Name: application of crispr interference (crispri) for gene silencing in pathogenic species of leptospira
Uploaded: 2021-08-14T15:00:00
Duration: 14 min 49 s
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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

रोगजनक15, 16, 17, 18और सैप्रोफाइटिक19 लेप्टोस्पेरा प्रजातियों के प्रारंभिक अनुक्रमण के बाद, जीनोम के डेटा खनन ने लेप्टोस्पाइरल रोगजनकों के कई पहलुओं पर प्रकाश डाला। ज्यादातर मामलों में, ख्यात लेप्टोस्पाइरल सतह से उजागर प्रोटीन के पुनर्संयोजन समकक्ष और उसके बाद देशी प्रोटीन समारोह20, 21, 22, 23,24,25,25,26के पुनर्संयोजन समकक्ष का उपयोग करके प्रोटीन समारोह का पतालगायागया था। 
म्यूटेंट की पीढ़ी, और उनके संबंधित फेनोटाइप का मूल्यांकन, कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के प्रमुख घटक हैं। लेप्टोस्पिरा एसपीपी में म्यूटेंट उत्पन्न करने के प्रारंभिक प्रयास यादृच्छिक ट्रांसपोसनम्यूटेनेसिस27,28, 29,30द्वारा प्राप्तकिएगए थे। हालांकि, बाधित जीन की पहचान का अनुमान लगाने के लिए व्यापक और श्रमसाध्य विश्लेषण के बाद, यह नोट किया गया कि एल इंटररोजन सेरोवर मनीला में सभी जीनों में से केवल 15%27बाधित थे । लक्षित जीन नॉकआउट को31,32के भीतर समरूप हथियारों से घिरे एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट देने के लिए आत्मघाती प्लाज्मिड्स का उपयोग करते हुए रीकॉम्बेशन द्वारा और अधिक हासिल किया गया था ।
इन प्रौद्योगिकियों को लागू करके, लेप्टोस्पायरल बेसिक बायोलॉजी और उग्रता के कई पहलुओं का पता लगाया गया31,33,34,35, 36,37. ई. कोलाईके विकास -लेप्टोस्पाइरा कंजूगेटिव शटल वेक्टर, pMaOri 11,एपिसोमल जीन साइलेंसिंग के लिए घटकों के वितरण की अनुमति दी।
यह पहले दिखाया गया था कि Cas9-प्रेरित डबल-स्ट्रैंड ब्रेक लेप्टोस्पायरा एसपीपी के लिए घातक है। और, एक विकल्प के रूप में, एंजाइम के उत्प्रेरक निष्क्रिय संस्करण, dCas9, दोनों सप्रोफिटिक और रोगजनक प्रजातियों4, 5में जीन मुंह को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। sgRNA कैसेट लिगेशन के लिए एक रीढ़ के रूप में प्लाज्मिड pMaOri.dCas9 का उपयोग करके, dCas9 और sgRNA दोनों की अभिव्यक्ति के कारण विशिष्ट और स्थिर जीन चुप्पी प्राप्त की जा सकती है; dCas9-बाउंड sgRNA वाटसन-क्रिक बेस पेयरिंग द्वारा वांछित लक्ष्य के लिए प्रोटीन का नेतृत्व करेंगे ।
पूर्ण जीन मुंह के लिए, प्रोटोस्पेसर वांछित जीन के टेम्पलेट स्ट्रैंड के आधार पर डिजाइन किया जाना चाहिए ताकि sgRNA की आधार बांधना कोडिंग स्ट्रैंड के साथ होता है । लेप्टोस्पिरा एसपीपी में 35% की औसत सी + जी सामग्री के आधार पर, पीएपी 5'-एनजीजी-3' हर 100 बीपी में कम से कम 3 गुना हो जाएगा। इसलिए, लेप्टोस्पायरा के जीनोम के भीतर लगभग किसी भी जीन में कम से कम एक पाम शामिल होगा। हालांकि, यदि आदर्श एनजीजी नहीं मिला है, तो वैकल्पिक नाग आकृति का मूल्यांकन किया जा सकता है।
पिछले जीन चुप्पी तकनीकों, जैसे जस्ता उंगलियों और कहानी (प्रतिलेखन सक्रियक की तरह प्रभावक), प्रत्येक लक्ष्य के लिए एक अलग प्रोटीन के निर्माण पर भरोसा किया, इन तकनीकों श्रमसाध्य और महंगा३८बना । CRISPRi के मामले में, वेरिएबल कंपोनेंट sgRNA है, जिससे केवल 5 ' अंत में 20 बीपी को बदलना आवश्यक हो जाता है । पूर्ण, स्थिर और लक्षित जीन मुंह से न केवल लेप्टोस्पायरा एसपीपी में देखा गया है।4,5,बल्कि अन्य बैक्टीरिया8,39,40, 41में भी।
हान मीडिया13 के विकास ने कॉलोनी गठन के लिए इनक्यूबेशन समय को काफी कम करके म्यूटेंट की वसूली का पक्ष लिया और लेप्टोस्पायरा को 37 ओसी में बढ़ने की अनुमति दी। हालांकि, संयुग्मण चरण के दौरान, इसके उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि ई. कोलाई इस मीडिया में तेजी से पैदा हो सकता है और दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के बीच इच्छित 1:1 अनुपात को दूर कर सकता है। इस स्तर पर, EMJH प्लस डीएपी बेहतर विकल्प है, क्योंकि ई. कोलाई इस मीडिया में खराब दोहराने । यह उल्लेखनीय है कि कुछ प्रयोगशालाएं इन-हाउस पूरक ईएमजेएच बनाती हैं, जिसमें अतिरिक्त घटक हो सकते हैं जो ई कोलाई कोशिकाओं के विकास का भी समर्थन कर सकते हैं।
