Name: application of crispr interference (crispri) for gene silencing in pathogenic species of leptospira
Uploaded: 2021-08-14T15:00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of CRISPR Interference CRISPRi for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira at JoVE.com

El USDA es un proveedor y empleador de igualdad de oportunidades. La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica, y no implica recomendación o aprobación por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. La agencia brasileña FAPESP (subvención 2014/50981-0) apoyó financieramente este trabajo; LGVF se financia con una beca de la FAPESP (2017/06731-8 y 2019/20302-8). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Los autores también agradecen a Hannah Hill y Alexander Grimes de los Servicios Visuales del USDA por filmar y editar el protocolo de video.

1. Definición del protoespacial y construcción del plásmido
NOTA: En esta sección, se describe el primer paso de selección de protoespaciales apropiados para construir el sgRNA y la ligadura adicional en pMaOri.dCas9 (Figura 1). Esta secuencia protoespacial comprende una secuencia de 20 nucleótidos contra el objetivo deseado.
<ol><li>Obtener la secuencia de nucleótidos del gen de interés para silenciar en GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Envíelo al servidor web CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), con parámetros definidos para Streptococcus pyogenes Cas9 y el protoespaciador adyacente motivo NGG después de seleccionar el "Fasta Target". Defina los parámetros para "CRISPR/Cas9" y PAM (motivo adyacente protoespacial) NGG.</li>
	<li>En base a los resultados obtenidos, seleccionamos protoespaciales con la mejor puntuación posible (flecha verde), que se encuentran lo más cerca posible del extremo 5' de la región codificante y, lo más importante, están contenidos en la plantilla (menos) hebra ya que el sgRNA debe emparejarse con la hebra codificante del gen para el silenciamiento génico completo. NOTA: El motivo NGG no está incluido en la secuencia final de sgRNA.</li>
	<li>Utilice el promotor lipL32 para expresar el ARN guía único que contiene una secuencia de nucleótidos variable de 20 en el extremo 5' y una secuencia de andamios dCas9 conservada. Fusionar la secuencia de 20 nt, denominada protoespaciador, con el promotor lipL32 (en su extremo de 5' y el andamio sgRNA (extremo 3') (Figura 1B). NOTA: Para un promotor lipL32 bien definido, utilice la región promotora que comprende -334 al TSS (Transcription Start Site, basado en Zhukova et al.9). Compruebe el archivo suplementario para el casete sgRNA final.</li>
	<li>Generar el casete sgRNA por PCR secuencial5 o hacer que sea sintetizado por un proveedor comercial.</li>
	<li>Después de obtener el casete, ligarlo en el plásmido pMaOri.dCas9 en el sitio de restricción XmaI en ambos extremos (cccggg)4.<ol>
<li>Digerir tanto el casete sgRNA como el plásmido pMaOri.dCas9 con la enzima de restricción XmaI y proceder a la ligadura(Figura 1B).</li>
		<li>Realizar los pasos de clonación en la cepa auxotrófica dT de E. coli π110,debido al origen pMaOri11 (y por extensión, pMaOri.dCas9) de replicación, R6K-gamma. NOTA: Para un protocolo detallado para la ligadura y la selección de clones, consulte publicaciones anteriores de Fernandes y Nascimento12. SgRNA-guided dCas9 se unirá a la cadena codificante del gen seleccionado de interés y, por lo tanto, obstruirá el alargamiento de la ARN polimerasa(Figura 1C),dando lugar a silenciamiento de genes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Transformación de la leptospira por conjugación
NOTA: Un esquema gráfico de este paso se presenta en la Figura 2. Para hacer medios HAN y placas HAN, refiérase a Hornsby et al.13 y Fernandes et al.5.
<ol><li>Cultivar células patógenas de Leptospira a 29 o 37 °C en medios HAN13 bajo agitación diluyendo un cultivo saturado en HAN fresco a la 1:100; típicamente, L. interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 tarda 4-6 días en alcanzar la densidad celular adecuada.<ol>
<li>Asegúrese de que los cultivos alcancen un O.D. de 0.2-0.4 a 420 nm (2 a 5 x 108 células/mL) antes de usarlo para la conjugación. NOTA: Dado que los medios HAN cambian de color a medida que aumentan las densidades celulares (debido al rojo fenol contenido en los medios DMEM), centrífuga (4.000 x g,15 min, temperatura ambiente) 1 mL del medio de cultivo para eliminar las leptospiras y aplicar sobrenadante como un espacio en blanco para medir el O.D.</li>
	</ol></li>
	<li>Transformar la cepa conjugativa de E. coli β2163, auxotrófica para ácido diaminopimelico (DAP), con el plásmido pMaOri.dCas9 que contiene el casete sgRNA. Para E. coli transformación, utilice protocolos de choque térmico o electroporación. Incluir la transformación con el plásmido pMaOri.dCas9 sin casete sgRNA como control.<ol>
<li>Para la transformación de choque térmico, mezcle el ADN del plásmido (100 ng) con células de E. coli químicamente competentes e incube en hielo durante 30 min. Realizar choque de calor a 42 °C durante 90 s y colocarlo de nuevo en hielo durante 5 min. Recuperar las células añadiendo 1 mL de soporte LB, incubar a 37 °C durante 1 h y proceder al enchapado.</li>
		<li>Para la electroporación, utilice células electrocompetentes mezcladas con 100 ng de ADN plásmido. Utilice los siguientes parámetros para el pulso: 1,8 kV, 100 Ω y 25 μF. Recupere las células como se explicó anteriormente.</li>
		<li>Platee las células de E. coli del donante transformadas en el medio de agar LB complementado con el ácido diaminopimelic (DAP) (0.3 milímetros) y la espectinomicina (40 μg/mL) para seleccionar para los plásmidos.</li>
	</ol></li>
	<li>Para la conjugación, seleccione una colonia de cada placa un día antes del día de la conjugación (que se determina mediante el monitoreo de la D.O. de cultivos de leptospiras).<ol>
<li>Seleccione una colonia de E. coli β2163 de las placas vacías de pMaOri.dCas9, y una de las placas de pMaOri.dCas9sgRNA. Déjalos crecer durante la noche en 10 mL de LB más DAP y espectinomicina a 37 °C.</li>
