Name: single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

ونحن ممتنون للمناقشات العلمية مع الدكتور بنجامين تشين. تم تمويل هذا العمل من قبل K08AI120806 (THS) وR01DA052255 (THS و KB) وR21AI152833 (THS و KB).

1. إعداد الخلايا للتصوير
<ol><li>إعداد محلول تحميل Fluo-4 AM الطازج: أضف 25 ميكرولتر من مذيب المنظفات المركزة 100x ، ثم أضف 2.5 ميكرولتر من Fluo-4 AM 1000x إلى أنبوب 1.5 مل. دوامة لخلط.</li>
	<li>Pipette 2.5 مل من وسائل الإعلام الثقافة في حل التحميل وعكس لخلط. حماية من الضوء.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي 2 × 106 خلايا MT-4 في 500 × <...

<ol>
	<li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+inflammation,+and+HIV+infection.">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li><li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection.">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li><li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors:+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation.">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).</li><li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions.">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li><li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages.">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors.">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+(IL-10)+and+IL-1&#946;+in+a+human+tonsil+explant+model.">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1&#946; in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).</li><li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures.">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases.">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li><li>Chen, P., H&#252;bner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses.">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li><li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca(2+)-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomi&#263;, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels.">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li><li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs.">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).</li><li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity.">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010 (2018).</li><li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform.">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).</li><li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+cell+identification+and+sorting+(LACIS)+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device.">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41 (2018).</li><li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light.">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li><li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator.">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion.">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion.">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).</li></ol>

يمكن تكييف المنهجية الموصوفة لدراسة العلاقة بين تدفق الكالسيوم والعدوى المنتجة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في الخلايا المفردة لدراسة الحركية الكالسيوم داخل الخلايا استجابة لناهضات أخرى أو الخصوم من الفائدة. إعداد الخلايا للتصوير بسيط، والحد الأدنى من الوقت المكثف، والكواشف متوفرة في ?...