यहां प्रस्तुत संयुग्म प्रोटोकॉल एल इंटररोगेन्स सेरोवर कोपेनहेगनी तनाव फियोक्रूज़ एल 1-130 के लिए अनुकूलित किया गया था, और यह मिट्टी के नमूनों से हाल ही में अलग रोगजनक तनाव के परिवर्तन में प्रभावी साबित भी हुआ था5। एल बोर्गपेटेरसेनी प्रजातियों के विभिन्न सेवरों के साथ प्रारंभिक प्रयास वर्णित प्रोटोकॉल के साथ कम संयुग्म क्षमता का संकेत देते हैं। इस प्रकार, लेप्टोस्पाइराकी विभिन्न प्रजातियों/सेवरों के साथ काम करते समय, संयुग्मण के लिए इष्टतम स्थितियों को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए, दाता पर विचार करते हुए: प्राप्तकर्ता सेल अनुपात, प्रारंभिक सेल घनत्व, संयुग्मण मीडिया और समय (24 और 48 घंटे) । यह मानना उचित है कि विभिन्न लेप्टोस्पेरा प्रजातियां और सेवर अलग-अलग संजीदगी प्रोटोकॉल के साथ अलग-अलग व्यवहार करेंगे।
भले ही सैप्रोफाइटिक लेप्टोस्पेरा उपनिवेश प्लेटों पर कल्पना करना अपेक्षाकृत आसान है, रोगजनक उपनिवेशों का निरीक्षण करना अधिक कठिन हो सकता है। आम तौर पर, 0.4% खरगोश सीरम और स्पेक्टिनोमाइसिन के साथ पूरक हान मीडिया का उपयोग करके, ट्रांसकोजुगंत कॉलोनियों को 10 दिन में देखा जा सकता है। हमारे अनुभव में, उपनिवेशों शुरू में मीडिया की सतह पर एक पारदर्शी प्रभामंडल के रूप में मौजूद हैं । वीडियो प्रोटोकॉल में डेंजर कॉलोनियों को 14 दिन की ग्रोथ के बाद दिखाया गया है, क्योंकि पारदर्शी लोगों को फिल्म करना मुश्किल था। इस स्तर पर, विभिन्न प्रकाश घटनाओं को प्राप्त करने और सफेद और अंधेरे पृष्ठभूमि के बीच स्थानांतरण करने के लिए प्लेट घुमाने से उपनिवेशों की पहचान करने में मदद मिल सकती है।
उत्परिवर्ती सत्यापन के लिए, इम्यूनोब्लोटिंग एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करता है; हालांकि, चूंकि एंटीबॉडी हमेशा लक्षित प्रोटीन के खिलाफ उपलब्ध नहीं होते हैं, इसलिए जीन को मान्य करने के लिए वैकल्पिक रणनीतियों को आगे बढ़ाया जा सकता है। लक्ष्य जीन के लिए प्राइमर का उपयोग करके मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्टेस पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) और जीन को मान्य करने के लिए एक संविलियन नियंत्रण प्रभावी है क्योंकि जीन ट्रांसक्रिप्शन की रुकावट के लिए एसजीआरएनए-निर्देशित dCas9 जिम्मेदार है। यदि लक्ष्य जीन प्रोटीन जैल में एक स्पष्ट रूप से परिभाषित प्रोटीन बैंड एन्कोड करता है, तो एसडीएस-पेज मुंह को प्रदर्शित कर सकता है, और लिपल32 जीन के अनुसार5। यदि एलपीएस बायोसिंथेसिस जीन को खामोश कर दिया जाता है, तो एलपीएस धुंधला को नियोजित किया जा सकता है; अच्छी तरह से परिभाषित सब्सट्रेट्स वाले एंजाइमों के लिए जीन एन्कोडिंग को मुंह में रखने के मामले में, क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट्स के साथ गतिज परख वैध रणनीतियां हैं; एल बिफ्लेक्सा में β-गैलेक्टोसिडेस साइलेंस को एक्स-गल और ओएनजीजी (ऑर्थो-नाइट्रोफेनिल-β-गैलेक्टोसाइड) सब्सट्रेट्स4के उपयोग से मान्य किया गया था।
जीन साइलेंसिंग की पुष्टि के बाद, प्रयोगों को फेनोटाइप का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। बैक्टीरियल आसंजन को मुंह में बंद करने के मामले में बाध्यकारी परख की जा सकती है; सीरम-चैलेंज परख ने रोगजनक लेप्टोस्पायरा 5द्वारा प्रदर्शित सीरम सर्वाइवल में लिगा और एलआईजीबी की भूमिका की पुष्टि की । म्यूटेंट का उपयोग जानवरों को उग्रता के क्षीण होने का आकलन करने के लिए टीका लगाने के लिए भी किया जा सकता है; इस मामले में, उत्परिवर्ती के साथ टीका लगाने वाले जानवरों की तुलना केवल pMaOri.dCas9 युक्त कोशिकाओं से संक्रमित लोगों से की जानी चाहिए।
अंत में, वर्तमान प्रोटोकॉल 10 दिनों के भीतर उत्परिवर्ती वसूली की सुविधा के लिए हान मीडिया का उपयोग कर रोगजनक लेप्टोस्पेरा प्रजातियों में जीन मुंह के लिए CRISPRi के आवेदन का वर्णन करता है । कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के साथ संयुक्त जीन चुप्पी लेप्टोस्पायराके रोगजनक तंत्र की हमारी समझ में सुधार करेगी, और अंततः रोग नियंत्रण के लिए बेहतर रोगनिरोधी रणनीतियों के विकास के लिए अग्रणी होगी।