		<li>Al día siguiente, diluir los cultivos saturados 1:100 en 10 mL de LB fresco más DAP (no incluir el antibiótico aquí) hasta OD420nm de 0.2-0.4. Normalmente, se necesitan 2-3 h para que E. coli alcance estas densidades.</li>
	</ol></li>
	<li>Dentro de una campana de bioseguridad BSL2, monte un aparato de filtración colocando un filtro de membrana de ésteres de celulosa mixtos de 25 mm de diámetro y 0,1 μm de tamaño de poro en la parte superior de la base de vidrio. Coloque un embudo de vidrio de 15 mL en la parte superior y sostenga ambas piezas con abrazaderas de resorte. Conecte el vidrio a una bomba de vacío y agregue los cultivos al embudo para la filtración.</li>
	<li>Añadir 5 mL de cultivo de Leptospira al embudo. Agregue un volumen de E. coli para constituir la proporción 1:1 basada en los valores de OD420nm de ambas culturas. Encienda la bomba de vacío y concentre las células por filtración. Después de la concentración celular en el filtro de membrana, recupéralo cuidadosamente. Asegúrese de que el medio se filtra a través de la membrana. NOTA: La filtración tarda de 5 a 10 min.</li>
	<li>Coloque el filtro en una placa EMJH disponible en el mercado (consulte tabla de materiales)complementada con DAP (0,3 mM). Asegúrese de que el lado de las bacterias está hacia arriba. Incubar las placas a 29 °C durante 24 h. NOTA: Si se utilizan placas HAN o EMJH14 suplementadas, E. coli puede proliferar y superar la proporción 1:1 prevista, lo que a su vez puede disminuir la eficiencia de conjugación5.</li>
	<li>Después de las 24 h, recupere los filtros de las placas y coloque cada filtro individual en un tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Utilice 1 mL de medio han líquido para liberar las células de la superficie del filtro por pipeteo extenso y vórtice.</li>
	<li>Visualice las soluciones bacterianas mixtas recuperadas por microscopía de campo oscuro para verificar la viabilidad y la motilidad celular, y las proporciones de Leptospira: E. coli. NOTA: En esta etapa, se pueden ver números equivalentes de E. coli y Leptospira.</li>
	<li>Diseminar 100-200 μL de este cultivo en placas HAN que contienen suero de conejo inactivado al 0,4% y 40 μg/mL de espectinomicina. Incubar placas a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 3%. NOTA: Normalmente, L. interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 células forman colonias en 5-7 días en placas de control y en 8-10 días en placas de espectinomicina. En esta etapa, E. coli no crecerá ya que son auxotróficos para laDAP.</li>
	<li>Como control, diluir los cultivos a 104 leptospiras/mL y añadir 100 μL en placas sin antibiótico, para controlar el crecimiento de la leptospira.</li>
</ol>3. Selección de colonias y crecimiento y validación transconjugantes
NOTA: Las colonias deben ser evidentes para el día 10. Sin embargo, no son demasiado fáciles de visualizar. Normalmente en este punto de tiempo, las placas HAN son un poco opacas debido a las células secas que se extendieron y las colonias de Leptospira pueden aparecer como un halo transparente contra el fondo blanquecino. Se recomienda ver las placas en diferentes ángulos para lograr una diferente incidencia de luz, por lo tanto, haciendo que las colonias sean más evidentes. En tiempos de incubación más largos, las colonias pueden adquirir un aspecto más denso, y en este caso, se presentan como halos lechosos sobre un fondo oscuro.
<ol><li>Añadir 100 μL de medios HAN líquidos a cada microtubo de 1,5 mL para recuperar mutantes. Tome al menos 3 colonias de cada plato.<ol>
<li>Con la ayuda de una punta de micropipeta, "cavar" el agar para recuperar las colonias de las placas ya que las colonias de leptospiras pueden ser subsuperficiales. NOTA: Se espera que el agar sea llevado a lo largo de esta etapa. Las colonias deben tomarse de placas de control que contengan plásmido pMaOri.dCas9 vacío, y placas con leptospiras que contengan plásmidos que expresen tanto dCas9 como ARN guía único, diseñados para el gen diana.</li>
		<li>Dispensar la colonia recolectada en 100 μL de medios HAN en un microtubo de 1,5 mL y homogeneizar vigorosamente. En esta etapa, asegúrese de la ruptura máxima de la integridad del agar para liberar células. Vórtice la suspensión para 10 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualice las células recuperadas mediante microscopía de campo oscuro a un aumento de 200-400x agregando una gota de 5 μL en un portaobjetos de vidrio y cubra las muestras inmediatamente con un cubrebocas.<ol>
<li>Confirmar la presencia de leptospiras vivas y viables recuperadas de las colonias.</li>
		<li>Después de la visualización y confirmación de leptospiras viables, transferir 100 μL de células a medios HAN líquidos que contienen 40 μg/mL de espectinomicina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después del crecimiento en medios han líquidos, evaluar los cultivos para la presencia del plásmido con cebador pMaOri2 F (ACGCAATGTATCGATACCGAC) y R (ATAGGTGAAGTAGGCCCACCC), que reconocen la región que flanquea el casete sgRNA.<ol>
<li>Recoger 200 μL de cultivo, centrífuga (4.000 x g,15 min), desechar el sobrenadante y resuspend el pellet resultante en 20 μL de agua.</li>
		<li>Utilice esta suspensión como plantilla para pcr adicional, sin necesidad de extracción de ADN12. NOTA: Las células con pMaOri.dCas9 representarán un amplicon de 281 pb, en comparación con las que contienen los plásmidos con el casete sgRNA que representará un amplicon de 723 pb.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para la confirmación del silenciamiento de genes, realice un immunoblot utilizando extractos celulares de transconjugantes que contengan solo pMaOri.dCas9 (control negativo) y pMaOri.dCas9sgRNA.<ol>
<li>Aplique el equivalente de 5 x 107 células por carril del gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS).</li>
		<li>Proteínas de electrotransferencia a una membrana para incubación con anticuerpos apropiados. Además del anticuerpo contra el gen diana para silenciar, utilice otro para el control de carga.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantenga los cultivos mutantes en medios HAN más espectinomicina para mantener el plásmido. Si no se aplican antibióticos a los medios, se puede observar un silenciamiento génico completo durante al menos tres pasajes5.</li>
</ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transposon+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species.">Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species.</a> Infections and Immunity. 77 (2), 810-816 (2009).</li><li>Bourhy, P., Louvel, H., Saint Girons, I., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+insertional+mutagenesis+of+Leptospira+interrogans,+the+agent+of+leptospirosis,+using+a+mariner+transposon.">Random insertional mutagenesis of Leptospira interrogans, the agent of leptospirosis, using a mariner transposon.</a> Journal of Bacteriology. 187 (9), 3255-3258 (2005).</li><li>P&#283;tro&#353;ov&#225;, H., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+a+Leptospira+biflexa+mutant+library+to+identify+genes+involved+in+ethidium+bromide+tolerance.">Screening of a Leptospira biflexa mutant library to identify genes involved in ethidium bromide tolerance.</a> Applied Environmental Microbiology. 80 (19), 6091-6103 (2014).</li><li>Slamti, L., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+library+of+random+mutants+in+the+spirochete+Leptospira+biflexa+using+a+mariner+transposon.">Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon.</a> Methods in Molecular Biology. 859, 169-176 (2012).</li><li>Croda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species:+Disruption+of+the+LigB+gene+does+not+affect+virulence+in+animal+models+of+leptospirosis.">Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: Disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis.</a> Infections and Immunity. 76 (12), 5826-5833 (2008).</li><li>Picardeau, M., Brenot, A., Saint Girons, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evidence+for+gene+replacement+in+Leptospira+spp.+Inactivation+of+L.+biflexa+flaB+results+in+non-motile+mutants+deficient+in+endoflagella.">First evidence for gene replacement in Leptospira spp. Inactivation of L. biflexa flaB results in non-motile mutants deficient in endoflagella.</a> Molecular Microbiology. 40 (1), 189-199 (2001).</li><li>King, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-temperature+protein+G+is+an+essential+virulence+factor+of+Leptospira+interrogans.">High-temperature protein G is an essential virulence factor of Leptospira interrogans.</a> Infections and Immunity. 82 (3), 1123-1131 (2014).</li><li>Lambert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlaA+proteins+in+Leptospira+interrogans+are+essential+for+motility+and+virulence+but+are+not+required+for+formation+of+the+flagellum+sheath.">FlaA proteins in Leptospira interrogans are essential for motility and virulence but are not required for formation of the flagellum sheath.</a> Infections and Immunity. 80 (6), 2019-2025 (2012).</li><li>Murray, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptospira+interrogans+requires+heme+oxygenase+for+disease+pathogenesis.">Leptospira interrogans requires heme oxygenase for disease pathogenesis.</a> Microbes and Infections. 11 (2), 311-314 (2009).</li><li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence.">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathogens. 3 (7), 97 (2007).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptospiral+flagellar+sheath+protein+FcpA+interacts+with+FlaA2+and+FlaB1+in+Leptospira+biflexa.">Leptospiral flagellar sheath protein FcpA interacts with FlaA2 and FlaB1 in Leptospira biflexa.</a> PLoS One. 13 (4), 0194923 (2018).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Cress, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+CRISPR/dCas9-regulated,+orthogonally+repressible+hybrid+T7-lac+promoters+for+modular,+tuneable+control+of+metabolic+pathway+fluxes+in+Escherichia+coli.">Rapid generation of CRISPR/dCas9-regulated, orthogonally repressible hybrid T7-lac promoters for modular, tuneable control of metabolic pathway fluxes in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (9), 4472-4485 (2016).</li><li>Zhao, C., Shu, X., Sun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+gene+knockdown+system+based+on+catalytically+inactive+("dead")+Cas9+(dCas9)+in+Staphylococcus+aureus.">Construction of a gene knockdown system based on catalytically inactive ("dead") Cas9 (dCas9) in Staphylococcus aureus.</a> Applied Environmental Microbiology. 83 (12), (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/dCas9-mediated+multiplex+gene+repression+in+Streptomyces.">CRISPR/dCas9-mediated multiplex gene repression in Streptomyces.</a> Biotechnology Journal. , 1800121 (2018).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Después de la secuenciación temprana de las especies patógenasde 15,16, 17,18 y saprofíticas19Leptospira, la minería de datos del genoma arrojó luz sobre varios aspectos de la patogénesis de la leptospira. En la mayoría de los casos, la función de la proteína se exploró mediante el uso de la contraparte recombinante de las proteínas supuestas expuestas a la superficie de la leptospira y la posterior especulación de la función de la proteína nativa20,21,22, 23,24,25,26. 
La generación de mutantes, y la evaluación de su respectivo fenotipo, son componentes clave del análisis genómico funcional. Los intentosinicialesde generar mutantes en Leptospira spp. sin embargo, después de un análisis extenso y laborioso para inferir la identidad de genes alterados, se observó que sólo el 15% de todos los genes en L. interrogans serovar Manilae fueron interrumpidos27. El knockout dirigido del gen fue alcanzado más a fondo por la recombinación homóloga que utilizaba los plásmidos del suicidio para entregar un cassette de la resistencia antibiótico flanqueado por los brazos homólogos dentro de la blanco deseada31,32.
Mediante la aplicación de estas tecnologías, se exploraron varios aspectos de la biología básica de la leptospira y la virulencia31,33,34,35,36,37. El desarrollo del vector lanzadera conjugativa E.coli-Leptospira, pMaOri 11,permitió la entrega de componentes para el silenciamiento de genes episomales.