الالتهاب المزمن هو السبب الرئيسي للأمراض المبكرة المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية والوفيات1و2و3. هناك آليات متعددة حيث فيروس نقص المناعة البشرية يمكن تنشيط الإشارات الالتهابية، وتشير الأدلة الأخيرة دورا لمستقبلات P2X في دخول فيروس نقص المناعة البشرية التي هي الكالسيوم غاتينج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) مستقبلات3،4،5،6،7،8،9،10. قد يكون النوع الفرعي P2X من مستقبلات الpurinergic (P2XR) ميسرين مهمين لهذا الالتهاب. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية لتفاعلات فيروس نقص المناعة البشرية-P2XR غير معروفة إلى حد كبير وقد تؤثر على خطوات دورة الحياة الفيروسية المبكرة والمتأخرة لفيروس نقص المناعة البشرية-1. إن تحديد المسارات والحركة التي تقود الالتهاب المزمن المرتبط بفيروس نقص المناعة البشرية أمر بالغ الأهمية لتعزيز خيارات العلاج للأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية.
لتقييم ما إذا كان فيروس نقص المناعة البشرية-1 يعذب مستقبلات P2X بشكل مباشر، يجب قياس تنشيط P2XR والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 بالتوازي. تم تحديد مقايسات نشاط P2XR والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 بشكل مستقل: تدفق الكالسيوم الخلوي هو مؤشر على تنشيط P2XR ، ويمكن قياس العدوى المنتجة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 حسب وفرة الحمض النووي الريبي. الكشف عن الفلورية لتدفق الكالسيوم ممكن مع صبغ فلو-4 الحساسة للكالسيوم، ويمكن تصور عدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1 مع mCherry الفلورسنت مراسل فيروس HIV-NLCI11،12،13،14،15.
لأن هذه المؤشرات لتنشيط P2X (تدفق الكالسيوم الخلوي الحاد) والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 (HIV-1 RNA synthesis) تحدث على جداول زمنية مختلفة (دقائق مقابل أيام) ، هناك نقص في طريقة عالية الإنتاجية تسمح بالتحليل المقترن لتنشيط P2XR والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1. تسمح التقنيات التجريبية القياسية عالية الإنتاجية، مثل قياس التدفق الخلوي، بتحليل السكان ولكنها لا تستطيع تقييم العلاقة بين الأحداث الحادة والطولية في الخلايا المفردة. بدلا من ذلك، التصوير أحادي الخلية مع المجهر الفلوري القياسي منخفض الإنتاجية. هذه القيود التجريبية تمثل حاجة إلى تقنيات جديدة وعالية الإنتاجية لقياس الارتباطات بين الأحداث الخلوية الحادة والطولية مباشرة.
نظام optofluidic الموصوف هو منصة جديدة قادرة على فرز الخلية الواحدة والعزلة ، والاستزراع ، والتصوير ، وأتمتة البرامج16،17،18،19. يقدم هذا النظام بديلا متكاملا عالي الإنتاجية لقيود طرق التصوير التقليدية. تتكون منصة Beacon من حاضنة ثاني أكسيد الكربون (CO2)والحاضنة التي يتم التحكم في درجة حرارتها والتي تدعم الخلايا الموجودة على رقاقة. تمتلك الشريحة ترانزستورات حساسة للضوء تولد تدرجا كهربائيا استجابة للضوء المستهدف. يتم استخدام هذه القوة العازلة الناتجة لنقل الخلايا الفردية عبر رقاقة النانوفلويديك إلى المناطق المرغوبة. يتم فرز الخلايا إلى أقلام على الشريحة ، والتي توفر حاجزا لعزل الخلايا الفردية جسديا. التدفق المستمر للرقم من وسائل الإعلام النمو في جميع أنحاء رقاقة يمنع هجرة الخلايا من الأقلام مع السماح لنشر الجسيمات الصغيرة من المواد الغذائية والكواشف الخاصة بالتجربة. المجهر الفلوري يجلس فوق الشريحة. يتم استخدام أتمتة البرامج لالتقاط صور الشريحة عند النقطة الزمنية المحددة من قبل المستخدم.
تم إجراء جميع توصيف الخلايا باستخدام نظام optofluidic لاختيار الخلية الواحدة والتلاعب بها. يتكون هذا النظام من مكونات ميكانيكية وميكروبية وبصرية متكاملة تمكن من التلاعب بالخلايا الواحدة، والقياس، والثقافة، والتصوير. يتم تحميل الخلايا وتثقف على جهاز nanofluidic المتاح الذي يتكون من 3500 غرفة فردية (أقلام) ، كل منها قادر على عقد حجم نانولتر الفرعية. يمكن وضع الخلايا داخل الأقلام باستخدام "أقفاص" عازلة ناتجة عن الضوء ومثقفة تحت ظروف التحكم في درجة الحرارة و CO2. تسمح المركبات الدقيقة بتشويش الوسائط أو المخازن المؤقتة على الشريحة لثقافة الخلايا أو العلاج من المخدرات. إبرة المحرك يسمح لاستيراد وتصدير الخلايا من لوحات الآبار المحتضنة والمغلقة. يمكن تصوير منطقة الشريحة عند تكبير 4x أو 10x في قنوات brightfield والفلورسنت (بما في ذلك DAPI أو FITC أو TRed أو Cy5) لتوصيف الأنماط الظاهرية الخلوية أو التحليل الوظيفي. النظام بأكمله مؤتمت باستخدام البرامج التي يمكن استخدامها لسير العمل المصمم مسبقا أو التجارب المخصصة.
وقد درست العلاقات بين عدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1 وفيروس نقص المناعة البشرية 2XR، ولكن لم يتم الإبلاغ عن إجراء عالي الإنتاجية لتوصيف هذه التفاعلات بشكل مباشر بالتوازي. هنا، يصف المؤلفون منهجية لدراسة التفاعلات بين فيروس نقص المناعة البشرية وP2XR من خلال تتبع التدفق الحاد للكالسيوم والعدوى المنتجة اللاحقة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 على مستوى الخلية الواحدة. وتجدر الإشارة إلى أن هذا يؤسس أداة جديدة تسمح بقياس مباشر وعالي الإنتاجية وطولي لأهداف متعددة في خلايا واحدة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Beacon Optofluidic System</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FIJI</td>
			<td colspan="2">Open-source software</td>
			<td>PMID: 22743772, 22930834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluo-4 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;F10489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;HIV-1 NLCINL4-3</td>
			<td colspan="2">Laboratory of Benjamin Chen</td>
			<td>PMID: 28148796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td colspan="2">GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>&#160;SV30010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MT-4 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent</td>
			<td></td>
			<td>&#160;ARP-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OptoSelect 3500 chip</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Prism 9.0.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform

يسبب فيروس نقص المناعة البشرية-1 عدوى مزمنة تصيب أكثر من 37 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. يعاني المصابون بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) من الأمراض المرضية المرتبطة بالالتهاب المزمن على الرغم من العلاج المضاد للفيروسات العكوسة. ومع ذلك ، فإن هذه الإشارات الالتهابية لم تكن مميزة تماما. لم يتم التقاط دور أحداث الدخول المبكر على تنشيط أحداث الإشارات الخلوية والتعبير الجيني في المصب على مستوى الخلية الواحدة. هنا يصف المؤلفون طريقة تطبق مبادئ المجهر الفلوري للخلايا الحية على منصة آلية أحادية الخلية تقوم بثقافات وصور الخلايا عبر دورات زمنية مخصصة للمستخدم ، مما يسمح بتحليل عالي الإنتاجية للعمليات الخلوية الديناميكية. ويمكن لهذا المقايسة أن يتتبع المجهر الفلوري الحي أحادي الخلية للأحداث المبكرة التي تعقب مباشرة الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1، ولا سيما تدفق الكالسيوم الذي يصاحب التعرض للفيروس وتطور العدوى المنتجة باستخدام فيروس مراسل فلوري. يتم تحميل خلايا MT-4 بصبغة حساسة للكالسيوم ومثقفة في أقلام معزولة على جهاز نانوفلويديك. الخلايا المثقفة مصابة بفيروس مراسل فيروس نقص المناعة البشرية-1 (HIV-1 NLCI). يقيس المجهر الفلوري المتمركز فوق الجهاز النانوي تدفق الكالسيوم على مدى 8 دقائق من الدورة الزمنية بعد التعرض الحاد لفيروس نقص المناعة البشرية-1. يتم قياس العدوى المنتجة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في تلك الخلايا نفسها على مدى فترة 4 أيام. يتم تحليل بيانات التصوير من هذه الدورات الزمنية لتحديد تفاعلات مستقبلات الفيروس المضيف وديناميكيات مسار الإشارات. يقدم المؤلفون بديلا متكاملا وقابلا للتطوير لطرق التصوير التقليدية باستخدام منصة جديدة ل optofluidic قادرة على فرز الخلايا الواحدة وزراعة الخلايا والتصوير وأتمتة البرامج. يمكن لهذا المقايسة قياس حركية الأحداث في ظل ظروف مختلفة، بما في ذلك نوع الخلية أو ناهضها أو تأثير الخصم، مع قياس مجموعة من المعلمات. هذه هي الطريقة الأولى الراسخة لثقافة الخلايا الواحدة والتصوير عالية الإنتاجية النانوية: يمكن تكييف هذه التقنية على نطاق واسع لدراسة الحركية الإشارات الخلوية والتفاعلات الجزيئية الديناميكية.

يوضح الشكل 1 شكل الشريحة وبيانات التصوير الخام التي تم الحصول عليها من خلال المجهر الفلوري. يتم عرض تحديد وتتجمع الخلايا غير المصابة والمصابة عن طريق قياس mCherry في الشكل 2. يتم تحليل هذه المجموعات حركية تدفق الكالسيوم في الشكل 3، مما يدل على ال...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

هنا، نقدم بروتوكولا يتم فيه مراقبة الخلايا المفردة للأحداث الحادة والعدوى المنتجة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 على جهاز نانوفلويدي. تحدد بيانات التصوير تفاعلات مستقبلات الفيروس المضيف وديناميكيات مسار الإشارات. هذه هي الطريقة الأولى لثقافة الخلايا الواحدة عالية الإنتاجية النانوية والتصوير لدراسة الحركية الإشارات والتفاعلات الجزيئية.