लेप्टोस्पाइरा एक उपेक्षित दुनिया भर में ज़ूनोसिस है जो लेप्टोस्पाइराजीनस की रोगजनक और उग्र प्रजातियों के कारण होता है। मनुष्यों में, यह बीमारी दुनिया भर में 1,2मिलियन से अधिक मामलों और प्रति वर्ष 60,000 मौतोंकेलिए है। अभी तक इस बीमारी का दीर्घकालिक और कारगर टीका नहीं है। उग्रता कारकों और रोगजनक तंत्र की पहचान बेहतर चिकित्सीय और रोगनिरोधी रणनीतियों के विकास के लिए निर्णायक है। इसलिए, आनुवंशिक उत्परिवर्तन उत्पन्न करने और परिणामस्वरूप फेनोटाइप का आकलन करने की क्षमता कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण3के लिए महत्वपूर्ण है।
रोगजनक लेप्टोस्पायरा में म्यूटेंट के निर्माण पर विचार किया गया था, अब तक, स्वाभाविक रूप से अक्षम, श्रमसाध्य, महंगा और लागू करना मुश्किल था। यह परिदृश्य हाल ही में CRISPR हस्तक्षेप (CRISPRi) के आवेदन के साथ सैप्रोफाइटिक4 और रोगजनक5 लेप्टोस्पायर में काफी बदल गया।
जीन मुंह से दो घटकों की अभिव्यक्ति द्वारा प्राप्त किया जाता है: CRISPR/Cas का एकसंस्करण(सीचमकदार आरएगुलरली मैंnterspaced short palindromic repeat/सी RISPR के रूप मेंमिलनसार) एंजाइम एंजाइम स्ट्रेप्टोकोकस पायोजीन सेCas9, जिसे उत्प्रेरक रूप से मृत Cas9 (dCas9) और एक एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) कहा जाता है, जिसे वांछित लक्ष्य6,7,8के अनुसार संपादित किया जा सकता है। dCas9 प्रोटीन, जब sgRNA के लिए बाध्य, वाटसन और क्रिकेटरों आधार बांधना द्वारा विशिष्ट डीएनए लक्ष्यों के लिए निर्देशित किया है, आरएनए बहुलक विस्तार के लिए एक स्टेरिक रुकावट के कारण, बाधित जीन प्रतिलेखन7 (चित्रा 1)के कारण जीन मुंह में जिसके परिणामस्वरूप ।
इस पांडुलिपि का उद्देश्य dCas9 और sgRNA दोनों को व्यक्त करने के लिए प्लाज्मिड के निर्माण का वर्णन करना है, दाता ई. कोलाई 2163 और प्राप्तकर्ता लेप्टोस्पिरा कोशिकाओं, ट्रांसकोन्जुगंत रिकवरी और अंत में, चयनित उत्परिवर्ती उपनिवेशों के सत्यापन के बीच संजीता।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m pore size mixed cellulose esters membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>VCWP02500</td>
			<td>Filtration for bacterial conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-Diaminopimelic acid (DAP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1377</td>
			<td>Growth of auxotrophic E. coli &#946;2163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Noble</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214230</td>
			<td>Used for preparation of solid EMJH and HAN plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used for preparation of solid LB plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL substrate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10297-018</td>
			<td>dNTPs for PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microanalysis Filter Holder</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX1012530</td>
			<td>Filtration for bacterial conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td>Chemiluminescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>244620</td>
			<td>Lysogenic liquid medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>279510</td>
			<td>Supplementation of EMJH media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Medium Base EMJH</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>279410</td>
			<td>EMJH medium for Leptospira</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN TGX Gels 12%</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4568043</td>
			<td>Used for polyacrylamide gel eletrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical density reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M2</td>
			<td>For optical density measurements of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 7.4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td>Saline solution for washing bacterial pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0692</td>
			<td>Selection of pMaOri backbone plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0402</td>
			<td>Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Used for PCR reaction cycling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine (dT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9250</td>
			<td>Growth of auxotrophic E. coli &#960;1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XmaI restriction enzyme</td>
			<td>New Englan BioLabs</td>
			<td>R0180L</td>
			<td>Digestion of plasmids and inserts</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of crispr interference (crispri) for gene silencing in pathogenic species of leptospira

लेप्टोस्पाइरोसिस एक वैश्विक उपेक्षित ज़ूनोसिस है, जो प्रति वर्ष कम से कम 1 मिलियन मामलों और लगभग 60 हजार मौतों के लिए जिम्मेदार है। यह रोग लेप्टोस्पायराजीनस के रोगजनक और उग्र बैक्टीरिया के कारण होता है, या तो बैक्टीरिया के साथ सीधे संपर्क से या अप्रत्यक्ष रूप से दूषित पानी या मिट्टी के संपर्क में। घरेलू और जंगली जानवर संक्रमण के जलाशय मेजबान के रूप में कार्य करते हैं, मूत्र के माध्यम से, मूत्र के माध्यम से, पर्यावरण में गुर्दे के उपनिवेश गुर्दे के ट्यूबल से लेप्टोस्पायर बहाते हैं। संक्रमण के रोगजनक तंत्र का मूल्यांकन और समझने के लिए लेप्टोस्पायरा के उत्परिवर्ती उपभेदों की पीढ़ी महत्वपूर्ण है। CRISPR हस्तक्षेप (CRISPRi) रोगजनक लेप्टोस्पायरामें जीन मुंह के लिए एक सीधा, सस्ती और विशिष्ट उपकरण साबित हुआ है। इसलिए, प्लाज्मिड दोनों dCas9 और गाइड आरएनए, ई कोलाई तनाव के साथ conjugation द्वारा लेप्टोस्पिरा के लिए प्लाज्मिड की डिलीवरी, और ट्रांसकोजुगंत वसूली और मूल्यांकन, दोनों युक्त निर्माण प्राप्त करने के पद्धतिगत विवरण का वर्णन किया जाएगा। इसके अलावा, हाल ही में वर्णित Hornsby-Alt-Nally (हान) मीडिया अपेक्षाकृत तेजी से अलगाव और आगर प्लेटों पर उत्परिवर्ती कालोनियों के चयन के लिए अनुमति देता है ।