Anteriormente se demostró que la rotura de doble cadena inducida por Cas9 es letal para Leptospira spp. y, como alternativa, la variante catalíticamente inactiva de la enzima, dCas9, se puede utilizar para lograr el silenciamiento génico tanto en especies saprófitas como patógenas4,5. Mediante el uso del plásmido pMaOri.dCas9 como columna vertebral para la ligadura de casetes de sgRNA, se puede obtener un silenciamiento génico específico y estable debido a la expresión tanto de dCas9 como de sgRNA; dCas9-bound sgRNA llevará a la proteína a la diana deseada por el emparejamiento de bases Watson-Crick.
Para el silenciamiento génico completo, el protoespaciador debe diseñarse en base a la hebra de plantilla del gen deseado para que el emparejamiento de bases del sgRNA se produzca con la hebra codificante. Basado en un contenido promedio de C+G del 35% en Leptospira spp., el PAM 5'-NGG-3' ocurrirá al menos 3 veces cada 100 pb. Por lo tanto, prácticamente cualquier gen dentro del genoma de Leptospira contendrá al menos un PAM. Sin embargo, si no se encuentra el motivo NGG, se puede evaluar el motivo NAG alternativo.
Las técnicas anteriores de silenciamiento de genes, como los dedos de zinc y TALE (efectores similares a los activadores de la transcripción), se basaron en la construcción de una proteína diferente para cada diana, lo que hace que estas técnicas sean laboriosas y costosas38. En el caso de CRISPRi, el componente variable es el sgRNA, por lo que es necesario cambiar solo los 20 pb en el extremo 5'. Se ha observado un silenciamiento génico completo, estable y dirigido no sólo en Leptospira spp.4,5,sino también en otras bacterias8,39,40,41.
El desarrollo de HAN media13 favoreció la recuperación de mutantes al reducir drásticamente el tiempo de incubación para la formación de colonias y permitir que Leptospira creciera a 37 oC. Sin embargo, durante la etapa de conjugación, no se recomienda su uso ya que E. coli puede proliferar vigorosamente en este medio y superar la proporción prevista de 1:1 entre las células donantes y receptoras. En esta etapa, EMJH más DAP es la mejor opción, ya que E. coli se replica mal en este medio. Vale la pena mencionar que algunos laboratorios hacen EMJH suplementada internamente, que puede contener componentes adicionales que también podrían apoyar el crecimiento de las células de E. coli. 
El protocolo de conjugación aquí presentado fue optimizado para L. interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130, y también se demostró que es eficaz en la transformación de una cepa patógena recientemente aislada a partir de muestras de suelo5. Los intentos iniciales con diferentes serovares de especies de L. borgpetersenii indican menores eficiencias de conjugación con el protocolo descrito. Así, cuando se trabaja con diferentes especies/serovares de Leptospira,las condiciones óptimas para la conjugación deben determinarse empíricamente, considerando las proporciones donante:célula receptora, densidades celulares iniciales, medios de conjugación y tiempo (24 y 48 h). Es razonable suponer que diferentes especies de Leptospira y serovares se comportarán de manera diferente con diferentes protocolos de conjugación.
A pesar de que las colonias saprófitas de Leptospira son relativamente fáciles de visualizar en placas, las colonias patógenas pueden ser más difíciles de observar. Normalmente, mediante el uso de medios HAN suplementados con suero de conejo al 0,4% y espectinomicina, se pueden observar colonias transconyugantes al día 10. En nuestra experiencia, las colonias se presentan inicialmente como un halo transparente en la superficie de los medios. En el protocolo de vídeo, se muestran colonias más densas, después de 14 días de crecimiento, ya que las transparentes eran difíciles de filmar. En esta etapa, la rotación de la placa para lograr una incidencia de luz diferente y el cambio entre fondos blancos y oscuros puede ayudar a identificar colonias.
Para la validación de mutantes, el immunoblotting ofrece un enfoque sencillo; sin embargo, dado que los anticuerpos no siempre están disponibles contra las proteínas diana, se pueden buscar estrategias alternativas para validar el silenciamiento de genes. La PCR cuantitativa de transcriptasa inversa (qRT-PCR) utilizando cebadores para el gen diana y un control constitutivo es eficaz para validar el silenciamiento génico ya que el dCas9 guiado por sgRNA es responsable del bloqueo de la transcripción génica. Si el gen diana codifica una banda proteica claramente definida en geles proteicos, SDS-PAGE puede demostrar silenciamiento, y según el silenciamiento del gen lipL325. Si se silencian los genes de la biosíntesis de los LPS, la coloración de los LPS puede ser empleada; en el caso de silenciar genes que codifican para enzimas con sustratos bien definidos, los ensayos cinéticos con sustratos cromogénicos son estrategias válidas; Β-galactosidasa silenciamiento en L. biflexa fue validado mediante el uso de X-gal y ONPG (orto-Nitrofenil-β-galactósido) sustratos4.
Después de la confirmación del silenciamiento de genes, los experimentos se pueden diseñar para evaluar más a fondo el fenotipo. Los ensayos de unión se pueden realizar en el caso de silenciar las adhesinas bacterianas; los análisis del suero-desafío confirmaron el papel de LigA y de LigB en la supervivencia del suero exhibida por Leptospirapatógena5. Los mutantes también se pueden utilizar para inocular animales para evaluar la atenuación de la virulencia; en este caso, los animales inoculados con el mutante deben compararse con los infectados con células que contienen pMaOri.dCas9 solamente.
En conclusión, el protocolo actual describe la aplicación de CRISPRi para el silenciamiento de genes en especies patógenas de Leptospira utilizando medios HAN para facilitar la recuperación de mutantes en un plazo de 10 días. El silenciamiento génico combinado con el análisis genómico funcional mejorará nuestra comprensión de los mecanismos patógenos de Leptospiray, en última instancia, conducirá al desarrollo de mejores estrategias profilácticas para el control de la enfermedad.