توصيف أحادي الخلية لتدفق الكالسيوم والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 باستخدام منصة متعددة المقاييس Optofluidic

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

يمكن لهذا البروتوكول التقاط الحركية في الوقت الحقيقي على مستوى خلية واحدة. يمكننا قياس معلمات الخلايا الفردية استجابة للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية وربط أحداث الإشارات المبكرة بالخطوات المتأخرة لدورة الحياة الفيروسية. هذا هو بديل متكامل قابل للتطوير لأساليب التصوير التقليدية باستخدام منصة جديدة optofluidic لفرز خلية واحدة ، وزراعة ، والتصوير ، وأتمتة البرمجيات.هذه هي الطريقة الأولى الراسخة لثقافة النانوفلويدية ، عالية الإنتاجية ، الطولية ذات الخلية الواحدة والتصوير. يمكن اعتماد هذه التقنية على نطاق واسع لدراسة الحركية الإشارات الخلوية والتفاعلات الجزيئية الديناميكية في مجموعة متنوعة من حالات المرض. من المهم عرض مرئي لهذه الطريقة لنقل كيفية إعداد التجربة ، وكيف يتم فرز الخلايا بصريا إلى أقلام ، وكيفية إعداد التسريبات من خلال الشريحة.للبدء، وإعداد محلول تحميل Fluo-4 AM الطازج بإضافة 25 ميكرولتر من مذيب المنظفات المركزة 100X و2.5 ميكرولتر من 1،000X Fluo-4 AM إلى أنبوب 1.5 ملليلتر، ثم دوامة لخلط. ماصة 2.5 ملليلتر من الوسائط الثقافية في حل التحميل وعكس لخلط. أجهزة الطرد المركزي مليوني خلية MT-4 في 500 مرة G لمدة ثلاث دقائق، ثم إزالة وسائل الإعلام وإعادة إنفاق بيليه في اثنين من ملليلتر من محلول التحميل فلوو-4 AM المعدة.ماصة إعادة تعليق الخلايا في طبق بيتري 35 ملليمتر. تحتضن في 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة، ثم احتضان لمدة إضافية 15 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي الخلايا في 500 مرة G لمدة ثلاث دقائق، ثم إزالة supernatant.إعادة تشغيل بيليه الخلية عن طريق الأنابيب في ملليلتر واحد من الثقافة المتوسطة والطرد المركزي في 500 مرة G لمدة ثلاث دقائق لغسل. إعادة إنفاق بيليه الخلية عن طريق الأنابيب في وسط الثقافة بتركيز مليوني خلية لكل ملليلتر لما لا يقل عن 50 ميكرولتر. لإعداد رقاقة مع محلول التبول، مما يسهل خلية penning، تحميل أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على اثنين من ملليلتر من محلول التبول و 50 ملليلتر من الماء deionized على الصك مع رقاقة optofluidic جديدة وتشغيل وظيفة رقاقة الرطب الذي سوف الفيضانات رقاقة مع محلول التبول.احتضان رقاقة في 50 درجة مئوية وتدفق رقاقة بالماء ثلاث مرات. بمجرد الانتهاء من تدفق المياه ، قم بمسح الشريحة بثلاث دورات من 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافية. تكملة تعليق الخلية من الخطوة السابقة مع واحد لكل 100 أجزاء F127 المنظفات solute قبل التحميل للحد من احتمال الخلايا التمسك قنوات رقاقة.استخدم إبرة تصدير الأداة لاستيراد خلايا من أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر مع عملية التحميل واستيراد صغير الحجم لحجم حزمة خلية ميكرولتر خمسة. خلايا القلم باستخدام تحديد المواقع الأمثل البصريات الإلكترونية أو الجهد OEP من 4.3 فولت وخمسة ميكرومترات في الثانية سرعة القفص باستخدام وظيفة القلم التلقائي، والتي سوف لصناعة السيارات في الكشف عن خلايا واحدة، وتحيط بها مع قفص OEP، ونقلها إلى قلم قريب. إذا ظلت الخلايا ذات الاهتمام تتبع الكتابة التلقائية، فاستخدم الدالة القلم اليدوي لتحديد الخلايا المستهدفة والقلم الوجهة.