हालांकि लेप्टोस्पिरा एसपीपी में सीजी सामग्री आमतौर पर लगभग 35% होती है; लगभग हर जीन में पाम 5 'एनजीजी 3'; इस आकृति को टेम्पलेट स्ट्रैंड में विचार करने की आवश्यकता है। एक जीन के कोडिंग अनुक्रम इनपुट के बाद (शुरू से codons को रोकने के लिए), CHOPCHOP परिणामों के आधार पर, प्रोटोस्पेसर्स शून्य (-, टेम्पलेट) कतरा पर चुना जाना चाहिए । यह महत्वपूर्ण है कि 20-एनटी sgRNA प्रोटोस्पेसर में NGG आकृति शामिल नहीं है।
यदि 1:1 दाता के साथ संयुग्मण किया जाता है: प्राप्तकर्ता सेल अनुपात, ईएमजेएच एगर प्लेटों के साथ-साथ डीएपी की सतह पर 24 घंटे के लिए, और बरामद बैक्टीरियल निलंबन के 200 माइक्रोन हान प्लस स्पेक्टिनोमाइसिन एगर प्लेटों पर फैले हुए हैं, तो ट्रांसकोन्जुगैंट्स कॉलोनियों को लगभग 8-10 दिनों में दिखाई देना चाहिए। इस मात्रा के प्रसार के परिणामस्वरूप सामान्य रूप से प्रति प्लेट 20-40 कॉलोनियां(चित्रा 3 ए)होती हैं। आदेश में संाधीनता के बाद सेल व्यवहार्यता के लिए जांच करने के लिए, कोशिकाओं को कोई एंटीबायोटिक चयन के साथ हान प्लेटों पर फैलाया जा सकता है । इस मामले में, कॉलोनाइजर को 7 दिनों के रूप में जल्द ही देखा जा सकता है। हान प्लेटें 3% सीओ 2 वातावरण में पीला पीला होजाते हैं।
लिक्विड मीडिया प्लस स्पेक्टिनोमाइसिन में कॉलोनी चुनने और विकास के बाद, पूरी कोशिकाओं और pMaOri2 प्राइमर का उपयोग कर पीसीआर का उपयोग ट्रांसकोन्जूगेंट(चित्रा 3 बी)की प्रारंभिक गुणवत्ता जांच के लिए किया जा सकता है। नियंत्रण pMaOri.dCas9 प्लाज्मिड युक्त लेप्टोस्पायरल कोशिकाओं के परिणामस्वरूप 281 बीपी का एम्प्लिकॉन होना चाहिए, जबकि उन कोशिकाओं में साइलेंसिंग के लिए प्लाज्मिड होता है, जो कि DCas9 और sgRNA दोनों युक्त होता है, 723 बीपी एम्प्लाइसन में परिणाम होना चाहिए। pMaOri2 एफ और आर प्राइमर को XmaI प्रतिबंध साइट को पार्श्व करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जो sgRNA कैसेट लिगेशन के दौरान उपयोग की जाने वाली साइट है।
प्लाज्मिड उपस्थिति की पुष्टि के साथ, कोशिकाओं को मीडिया से काटा जा सकता है, पीबीएस के साथ दो बार धोया जा सकता है, और फिर इम्यूनोब्लोटिंग के लिए एक पूरी सेल निकालने को तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है। यदि मुंह बंद हो गया, तो इस मामले में लक्षित प्रोटीन, या तो LipL32 या दोनों LigA और LigB, केवल जंगली प्रकार की कोशिकाओं में और pMaOri.dCas9 युक्त लोगों में मनाया जाना चाहिए; यहां तक कि उच्च जोखिम समय के साथ, pMaOri.dCas9sgRNA(चित्रा 3C)युक्त कोशिकाओं में कोई संबंधित प्रोटीन दिखाई नहीं देना चाहिए ।
यदि जीन को सील करने के बाद लेप्टोस्पायरल उग्रता का आकलन करने के लिए प्रयोगों की योजना बनाई जाती है, तो संजीदगी के लिए उपयोग की जाने वाली संस्कृतियों को कम मार्ग उग्र लेप्टोस्पायराहोना चाहिए। जीन मुंह से बाहर होने की पुष्टि होने के बाद, कई एलिकोट्स को बैकअप के रूप में फ्रीज किया जा सकता है। यदि खामोश जीन में एक औसत दर्जे का फेनोटाइप है, उदाहरण के लिए, पुनर्संयोजन प्रोटीन के साथ पिछले काम के आधार पर, संस्कृतियों का उपयोग सत्यापन के लिए किया जा सकता है और, इस मामले में, केवल pMaOri.dCas9 युक्त कोशिकाओं को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया जा सकता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62631/62631fig01.jpg"> चित्रा 1:dCas9 और sgRNA के विकास प्लाज्मिड व्यक्त । (A)एक 20-nt लंबे प्रोटोस्पेसर, एस pyogenes dCas9 पाम 5'-NGG-3 ' के बाद, लक्ष्य जीन के टेम्पलेट स्ट्रैंड के भीतर चुना जाता है तो बाद sgRNA वाटसन और Crick आधार इसी coding कतरा बांधना प्रदर्शन कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप पूरी तरह से जीन स्नेशन । (ख)एसजीआरएनए कैसेट लिपल32 प्रमोटर, 20-एनटी प्रोटोस्पेसर और डीसीए9 पाड़ से बना है । PMaOri.dCas9 प्लाज्मिड XmaI प्रतिबंध साइट पर sgRNA कैसेट लिगेशन के लिए एक रीढ़ के रूप में प्रयोग किया जाता है। जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मिड, जिसे pMaOri.dCas9sgRNA कहा जाता है, लेप्टोस्पायर को दिया जाता है, और dCas9 और sgRNA दोनों की अभिव्यक्ति जीन साइलेंसिंग के लिए जिम्मेदार है। (ग)SgRNA निर्देशित dCas9 आरएनए बहुलक विस्तार के लिए एक भौतिक बाधा के रूप में कार्य करता है, इसलिए, प्रतिलेखन में बाधा । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/62631fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62631/62631fig02.jpg"> चित्रा 2:संयोजित प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। वांछित लेप्टोस्पेरा प्रजातियां आंदोलन के तहत हान मीडिया में उगाई जाती हैं, जब तक कि 420 एनएम पर 0.2-0.4 (मध्य-लॉग चरण) के O.D. नहीं होते हैं। संविलियन से एक दिन पहले, पुनर्संयोजन दाता ई. कोलाई 2163 की एक कॉलोनी जिसमें ब्याज की प्लाज्मिड होती है, एलबी + डीएपी + स्पीसी एगर प्लेटों से उठाया जाता है, क्योंकि कोशिकाओं को एक ही पूरकता के साथ तरल पौंड में रातोंरात उगाया जाता है। अगले दिन, संतृप्त ई। कोलाई संस्कृतियों को एलबी प्लस डीएपी में पतला किया जाता है और 420 एनएम पर 0.2-0.4 के O.D. तक उगाया जाता है। दोनों दाता ई. कोलाई और प्राप्तकर्ता लेप्टोस्पायरा नकारात्मक दबाव में एक छानने का तंत्र द्वारा एक 0.1 माइक्रोन फिल्टर की सतह पर 1:1 सेल अनुपात में मिलाया जाता है। फिर, फिल्टर डीएपी के साथ पूरक EMJH आगर प्लेटों के शीर्ष पर रखा जाता है, और इनक्यूबेशन 29 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए आय । EMJH का उपयोग ई. कोलाई प्रसार को सीमित करता है, और इच्छित 1:1 अनुपात बनाए रखा जाता है। बैक्टीरिया 1 एमएल हान मीडिया के साथ पाइपिंग द्वारा फिल्टर से बरामद किए जाते हैं, और डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी के तहत निलंबन की कल्पना की जाती है। अंत में, प्रत्येक निलंबन के 100-200 माइक्रोन को 0.4% खरगोश सीरम युक्त हान एगर प्लेटों पर वरीयता प्राप्त किया जाता है और 3% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड कियाजाताहै। इस स्तर पर, डीएपी को छोड़ दिया जाता है, और नतीजतन, ऑक्सोट्रोफिक ई कोलाई विकसित नहीं होगा। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/62631fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62631/62631fig03.jpg"> चित्र 3:म्यूटेंट के मूल्यांकन के लिए प्रतिनिधि परिणाम। (ए) लेप्टोस्पिरा युक्त प्लेटों से कालोनियों खाली pMaOri.dCas9 (आगे प्रयोगों के लिए नकारात्मक नियंत्रण) और प्लाज्मिड्स pMaOri.dCas9sgRNA (लक्षित जीन खामोश के साथ) उठाया जाता है, तेजी से तरल हान में समरूप और spectinocincincin युक्त हान में उगाया । पुनः संयोजन कोशिकाओं को पीसीआर द्वारा pMaOri.dCas9 के भीतर XmaI साइट को फ्लैंक करने वाले प्राइमर के साथ मान्य किया जा सकता है। (ख)इस मामले में, pMaOri.dCas9 युक्त कोशिकाओं केवल २८१ बीपी के एक एम्प्लिकॉन के परिणामस्वरूप, जबकि उन कोशिकाओं को silencing के लिए प्लाज्मिड युक्त, दोनों dCas9 और sgRNA युक्त, एक ७२३ बीपी amplicon दिखाया । प्लाज्मिड की उपस्थिति की पुष्टि के बाद, इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा जीन साइलेंसिंग को मान्य किया गया था। (ग)प्रोटीन और लोडिंग नियंत्रण प्रोटीन दोनों को लक्षित करने के लिए एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन की सिफारिश की जाती है; प्रतिनिधि इम्यूनोब्लॉट में, अकेले pMaOri.dCas9 युक्त ट्रांसकोन्जुगेंट से पूरे सेल अर्क या लिपएल32 (pMaOri.dCas9sgRNAlipL32) को लक्षित करने वाले sgRNA कैसेट के साथ और दोनों LigA और LigB (pMaOri.dCas9sgRNAligAB) जीन प्रदर्शित किए जाते हैं। एंटी-लिपल32, एंटी-लिगाब और एंटी-लिपल41 (गैर-लक्षित, लोडिंग कंट्रोल) के साथ सह-इनक्यूबेशन इस बात की पुष्टि करता है कि PMaOri.dCas9sgRNAlipL32 और pMaOri.dCas9sgRNAligab युक्त कोशिकाओं में LigA और LigB दोनों युक्त कोशिकाओं में LipL32 प्रोटीन की अभिव्यक्ति समाप्त हो जाती है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/62631fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
अनुपूरक फाइल: एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) कैसेट अनुक्रम। एसजीआरएनए ट्रांसक्रिप्शन संविलियन लिपल32 प्रमोटर (बोल्ड न्यूक्लियोटाइड) द्वारा निर्देशित है। sgRNA 20 न्यूक्लियोटाइड्स से बना है जो प्रोटोस्पेसर की चर्चा करते हुए, लक्ष्य जीन के कोडिंग स्ट्रैंड के लिए बेस पेयरिंग के लिए जिम्मेदार है, और dCas9 पाड़ अनुक्रम (रेखांकित न्यूक्लियोटिड्स)। एक्सएमए मैं प्रतिबंध साइटों (cccggg) pMaOri.dCas9 प्लाज्मिड पर बंधन के लिए दोनों सिरों पर शामिल हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/Supplementary%20File.docx" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Application of CRISPR Interference CRISPRi for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