La leptospirosis es una zoonosis mundial desatendida causada por especies patógenas y virulentas del género Leptospira. En humanos, la enfermedad representa más de un millón de casos y 60.000 muertes al año en todo el mundo1,2. Hasta el momento, no existe una vacuna eficaz y a largo plazo para la enfermedad. La identificación de factores de virulencia y mecanismos patógenos es fundamental para el desarrollo de mejores estrategias terapéuticas y profilácticas. Por lo tanto, la capacidad de generar mutaciones genéticas y evaluar el fenotipo resultante es fundamental para el análisis genómico funcional3.
La construcción de mutantes en Leptospira patógena se consideraba, hasta ahora, inherentemente ineficiente, laboriosa, costosa y difícil de implementar. Este escenario cambió drásticamente con la aplicación de la reciente interferencia CRISPR (CRISPRi) a leptospiras saprófitas4 ypatógenas 5.
El silenciamiento génico se consigue mediante la expresión de dos componentes: una variante de la enzima CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/C RISPR associated) enzima Cas9 de Streptococcus pyogenes,llamada catalíticamente muerta Cas9 (dCas9) y un ARN de guía única (sgRNA), que puede ser editado según el objetivo deseado6,7,8. La proteína dCas9, cuando se une al sgRNA, se dirige a dianas específicas de ADN mediante el emparejamiento de bases de Watson y Crick, causando un bloqueo estérico a la elongación de la ARN polimerasa, lo que resulta en el silenciamiento de genes debido a la transcripción obstruida del gen7 (Figura 1).
Este manuscrito tiene como objetivo describir la construcción del plásmido para expresar tanto dCas9 como sgRNA, la conjugación entre el donante de E. coli β2163 y las células receptoras de Leptospira, la recuperación transconjugante y, finalmente, la validación de colonias mutantes seleccionadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m pore size mixed cellulose esters membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>VCWP02500</td>
			<td>Filtration for bacterial conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-Diaminopimelic acid (DAP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1377</td>
			<td>Growth of auxotrophic E. coli &#946;2163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Noble</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214230</td>
			<td>Used for preparation of solid EMJH and HAN plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used for preparation of solid LB plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL substrate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10297-018</td>
			<td>dNTPs for PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microanalysis Filter Holder</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX1012530</td>
			<td>Filtration for bacterial conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td>Chemiluminescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>244620</td>
			<td>Lysogenic liquid medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>279510</td>
			<td>Supplementation of EMJH media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Medium Base EMJH</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>279410</td>
			<td>EMJH medium for Leptospira</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN TGX Gels 12%</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4568043</td>
			<td>Used for polyacrylamide gel eletrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical density reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M2</td>
			<td>For optical density measurements of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 7.4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td>Saline solution for washing bacterial pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0692</td>
			<td>Selection of pMaOri backbone plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0402</td>
			<td>Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Used for PCR reaction cycling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine (dT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9250</td>
			<td>Growth of auxotrophic E. coli &#960;1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XmaI restriction enzyme</td>
			<td>New Englan BioLabs</td>
			<td>R0180L</td>
			<td>Digestion of plasmids and inserts</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of crispr interference (crispri) for gene silencing in pathogenic species of leptospira