بمجرد الانتهاء من الكتابة ، قم بمسح الشريحة بثلاث دورات من 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافية لمسح أي خلايا غير مبندة متبقية من الشريحة. بعد تأليف الخلايا، والحصول على صور الفلورسنت من الخلايا في FITC، تكساس الأحمر وقنوات DAPI لقياس خط الأساس فلوو-4، mCherry، وoutofluorescence. غرس فيروس نقص المناعة البشرية-1 في رقاقة في تركيز 13 نانوغرام من فيروس نقص المناعة البشرية-1 NLCI لكل مليوني خلية عن طريق أنبوب ببطء تعليق في رقاقة من خلال إبرة التصدير.مباشرة بعد إضافة فيروس نقص المناعة البشرية-1، والحصول على صور مرارا وتكرارا في قنوات FITC وDAPI على مدى دورة زمنية لمدة 10 دقائق. الحصول على الصور في قنوات تكساس الأحمر وDAPI في واحد واثنين وثلاثة وأربعة أيام بعد العدوى. وقد استخدمت هذه المنهجية لتحديد الخلايا المصابة وغير المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وتتجمع فيها عن طريق قياس mCherry.تم تجميع الخلايا التي لديها تغيير في إشارة mCherry أكبر أو أقل من 40،000 متوسط كثافة الفلورسنت في ارتفاع mCherry أو انخفاض عدد السكان mCherry على التوالي. تم تحليل هذه المجموعات حركية تدفق الكالسيوم عن طريق قياس الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام فلو-4 فلوريسينس مرارا وتكرارا على مدى دورة زمنية مدتها تسع دقائق، مما يدل على تدفق الكالسيوم في وقت مبكر في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. ولوحظ وجود ارتباط إيجابي كبير بين تدفق الكالسيوم وفلوريسانس mCherry.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تبدأ مع الخلايا ضمن نطاق النمو الأسي لإنتاج الفيروسات والعدوى على حد سواء لأن الخلايا المتضخمة سيؤدي إلى انخفاض كبير في إشارة من هذا المقايسة. يمكن أن يكون العمل مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 خطرا. لذلك ، ينبغي دائما أن تؤخذ ممارسات BSL-2 كما هو مبين في معيار مسببات الأمراض المنقولة بالدم OSHA أثناء إجراء هذا الإجراء.هذه التقنية مثيرة لأنها ستسمح لنا بدراسة التغيرات الظاهرية أحادية الخلية أو النسخ في ظل ظروف خاضعة للرقابة. وهذا له إمكانات واسعة لربط تأثير المحفزات على المسارات الجزيئية في العديد من أنواع الخلايا.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

تمييز خلايا محددة HIV - 1 الإيجابية باستخدام المتجهات التي تعتمد على رؤيا Lentiviral وإذ تعرب عن البروتين الأخضر نيون

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

التنبؤ الإشتخدام HIV-1 Coreceptor (Tropism) من خلال تحليل تسلسل الوراثي باستخدام نهج

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating في المختبر من HIV - 1 النوى

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

وحيد الخلية تحليل<emالعصوية الرقيقة> الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

تقييم الفطرية الاستشعار من HIV-1 CD4 المصابة<sup&gt; +</sup&gt; T الخلايا عن طريق الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; المشارك ثقافة النظام.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

تقييم بتكوين لHIV-1 مغلف مثلوثي بروتينات سكرية باستخدام خلية القاعدة ELISA الفحص

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

عزل Exosomes من البلازما من HIV-1 الأفراد ايجابية

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

تصور HIV-1 الكمامة ملزم لالعملاق Unilamellar الحويصلة (GUV) الأغشية

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

قياس ل<em&gt; في المختبر</em&gt; التكامل آخر من HIV-1 Preintegration مجمعات

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...