यहां लेप्टोस्पायरा प्रजातियों में विशिष्ट जीन सिलने के लिए CRISPR हस्तक्षेप (CRISPRi) के आवेदन का वर्णन किया गया है । लेप्टोस्पायरा कोशिकाओं को dCas9 (उत्प्रेरक रूप से "मृत" Cas9) और एक एकल-गाइड आरएनए (sgRNA) व्यक्त करने वाले प्लाज्मिड्स के साथ संवत् द्वारा परिवर्तित किया जाता है, जो वांछित जीनोमिक लक्ष्य के आधार बांधना के लिए जिम्मेदार होता है। जीन को मान्य करने के तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं।

लेप्टोस्पायरा की रोगजनक प्रजातियों में जीन सिलिंग के लिए CRISPR हस्तक्षेप (CRISPRi) का आवेदन

Leptospirosis is a global neglected zoonosis, responsible for at least 1 million cases per year and almost 60 thousand deaths. The disease is caused by ...

मेरा नाम जारलाथ Nally है, और मैं यहां एम्स, आयोवा में राष्ट्रीय पशु रोग केंद्र में अनुसंधान टीम का हिस्सा हूं, और हम लेप्टोस्पाइरोसिस पर काम करते हैं । लेप्टोस्पाइरोसिस एक उपेक्षित बीमारी है। यह एक वैश्विक बीमारी है ।और वास्तव में, हम कैसे बैक्टीरिया के इन अद्वितीय समूह संक्रमण का कारण की एक बहुत ही सीमित समझ है । इसलिए आज की प्रस्तुति एक नए उपकरण का अवलोकन प्रदान करने के बारे में है जो CRISPR हस्तक्षेप नामक तकनीक का उपयोग करके लेप्टोस्पाइरा द्वारा व्यक्त विशिष्ट जीन को विशेष रूप से सील करके लेप्टोस्पाइरा के रोगजनक तंत्र के मूल्यांकन को सुविधाजनक बनाने के लिए उपलब्ध है। हालांकि, न्यूटन कालोनियों का चयन करने की क्षमता इन दुराग्रही लेप्टोस्पायरा के लिए सबसे अच्छा विकास मीडिया प्रदान करने पर बहुत निर्भर है।तो, सबसे पहले, हम आपको रिक Hornsby, जो बहुत संक्षेप में इन दुराग्रही बैक्टीरिया का प्रचार करने के लिए एक नया मीडिया परिचय था करने के लिए मिलवाने जा रहे हैं । और फिर हम आपको लुई फर्नांडीज से मिलवा देंगे, जो लेप्टोस्पायरा के भीतर लक्ष्य जीन को शांत करने के लिए CRISPR हस्तक्षेप पद्धति के बारे में बात करेंगे । हाय, मैं रिक Hornsby हूँ.१०० साल पहले अनाडा द्वारा उनकी पहचान के बाद से, लेप्टोस्पाइरास आम तौर पर अलग-थलग और 29 डिग्री सेल्सियस पर प्रचारित किया गया है, एक तापमान जो न तो पर्यावरण को दर्शाता है और न ही स्तनधारी मेजबान शरीर के तापमान । 10 साल पहले, यूएसडीए ईएर्स ने लेप्टोस्पेरा मीडिया पर सुधार पर शोध करना शुरू किया और इस शोध में से, हॉर्नस्बी-ऑल्ट-नली मीडिया विकसित किया गया था। इस मीडिया का उपयोग करते हुए, चिकित्सकों और शोधकर्ताओं ने अधिक तेजी से अलग करने और क्षेत्र के मामलों से लेप्टोस्पायरा का प्रचार करने में सक्षम किया गया है और एक तापमान पर और एक वातावरण में जो स्तनधारी मेजबान का अधिक बारीकी से अनुकरण करता है।हम इस मीडिया का अनुकूलन जारी रखते हैं, लेकिन जैसा कि यह खड़ा है, हान ने विट्रो अनुसंधान में पशु चिकित्सा और मानव नैदानिक अलगाव और लेप्टोस्पाइरोसिस की रोकथाम के लिए अधिक प्रभावोत्पादक टीकों के विकास में काफी सुधार करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है। हाय, मैं लुई फर्नांडीज हूँ. अब तक, लेप्टोस्पाइरोसिस के रोगजननों का पता लगाया गया था, मुख्य रूप से आनुवंशिक ट्यूबों को करने के लिए प्रभावी और आसान की कमी के कारण।यहां हम CRISPR हस्तक्षेप या CRISPRi नामक एक नई तकनीक का वर्णन करने जा रहे हैं। और यह तकनीक बहुत सरल है क्योंकि हमें केवल दो घटकों को व्यक्त करने की आवश्यकता है, एक डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन जिसे मृत Cas9, या dCas9 कहा जाता है, और एक चिमरिक आरएनए अणु जिसे एकल-गाइड आरएनए कहा जाता है। और जटिल dCas9 और गाइड आरएनए हमारे लक्ष्य जीन के लिए आधार बांधना बनाने जा रहे है और इसलिए कम या यहां तक कि प्रतिलेखन ब्लॉक ।इसके अलावा नए वर्णित हान मीडिया का उपयोग करके, हम एक उत्परिवर्ती वसूली के लिए कॉलोनी गठन के समय को काफी कम कर सकते हैं। पहला कदम प्रोटोस्पेसर को परिभाषित कर रहा है जो गाइड आरएनए में समाहित होगा। इस अनुक्रम में 20 न्यूक्लियोटाइड शामिल हैं जो वांछित जीन लक्ष्यों के आधार बांधना को परिभाषित करेंगे ।स्ट्रेप्टोकोकस पायोजीन, Cas9, और प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति, एनजीजी के लिए परिभाषित मापदंडों के साथ, वेब सर्वर CHOPCHOP के लिए एक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम सबमिट करें। परिणामों के आधार पर, माइनस ट्रेंड के भीतर सर्वश्रेष्ठ स्कोर के साथ प्रोटोस्पेसर का चयन करें। एनजीजी आकृति को अंतिम क्रम में शामिल नहीं किया जाएगा ।हम एकल गाइड आरएनए को व्यक्त करने के लिए lipL32 प्रमोटर का उपयोग कर रहे हैं, जिसमें एक संरक्षित dCas9 पाड़ में पांच-प्राइम पर चर 20 न्यूक्लियोटिड्स शामिल होंगे । कैसेट प्राप्त करने के बाद इसे पमोरी में चला जाएगा। Xma1 प्रतिबंध स्थल पर dCas9 प्लाज्मिड।संयुग्मण के लिए लेप्टोस्पायरा कोशिकाओं को हान मीडिया में 29 या 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जाता है। एक दिन पहले एक conjugation, दाता बराबर कोशिकाओं एलबी मीडिया में हो रहे है डायमिओलिमिक एसिड, डीएपी, और spectinomycin के साथ पूरक । इसके बाद, संजीदशन के दिन में एलबी प्लस डीएपी में संतृप्त ई.