La leptospirosis es una zoonosis global desatendida, responsable de al menos 1 millón de casos al año y casi 60 mil muertes. La enfermedad es causada por bacterias patógenas y virulentas del género Leptospira,ya sea por contacto directo con las bacterias o indirectamente por la exposición al agua o al suelo contaminados. Los animales domésticos y salvajes actúan como reservorios de la infección, arrojando leptospiras de los túbulos renales colonizados del riñón, a través de la orina, al medio ambiente. La generación de cepas mutantes de Leptospira es fundamental para evaluar y comprender los mecanismos patógenos de la infección. La interferencia CRISPR (CRISPRi) ha demostrado ser una herramienta sencilla, asequible y específica para el silenciamiento de genes en leptospirapatógena. Por lo tanto, se describirán los detalles metodológicos de la obtención de los constructos del plásmido que contienen tanto dCas9 como ARN guía, la entrega de plásmidos a Leptospira por conjugación con la cepa β2163 de E. coli, y la recuperación y evaluación transconjugantes. Además, los medios de hornsby-alt-nally (HAN) recientemente descritos permiten el aislamiento relativamente rápido y la selección de colonias mutantes en placas de agar.

A pesar de que el contenido de CG en los genomas de Leptospira spp. es típicamente alrededor del 35%; es probable que prácticamente todos los genes contengan el PAM 5'NGG 3'; este motivo debe considerarse en la hebra de la plantilla. Después de introducir la secuencia codificante de un gen (desde el inicio hasta los codones de parada), basándose en los resultados de CHOPCHOP, los protoespaciales deben seleccionarse en la hebra menos (-, plantilla). Es importante no incluir el motivo NGG en el protoespaciador sgRNA de 20 nt.
Si la conjugación se realiza con una proporción de 1:1 donante:célula receptora, durante 24 h en la superficie de las placas de agar EMJH más DAP, y 200 μL de la suspensión bacteriana recuperada se extienden sobre HAN más placas de agar espectinomicina, las colonias de transconjugantes deben ser visibles aproximadamente a los 8-10 días. La dispersión de este volumen normalmente resulta en 20-40 colonias por placa (Figura 3A). Para comprobar la viabilidad celular después de la conjugación, las células se pueden diseminar a placas HAN sin selección de antibióticos. En este caso, las colonias se pueden observar tan pronto como 7 días. Las placas HAN se vuelven de color amarillo pálido en una atmósfera de 3% de CO2.
Después de la recolección de colonias y el crecimiento en medios líquidos más espectinomicina, se puede utilizar la PCR utilizando células enteras y cebadores pMaOri2 para un control de calidad inicial de los transconjugantes (Figura 3B). Las células leptospirales que contienen el plásmido control pMaOri.dCas9 deben dar lugar a un amplicon de 281 pb, mientras que aquellas células que contienen el plásmido para silenciar, es decir, que contienen tanto dCas9 como sgRNA, deben dar lugar a un amplicon de 723 pb. Las cartillas pMaOri2 F y R fueron diseñadas para flanquear el sitio de la restricción de XmaI, que es el sitio usado durante la ligadura del cassette del sgRNA.
Con la confirmación de la presencia de plásmidos, las células se pueden cosechar de los medios, lavarse dos veces con PBS y luego usarse para preparar un extracto de células enteras para immunoblotting. Si se produjera el silenciamiento, las proteínas diana, en este caso, ya sea LipL32 o ligA y LigB, deben observarse únicamente en las células de tipo salvaje y en las que contienen pMaOri.dCas9; incluso con tiempos de exposición más altos, no deben ser visibles proteínas correspondientes en las células que contienen pMaOri.dCas9sgRNA(Figura 3C).
Si se planifican experimentos para evaluar la virulencia de la leptospira después del silenciamiento génico, los cultivos utilizados para la conjugación deben ser de leptospiravirulenta de bajo paso. Después de que se confirma el silenciamiento de genes, se pueden congelar varias alícuotas como respaldo. Si el gen silenciado tiene un fenotipo medible, por ejemplo, basado en trabajos previos con proteínas recombinantes, los cultivos se pueden utilizar para la validación y, en este caso, las células que contienen pMaOri.dCas9 solamente, se pueden incluir como un control negativo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62631/62631fig01.jpg"> Figura 1:Desarrollo de dCas9 y sgRNA que expresan plásmido. (A)Un protoespacielo de 20 nt de largo, seguido por el PAM 5'-NGG-3' de S. pyogenes dCas9, se selecciona dentro de la hebra de plantilla del gen diana para que el sgRNA posterior pueda realizar el emparejamiento de bases de Watson y Crick con la hebra codificante correspondiente, lo que resulta en un silenciamiento completo de genes. (B) El casete sgRNA está compuesto por el promotor lipL32, el protoespaciador de 20 nt y el andamio dCas9. El plásmido pMaOri.dCas9 se utiliza como columna vertebral para la ligadura de casete sgRNA en el sitio de restricción XmaI. El plásmido resultante, denominado pMaOri.dCas9sgRNA se entrega a los leptospiras, y la expresión tanto de dCas9 como de sgRNA es responsable del silenciamiento génico. (C)sgRNA-dirigido dCas9 actúa como una barrera física a la elongación de la ARN polimerasa, por lo tanto, dificultando la transcripción. