粒pMaOri.dCas9sgRNA（目标基因沉默）被采摘，在液体HAN中大力同质化，在含有幽灵霉素的液体HAN中生长。重组细胞可以通过 PCR 验证，在 pMaOri.dCas9 内的XmaI 站点两侧有引数。（B） 在这种情况下，含有pMaOri.dCas9的细胞只产生281个基点的安培，而含有质粒的沉默细胞，含有dCas9和sgRNA，则显示为723个基点的安培。在确认质粒的存在后，通过免疫膨胀分析验证了基因沉默。（C） 建议对靶蛋白和负载控制蛋白进行抗体孵化：在具有代表性的免疫博客中，单独显示含有 pMaori.dCas9 的转细胞提取物，或以lipL32 （pMaori.dCas9sgRNALALL32） 和 LigA 和 LigB （pMaori.dCas9sgRNALALLIGAB） 基因为目标的 sgRNA 盒式磁带。与抗利普L32、抗利巴布和抗利普L41（非靶点、加载控制）共同孵化证实，含有pMaori.dCas9sgRNALALL32的细胞中，利普L32蛋白的表达被废除，含有pMaori.dCas9sgRNALALL32的细胞中，LigA和LigB在含有pMaori.dCas9sgRNALIGAB的细胞中同时被废除。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/62631fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
补充文件：单导RNA（sgRNA）盒式磁带序列。 sgRNA 转录由构成 lipL32 发起人（粗核苷酸）定向。sgRNA由20个核苷酸组成，指原位空间器，负责与目标基因的编码链和dCas9脚手架序列（下划线核苷酸）进行碱基配对。 XmaI 限制站点 （cccggg） 包含在 pmaori. dCas9 质粒的两端结结。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/Supplementary%20File.docx" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>

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Application of CRISPR Interference CRISPRi for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

在这里，描述了CRISPR干扰（CRISPRI）对 瘦身 物种中特定基因沉默的应用。 瘦素 细胞通过与表达 dCas9（催化"死亡"Cas9） 的质粒结合而发生转化，以及单导RNA （sgRNA），负责与所需的基因组目标进行碱基配对。提出了验证基因沉默的方法。

CRISPR干扰（CRISPRI）在瘦素病原物种中基因沉默的应用

Leptospirosis is a global neglected zoonosis, responsible for at least 1 million cases per year and almost 60 thousand deaths. The disease is caused by ...