कोलाई संस्कृतियों को ग्रिल करें।एक जैव सुरक्षा हुड के अंदर, ग्लास बेस के शीर्ष पर झिल्ली फिल्टर रखकर निस्पंदन उपकरण इकट्ठा किया, इसके बाद 15 एमएल ग्लास कीप। दोनों टुकड़े इस वसंत क्लैंप द्वारा एक साथ आयोजित किए जाते हैं। फिर ग्लास को वैक्यूम पंप से कनेक्ट करें, कीप में लेप्टोस्पेरा संस्कृतियों के पांच एमएल जोड़ें।इसके बाद, ई.कोलाई बीटा 2163 तनाव जोड़ें जिसमें ब्याज की प्लाज्मिड होती है। मात्रा संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व के अनुसार भिन्न होगी। हम एक से एक सेल पिपरियन करने का लक्ष्य रख रहे हैं।वैक्यूम पंप चालू करें, अब तरल पदार्थ हम झिल्ली के माध्यम से प्राप्त करेंगे और कोशिकाएं इसके शीर्ष पर केंद्रित होंगी। फिल्टर ले लो और यह EMJH प्लेट प्लस डीएपी, bicurier पक्ष ऊपर पर जगह है । 24 घंटे के लिए 29 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों इनक्यूबेट ।इसके बाद प्लेटों से फिल्टर ठीक कर 50 एमएल शंकु नली में रख लें। पिपटिंग द्वारा फिल्टर से कोशिकाओं को ठीक करने के लिए तरल हान मीडिया के एक एमएल का उपयोग करें। डार्क फील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा बरामद कोशिकाओं की कल्पना करें।इस स्तर पर ई. कोलाई और लेप्टोस्पायरा के बराबर संख्या देखी जा सकती है। स्पेक्टिनोमाइसिन युक्त हान प्लेटों पर बैक्टीरिया को फैलाने के लिए 100 से 200 माइक्रोलीटर का उपयोग किया जाता है। इस स्तर पर, डीएपी को छोड़ दिया गया है और ई कोलाई विकसित नहीं होगा।प्लेटें 37 डिग्री सेल्सियस और 3% CO2 पर इनक्यूबेटेड हैं। कॉलोनियां आठ से 10 दिन के बीच स्पष्ट होनी चाहिए । लेप्टोस्पिरा इंटररोजेन्स उपनिवेशों की कल्पना करना थोड़ा मुश्किल है।यहां हम ऊंचा हो गया कॉलोनियों को दिखा रहे हैं ताकि उन्हें देखना आसान हो सके । म्यूटेंट को ठीक करने के लिए 1.5 एमएल ट्यूब में तरल हान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्रत्येक प्लेट से कम से कम तीन कॉलोनियों को लेने की सिफारिश की जाती है।एक पिपेट टिप का उपयोग करके, अलग-अलग उपनिवेशों को प्लेटों से वापस लाया जाएगा। एगर को अकेले ले जाने की उम्मीद है । कालोनियों को एमटीपी पमोरी युक्त कंट्रोल प्लेटों से लिया जाना चाहिए।dCas9 प्लाज्मिड। और लेप्टोस्पायरा के साथ प्लेटें जिनमें dCas9 और गाइड आरएनए दोनों के साथ प्लाज्मिड युक्त है जो लक्ष्य जीन के लिए डिज़ाइन किया गया है। बरामद कोशिकाओं को अब डार्क फील्ड माइक्रोस्कोपी के तहत कल्पना की जा सकती है ताकि छुट्टी व्यवहार्य लेप्टोस्पायरा की उपस्थिति की पुष्टि की जा सके ।लीप्टोस्पायरा के दृश्य के बाद, कोशिकाओं को तरल हान मीडिया में स्थानांतरित करें जिसमें स्पेक्टिनोमाइसिन होता है। संस्कृति के विकास के बाद, कोशिकाओं को अब पुष्टि और फेनोटाइप मूल्यांकन को मुंह में रखना के लिए बरामद किया जा सकता है । यदि लक्ष्य प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी उपलब्ध हैं इम्यूनोब्लॉट एक सीधे आगे की पद्धति को मुंह का मूल्यांकन है ।पेप्टोस्पायरस जिसमें पीपीएओरी होता है। अकेले dCas9, या गाइड आरएनए कैस के साथ पीसीआर, लकड़ी फ्लैंकिंग प्राइमर द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। DMT प्लाज्मिड लगभग 300 बेस जोड़ी का एक बैंड में परिणाम होगा और लगभग 700 की एक ही तरह प्राप्त किया जाता है जब गाइड आरएनए कैसेट मौजूद है।पूरे सेल अर्क का उपयोग करने वाले इम्यूनोब्लॉट्स को पुष्टि को मुंह में रखने के लिए किया जाता है, लिपएल 32 प्रोटीन अभिव्यक्ति को dCas9 में व्यक्त प्लाज्मिड युक्त कोशिकाओं में समाप्त कर दिया जाता है और इस जीन को लक्षित करने वाले आरएनए का मार्गदर्शन किया जाता है। और दोनों लिंक ए और लिंक बी गाइड आरएनए युक्त कोशिकाओं में अनुपस्थित हैं, दोनों जीन के लिए विशिष्ट है । सभी गलियों में कंट्रोल लिपल41 देखा जा सकता है।इसलिए हमने लेप्टोस्पायरा इंटररोजेन्स पर CRISPR हस्तक्षेप का उपयोग किया है, हमने इसे लेप्टोस्पायरा की कई अतिरिक्त रोगजनक प्रजातियों पर भी उपयोग किया है। हमने इसका उपयोग विशिष्ट जीन को शांत करने के साथ-साथ छोटे गैर-कोडिंग आरएनए की अभिव्यक्ति को मुंह से बाहर करने के लिए किया है। हमारे अनुसंधान ब्याज संक्रमण के रोगजनक तंत्र को समझने में है, तो हम आम तौर पर विचरण कारकों की पहचान करने के लिए देखो, लेकिन जाहिर है आप अपनी पसंद के जीन मौन और अनुसंधान के अपने क्षेत्र के अनुसार कर सकते हैं ।और उदाहरण के लिए, यह गतिशीलता या समझ हो सकता है कि पर्यावरण, या चयापचय में लेप्टोस्पायरा कैसे बने रहते हैं। किसी भी मामले में, आपको एक विशिष्ट उत्परिवर्ती उत्पन्न करने में सक्षम होना चाहिए जो आपको कार्यात्मक जीनोमिक्स करने और प्रश्न में जीन के जैविक महत्व को समझने की अनुमति देगा। तो हम सब से यहां राष्ट्रीय पशु रोग केंद्र में, हम आपको अपने अनुसंधान के साथ भाग्य का बहुत अच्छा चाहते हैं ।