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/62631fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62631/62631fig02.jpg"> Figura 2:Representación esquemática del protocolo de conjugación. La especie deseada de Leptospira se cultiva en medios HAN, bajo agitación, hasta D.O. de 0.2-0.4 (fase de registro medio) a 420 nm. Un día antes de la conjugación, una colonia de donante recombinante de E. coli β2163 que contiene el plásmido de interés se recoge de las placas de agar LB+DAP+Spc, ya que las células se cultivan durante la noche en LB líquido con la misma suplementación. Al día siguiente, saturado E. Los cultivos de coli se diluyen en LB más DAP y se cultivan hasta la D.O. de 0.2-0.4 a 420 nm. Tanto el donante de E. coli como el receptor de Leptospira se mezclan a una proporción de células de 1:1 en la superficie de un filtro de 0,1 μm mediante un aparato de filtración bajo presión negativa. Luego, los filtros se colocan encima de las placas de agar EMJH complementadas con DAP, y la incubación continúa durante 24 h a 29 °C. El uso de EMJH limita la proliferación de E. coli, y se mantiene la proporción prevista de 1:1. Las bacterias se recuperan de los filtros mediante pipeteo con medios HAN de 1 mL, y las suspensiones se visualizan bajo microscopía de campo oscuro. Por último, se siembran 100-200 μL de cada suspensión en placas de agar HAN que contienen suero de conejo al 0,4% y se incuban a 37 °C en un 3% deCO2. En esta etapa, se omite la DAP, y como resultado, E. coli auxotrófica no crecerá. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/62631fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62631/62631fig03.jpg"> Figura 3:Resultados representativos para la evaluación de mutantes. (A)Se recogen colonias de placas que contienen Leptospira transformadas con pMaOri.dCas9 vacío (control negativo para futuros experimentos) y plásmidos pMaOri.dCas9sgRNA (con el gen dirigido silenciado), se homogeneizan vigorosamente en HAN líquido y se cultivan en HAN líquido que contiene espectinomicina. Las células recombinantes pueden ser validadas por PCR con cebadores flanqueando el sitio XmaI dentro de pMaOri.dCas9. (B)En este caso, las células que contenían pMaOri.dCas9 sólo resultaron en un amplicon de 281 pb, mientras que aquellas células que contenían el plásmido para silenciar, que contenía tanto dCas9 como sgRNA, mostraron un amplicon de 723 pb. Después de la confirmación de la presencia de los plásmidos, el silenciamiento del gen fue validado por análisis del immunoblot. (C)Se recomienda la incubación con anticuerpos tanto contra la proteína diana como contra una proteína control de carga; en el inmunoblot representativo, se muestran extractos de células enteras de transconjugantes que contienen pMaOri.dCas9 solos o con casetes de sgRNA dirigidos a lipL32 (pMaOri.dCas9sgRNAlipL32) y los genes LigA y LigB (pMaOri.dCas9sgRNAligAB). La co-incubación con anti-LipL32, anti-LigAB y anti-LipL41 (no objetivo, control de carga) confirma que la expresión de la proteína LipL32 se suprime en células que contienen pMaOri.dCas9sgRNAlipL32 y tanto LigA como LigB en células que contienen pMaOri.dCas9sgRNAligAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/62631fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
Archivo suplementario: Secuencia de casete de ARN de guía única (sgRNA). La transcripción sgRNA es dirigida por el promotor constitutivo lipL32 (nucleótidos en negrita). sgRNA se compone de 20 nucleótidos que se refieren al protoespacial, responsable del emparejamiento de bases a la cadena codificante del gen diana, y la secuencia de andamios dCas9 (nucleótidos subrayados). Xma Los sitios de restricción I (cccggg) se incluyen en ambos extremos para la ligadura en el plásmido pMaOri.dCas9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/Supplementary%20File.docx" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Application of CRISPR Interference CRISPRi for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Aquí, se describe la aplicación de la interferencia CRISPR (CRISPRi) para el silenciamiento de genes específicos en especies de Leptospira. Las células de leptospira se transforman por conjugación con plásmidos que expresan dCas9 (catalíticamente "muerto" Cas9) y un ARN de guía única (sgRNA), responsable del emparejamiento de bases a la diana genómica deseada. Se presentan métodos para validar el silenciamiento génico.