我叫贾拉思·纳利，我是爱荷华州艾姆斯市国家动物疾病中心的研究小组的成员，我们致力于瘦身病的研究。肺螺旋体病是一种被忽视的疾病。这是一种全球性疾病。实际上，我们对这些独特的细菌组是如何引起感染的了解非常有限。因此，今天的介绍是提供一个新的工具的概览，这是可用的，以促进评估瘦素螺旋体病的致病机制，特别是沉默由瘦素皮拉表达的特定基因，使用一种称为CRISPR干扰的技术。然而，选择牛顿殖民地的能力在很大程度上取决于为这些挑剔的瘦子提供最好的生长介质。所以，首先，我们将向你介绍里克霍恩斯比，谁非常简短地介绍了一个新的媒体，以传播这些挑剔的细菌。然后，我们将向您介绍路易斯·费尔南德斯，他将讨论CRISPR干扰方法，以压制瘦身内的目标基因。嗨，我是里克·霍恩斯比自从100多年前由阿纳达鉴定以来，瘦子皮拉通常被分离出来，在29摄氏度下繁殖，这种温度既不能反映环境，也不能反映哺乳动物的体温。10年前，美国农业部ERS开始研究瘦子媒体的改进，从这项研究中，霍恩斯比-阿尔特-纳利媒体得到了发展。利用这种媒介，临床医生和研究人员能够更迅速地从外地病例中分离和传播瘦素，并在温度和更类似于哺乳动物宿主的环境中进行体外研究。我们继续优化这种媒体，但就目前情况而言，HAN已显示出显著改善兽医和人类体外临床隔离以及开发更有效的预防瘦虫病疫苗的潜力。嗨，我是路易斯·费尔南德斯迄今为止，对瘦素螺旋体病的发病机制仍然缺乏探索，这主要是由于缺乏有效和容易执行的遗传管。在这里，我们将描述一种新技术称为CRISPR干扰或CRISPR。这种技术非常简单，因为我们只需要表达两个成分，一个DNA结合蛋白称为死Cas9，或dCas9，和一个幻想RNA分子称为单导RNA。复杂的dCas9和引导RNA将使我们的目标基因进行碱基配对，从而减少甚至阻止转录。此外，通过使用新描述的HAN介质，我们可以大幅缩短突变恢复的菌落形成时间。第一步是定义指南 RNA 中将包含的原空间器。这个序列由20个核苷酸组成，这些核苷酸将定义与所需基因目标的碱基配对。向 Web 服务器 CHOPCHOP 提交核苷酸序列，其参数定义为链球菌、Cas9 和原空间器相邻主题 NGG。根据结果，选择在负趋势中得分最高的原空间器。NGG 主题将不包括在最后序列中。我们一直在使用lipL32促进器来表达单导RNA，该RNA将在保存的dCas9脚手架上以五金的速度包含可变的20核苷酸。获得盒式磁带后，它将被降级到PMaOri。dCas9 质粒在 Xma1 限制站点。对于共生瘦细胞生长在29或37摄氏度的HAN介质。在结合的前一天，捐赠者均衡细胞生长在LB介质中，辅以二氨基酸、DAP和光谱霉素。接下来， 在结合的日子烧烤饱和的大肠杆菌文化在 Lb 加 Dap 。在生物安全罩内，将膜过滤器放在玻璃底座顶部，然后组装过滤装置，然后组装 15 毫升玻璃漏斗。这两件作品都由这个春天的夹子夹在一起。然后将玻璃连接到真空泵，在漏斗中加入五毫升的瘦子。接下来，添加含有感兴趣的质粒的E.Coliβ 2163菌株。音量会因文化的光学密度而异。我们的目标是一对一的细胞吹笛。转动真空泵，现在液体，我们将通过膜和细胞将集中在它的顶部。采取过滤器，并把它放在EMJH板加上DAB，双库里尔侧向上。在29摄氏度下孵育板24小时。然后从板中回收过滤器，并将其放入 50 ML 圆锥管中。使用一毫升液体HAN介质通过管道从过滤器中回收细胞。通过暗场显微镜可视化恢复的细胞。在这个阶段，可以看到大肠杆菌和瘦小肠杆菌的等量。100 到 200 微升用于将细菌传播到含有光谱霉素的 HAN 板上。在这个阶段，DAP被省略，大肠杆菌不会生长。板块孕育在37摄氏度和3%的二氧化碳。殖民地应在8至10天之间显现出来。莱普托斯皮拉审讯殖民地是有点棘手的可视化。在这里，我们展示过度生长的殖民地，使其更容易看到他们。加入100微升液体HAN，加入1.5ML管，用于恢复突变体。建议从每个盘子中至少取出三个菌落。使用移液器尖端，从盘子中取回各个菌落。阿格尔预计将被单独带走。殖民地应从含有MTP PMaori的控制板中取出。dCas9 质粒。和板与瘦素含有质粒与 dcas9 和指导 RNA 专为目标基因设计。恢复的细胞现在可以在暗场显微镜下可视化，以确认存在离开可行的瘦肉精。离开瘦素可视化后，将细胞转移到含有光谱霉素的液体HAN介质中。培养后生长，细胞现在可以恢复沉默确认和表型评估。如果对目标蛋白质的抗体可用，免疫膨胀是一种直截了当的方法来评估沉默。含有 pMAOri 的利普托斯皮拉。dCas9 单独，或与指南RNA卡斯由 PCR 评估，木侧引。DMT质粒将产生大约300个碱基对的带子，当有引导RNA盒式磁带时，只能达到大约700个底座对。使用全细胞提取物进行免疫膨胀进行沉默确认，在含有dCas9表达质粒的细胞中废除lipL32蛋白质表达，并引导RNA瞄准该基因。并且链接 A 和链接 B 都不存在包含引导 RNA 的细胞，这是两个基因的特异性。控制唇41可以在所有车道上看到。因此，我们使用了CRISPR干扰瘦素审讯，我们也使用它对几个额外的致病物种的瘦素。我们用它来压制特定的基因，以及沉默小非编码RNA的表达。我们的研究兴趣在于了解感染的致病机制，因此我们通常会寻找识别差异因素，但很明显，您可以根据自己的研究领域来静音自己的选择基因。例如，这可能是活力或理解瘦素如何坚持在环境中，或新陈代谢。在任何情况下，你应该能够产生一个特定的突变体，让你执行功能基因组学，并了解有关基因的生物学意义。因此，从我们所有在国家动物疾病中心，我们祝你最好的运气与你的研究。

Research

JoVE Journal

Genetics

Application of CRISPR Interference (CRISPRi) for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

选择依赖和独立生成CRISPR / Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

科研

遗传学

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

CRISPR/Cas9 和 SsODN 在人细胞中催化点突变修复功能的标准方法研究

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9 蛋白注射到沟鲶、鮰松毛虫、基因编辑的胚胎

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

整合酶缺陷慢病毒载体载体的制备及其在细胞 CRISPR/Cas9-mediated 基因敲除中的表达

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

杆状病毒基因治疗应用的生产与纯化

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 对小鼠和人造血祖细胞的高效基因破坏

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR 的染色质环结构重组

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 基因编辑制作人类疟疾寄生虫的条件突变体

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

基于多重 CRISPR 增强器的细胞系干扰增强功能解剖

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

使用基因激活 crispr 过度表达长非编码 rna

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...