Research

JoVE Journal

Genetics

Application of CRISPR Interference (CRISPRi) for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता वाली जीन नॉकआउट्स के चयन-आश्रित और स्वतंत्र जनरेशन

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

एक मानक पद्धति पर जांच करने के लिए साइट Mutagenicity के एक समारोह के रूप में बिंदु उत्परिवर्तन मरंमत Catalyzed द्वारा CRISPR/Cas9 और SsODN मानव कोशिकाओं में

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 प्रोटीन की चैनल कैटफ़िश, Ictalurus punctatus, जीन संपादन के लिए भ्रूण

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

CRISPR/Cas9 के लिए Integrase-कमी Lentiviral वैक्टर के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल-विभाजन कोशिकाओं में मध्यस्थता जीन नॉकआउट

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

जीन थेरेपी आवेदन के लिए Baculovirus का उत्पादन एवं शुद्धिकरण

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Murine और मानव टेम जनक कोशिकाओं के अत्यधिक कुशल जीन व्यवधान CRISPR द्वारा Cas9/

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-क्रोमेटिन लूप संरचना की मध्यस्थता पुनर्गठन

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 जीन संपादन मानव मलेरिया परजीवी पी. फाल्सीपेरम की सशर्त म्यूटेंट बनाने के लिए

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

बढ़ाने का विच्छेदन कार्य मल्टीप्लेक्स CRISPR-आधारित बढ़ाने का प्रयोग सेल लाइंस में व्यवधान

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

लंबे noncoding rnas का उपयोग करके overexpressing जीन सक्रिय crispr

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...