Aplicación de interferencia CRISPR (CRISPRi) para silenciamiento de genes en especies patógenas de Leptospira

Leptospirosis is a global neglected zoonosis, responsible for at least 1 million cases per year and almost 60 thousand deaths. The disease is caused by ...

Mi nombre es Jarlath Nally, y soy parte del equipo de investigación aquí en el Centro Nacional de Enfermedades Animales en Ames, Iowa, y trabajamos en la leptospirosis. La leptospirosis es una enfermedad desatendida. Es una enfermedad global.Y realmente, tenemos una comprensión muy limitada de cómo este grupo único de bacterias causan la infección. Por lo tanto, la presentación de hoy trata de proporcionar una visión general de una nueva herramienta que está disponible para facilitar la evaluación de los mecanismos patógenos de la leptospirosis silenciando específicamente genes específicos expresados por la leptospira, utilizando una técnica llamada interferencia CRISPR. Sin embargo, la capacidad de seleccionar colonias de newton depende mucho de proporcionar el mejor medio de crecimiento para estas leptospiras fastidiosas.Así que, en primer lugar, vamos a presentarles a Rick Hornsby, quien fue muy brevemente presente un nuevo medio para propagar estas bacterias fastidiosas. Y luego les presentaremos a Louis Fernandez, quien hablará sobre la metodología de interferencia CRISPR para silenciar los genes diana dentro de la leptospira. Hola, soy Rick Hornsby.Desde su identificación por Anada hace más de 100 años, las leptospiras han sido típicamente aisladas y propagadas a 29 grados Centígrados, una temperatura que no refleja ni el medio ambiente ni la temperatura corporal del huésped mamífero. Hace 10 años, usda ERS comenzó a investigar mejoras en los medios de leptospira y a partir de esta investigación, Hornsby-Alt-Nally medios se desarrolló. Utilizando este medio, los médicos e investigadores han sido capaces de aislar y propagar más rápidamente las leptospiras de casos de campo y en la investigación in vitro a una temperatura y en un ambiente que emula más de cerca al huésped mamífero.Seguimos optimizando este medio, pero tal y como está, HAN ha demostrado potencial para mejorar significativamente los aislamientos clínicos veterinarios y humanos en la investigación in vitro y el desarrollo de vacunas más eficaces para la prevención de la leptospirosis. Hola, soy Luis Fernández. Hasta ahora, la patogenesia de la leptospirosis seguía siendo debajo-explorada, principalmente debido a la carencia de tubos genéticos eficaces y fáciles de realizar.Aquí vamos a describir una nueva técnica llamada interferencia CRISPR o CRISPRi. Y esta técnica es muy simple porque sólo necesitamos expresar dos componentes, una proteína de unión al ADN llamada Cas9 muerto, o dCas9, y una molécula de ARN quimérico llamada ARN de guía única. Y el complejo dCas9 y el ARN guía van a hacer emparejamiento de bases a nuestro gen objetivo y por lo tanto reducir o incluso bloquear la transcripción.También mediante el uso de los medios han recientemente descritos, podríamos disminuir drásticamente el tiempo de formación de colonias para una recuperación mutante. El primer paso es definir el protoespacial que estará contenido en el ARN guía. Esta secuencia comprende 20 nucleótidos que definirán el emparejamiento de bases con los objetivos genéticos deseados.Envíe una secuencia de nucleótidos al servidor web CHOPCHOP, con parámetros definidos para streptococcus pyogenes, Cas9, y el motivo adyacente del protoespaciador, NGG. En función de los resultados, seleccione protoespaciales con las mejores puntuaciones dentro de la tendencia menos. El motivo NGG no se incluirá en la secuencia final.Hemos estado utilizando el promotor lipL32 para expresar el ARN de guía única, que contendrá la variable 20 nucleótidos a cinco primos en un andamio dCas9 conservado. Después de obtener el casete será relegado al PMaOri. Plásmido dCas9 en el sitio de restricción Xma1.Para la conjugación las células de la leptospira se cultivan en 29 o 37 grados centígrados en medios de HAN. Un día antes de una conjugación, las células igualadas dispensadas donante se crecen en los medios de la libra complementados con el ácido diaminopimelic, el DAP, y la espectinomicina. A continuación, en el día de la fusión de la parrilla los cultivos saturados de E. coli en LB más DAP.Dentro de una campana de bioseguridad, ensambló el aparato de filtración colocando el filtro de membrana en la parte superior de la base de vidrio, seguido de un embudo de vidrio de 15 ML. Ambas piezas se mantienen unidas por esta abrazadera de resorte. Luego conecte el vidrio a una bomba de vacío, agregue cinco ML de cultivos de leptospira al embudo.A continuación, agregue la cepa E.Coli beta 2163 que contiene el plásmido de interés. El volumen variará según la densidad óptica del cultivo. Nuestro objetivo es la gaisión de células uno a uno.Gire la bomba de vacío, ahora los líquidos que vamos a conseguir a través de la membrana y las células se concentrarán en la parte superior de la misma. Tome el filtro y colócalo en la placa EMJH más DAP, bicurier lado hacia arriba. Incubar las placas a 29 grados centígrados durante 24 horas.Luego recupere los filtros de las placas y colóquelo en un tubo cónico de 50 ML. Utilice un ML de soporte HAN líquido para recuperar las celdas del filtro mediante pipeteo. Visualice las células recuperadas por microscopia de campo oscuro.En esta etapa se pueden observar números equivalentes de E. coli y leptospiras. Se utilizan de 100 a 200 microlitros para propagar las bacterias en placas HAN que contienen espectinomicina. En esta etapa, se omite el DAP y E. coli no crecerá.Las placas se incuban a 37 grados centígrados y 3% de CO2. Las colonias deben ser evidentes entre ocho a 10 días. Las colonias de Leptospira interrogans son un poco difíciles de visualizar.Aquí estamos mostrando colonias cubiertas de vegetación para que sea más fácil verlas. Añadir 100 microlitros de HAN líquido, a 1,5 tubos ml para la recuperación de los mutantes. Se recomienda tomar al menos tres colonias de cada placa.Usando una punta de pipeta, las colonias individuales se recuperarán de las placas. Se espera que Agger sea tomado solo. Las colonias deben tomarse de las placas de control que contienen MTP PMaOri.dCas9 plásmido. Y placas con leptospiras que contienen plásmido con dCas9 y ARN guía diseñado para el gen diana. Las células recuperadas ahora se pueden visualizar bajo microscopía de campo oscuro para confirmar la presencia de leptospiras viables.Después de la visualización de las leptospiras de la licencia, transfiera las células a los medios líquidos de HAN que contienen espectinomicina. Después del crecimiento del cultivo, las células ahora se pueden recuperar para silenciar la confirmación y la evaluación del fenotipo. Si los anticuerpos contra las proteínas diana están disponibles immunoblot es una metodología sencilla para evaluar el silenciamiento.Leptospiras que contienen pMAOri. dCas9 solos, o con la guía de ARN Cas se evalúan por PCR, cebadores de madera flanqueando. El plásmido DMT dará como resultado una banda de aproximadamente 300 pares de bases y se alcanza un único tipo de alrededor de 700 cuando el cassette de ARN guía está presente.Immunoblots usando los extractos enteros de la célula se realizan para silenciar la confirmación, la expresión de la proteína lipL32 se suprime en las células que contienen los plásmidos expresados en dCas9 y el ARN de la guía apuntando este gen. Y tanto el enlace a como el enlace B están ausentes en las células que contienen el ARN guía, es específico para ambos genes. El control lipL41 se puede ver en todos los carriles.Así que hemos usado la interferencia CRISPR en leptospira interrogans, también la hemos usado en varias especies patógenas adicionales de leptospira. Lo hemos utilizado para silenciar genes específicos, así como para silenciar la expresión de pequeños ARN no codificantes. Nuestro interés de investigación está en la comprensión de los mecanismos patógenos de la infección, por lo que normalmente buscamos identificar los factores de varianza, pero obviamente puede silenciar su propio gen de elección y de acuerdo con su propia área de investigación.Y por ejemplo, eso podría ser la motilidad o la comprensión de cómo las leptospiras persisten en el medio ambiente, o el metabolismo. En cualquier caso, deberías ser capaz de generar un mutante específico que te permita realizar genómica funcional y entender la importancia biológica del gen en cuestión. Así que de todos nosotros aquí en el Centro Nacional de Enfermedades Animales, le deseamos la mejor de las suertes con su investigación.

Research

JoVE Journal

Genetics

Application of CRISPR Interference (CRISPRi) for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Investigación

Genética

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Un protocolo para la producción de vectores lentivirales integrasa deficientes para CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout en dividir las células

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganización de la estructura de bucles de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene edición para hacer condicionales mutantes de humano parásito de la Malaria por p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Disección de la función del reforzador mediante Multiplex basados en CRISPR potenciador de interferencia en líneas celulares

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overexpressing larga Noncoding RNAs mediante activación de gen CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...