Name: single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00
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我们感谢与陈本雅明博士的科学讨论。这项工作由 K08AI120806 （THS）、R01DA052255 （THS 和 KB） 和 R21AI152833 （THS 和 KB） 资助。

1. 为成像准备细胞
<ol><li>准备新鲜的 Fluo-4 AM 加载解决方案：加入 25 μL 的 100 倍浓缩洗涤剂溶剂，然后将 2.5 μL 的 Fluo-4 AM 1000x 添加到 1.5 mL 管中。漩涡混合。</li>
	<li>派珀特 2.5 mL 的文化介质进入加载解决方案并倒置混合。防止光线照射。</li>
	<li>离心机 2 x 106 MT-4 电池在 500 x g 3 分钟。</li>
	<li>取出介质，并在准备好的 Fluo-4 AM 加载解决方案的 2 mL 中重新喷射颗粒。防止光线照射。...

<ol>
	<li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+inflammation,+and+HIV+infection.">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li><li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection.">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li><li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors:+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation.">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).</li><li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions.">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li><li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages.">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors.">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+(IL-10)+and+IL-1&#946;+in+a+human+tonsil+explant+model.">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1&#946; in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).</li><li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures.">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases.">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li><li>Chen, P., H&#252;bner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses.">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li><li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca(2+)-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomi&#263;, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels.">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li><li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs.">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).</li><li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity.">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010 (2018).</li><li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform.">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).</li><li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+cell+identification+and+sorting+(LACIS)+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device.">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41 (2018).</li><li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light.">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li><li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator.">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion.">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion.">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).</li></ol>

研究单细胞中钙流入与HIV-1生产性感染之间关系的描述方法可以应用于研究细胞内钙动力学，以应对其他感兴趣的拮抗剂或拮抗剂。成像细胞的制备简单、时间最短，并且试剂可从广泛使用的制造商的方便套件中获得。氟-4基钙测量在文献中得到了很好的描述，在这个平台上研究HIV-1很容易被其他病毒或感兴趣的化合物所取代。可以使用不同的细胞类型和文化介质。支持替代或附加荧光通道，并可?...

慢性炎症是导致HIV相关早期发病率和死亡率的主要原因1，2，3。HIV可以激活炎症信号的多种机制，最近的证据表明P2X受体在HIV进入中的作用，即钙凝胶腺苷三磷酸盐（ATP）受体3、4、5、6、7、8、9、10。纯能受体的P2X亚型（P2XR）可能是这种炎症的重要促进剂。然而，艾滋病毒-P2XR相互作用的分子机制在很大程度上是未知的，并可能影响早期和后期艾滋病毒-1病毒的生命周期步骤。确定驱动艾滋病毒相关慢性炎症的途径和动力学对于推进艾滋病毒感染者的治疗方案至关重要。
为了评估HIV-1是否直接使P2X受体感到痛苦，必须同时测量P2XR活化和HIV-1感染。P2XR活性和HIV-1感染的检测已经独立确定：细胞钙的流入是P2XR活化的指标，HIV-1生产性感染可以通过RNA丰度进行量化。氟化物检测钙的流入是可能的与氟-4钙敏感染料，和HIV-1感染可以与MCherry荧光记者病毒HIV-NLCI 11，12，13，14，15可视化。
由于P2X活化（急性细胞钙流入）和HIV-1感染（HIV-1 RNA合成）的这些指标发生在不同的时间尺度（分钟与天数），因此缺乏一种高通量方法，可以对P2XR活化和HIV-1感染进行配对分析。标准的高通量实验技术，如流动细胞测量，允许对种群进行分析，但无法评估单个细胞中急性和纵向事件之间的关系。或者，具有标准荧光显微镜的单细胞成像是低通量的。这些实验限制要求采用新型的高通量技术直接测量急性和纵向细胞事件之间的关联。
描述的光伏系统是一个新型的平台，能够单细胞分拣和隔离，培养，成像和软件自动化16，17，18，19。该系统是传统成像方法的局限性之外，具有集成的高通量替代方法。信标平台由二氧化碳（CO2）和温度控制的孵化器组成，支持芯片上所含的细胞。该芯片具有感光晶体管，可产生电梯度以响应目标光。由此产生的介电力用于将单个细胞穿过纳米流体芯片移动到所需的区域。细胞被分拣成芯片上的笔，这为物理上分离单个细胞提供了障碍。整个芯片中生长介质的连续层压流可防止从笔中移动细胞，同时允许小颗粒传播营养物质和实验特异性试剂。荧光显微镜位于芯片上方。软件自动化用于在用户指定的时间点捕获芯片的图像。
所有细胞特征都是使用光伏系统进行单细胞选择和操作的。该系统由集成机械、微流体和光学元件组成，可实现单细胞操作、检测、培养和成像。细胞在一次性纳米流体装置上加载和培养，由 3，500 个单独的腔室（笔）组成，每个腔室都能够容纳亚纳米音量。细胞可以使用光诱导的介电"笼子"定位在笔内，并在温度和二氧化碳控制条件下培养。微流体允许在芯片上灌注介质或缓冲液用于细胞培养或药物治疗。一个激活的针头允许从孵化和关闭的井板细胞的进出口。芯片区域可在明亮场和荧光通道（包括 DAPI、FITC、TRed 或 Cy5）中以 4 倍或 10 倍的放大倍数进行成像，以描述蜂窝表型或功能分析。整个系统使用可用于预先设计的工作流或自定义实验的软件实现自动化。
已研究艾滋病毒-1感染与P2XR之间的关系，但尚未报告直接描述这些相互作用的高通量程序。在这里，作者描述了一种通过跟踪急性钙流入和随后的HIV-1单细胞水平生产性感染来研究HIV-P2XR相互作用的方法。值得注意的是，这建立了一个新颖的工具，允许直接，高通量，纵向测量多个目标在单个细胞。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Beacon Optofluidic System</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FIJI</td>
			<td colspan="2">Open-source software</td>
			<td>PMID: 22743772, 22930834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluo-4 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;F10489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;HIV-1 NLCINL4-3</td>
			<td colspan="2">Laboratory of Benjamin Chen</td>
			<td>PMID: 28148796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td colspan="2">GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>&#160;SV30010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MT-4 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent</td>
			<td></td>
			<td>&#160;ARP-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OptoSelect 3500 chip</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Prism 9.0.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform

艾滋病毒-1导致慢性感染，影响全世界3 700多万人。尽管进行了抗逆转录病毒治疗，但患有人类免疫缺陷病毒（HIV）的人会经历与慢性炎症有关的合并。然而，这些炎症信号并没有完全定性。早期进入事件对细胞信号事件和下游基因表达的激活作用尚未在单细胞水平上被捕捉到。在这里，作者描述了一种将活细胞荧光显微镜原理应用于自动化单细胞平台的方法，该平台通过用户定制的时间过程培养和成像细胞，从而能够对动态细胞过程进行高通量分析。这种检测可以跟踪HIV-1感染后立即发生的早期事件的单细胞活荧光显微镜，特别是接触病毒后钙的流入以及使用荧光记者病毒发展出的生产性感染。MT-4细胞装有钙敏感染料，在纳米流体装置上用分离的笔培养。培养的细胞感染了HIV-1报告病毒（HIV-1 NLCI）。放置在纳米流体装置上方的荧光显微镜测量急性HIV-1暴露后8分钟时间内的钙流入量。HIV-1生产性感染在4天间隔内在这些细胞中测量。分析这些时间课程的成像数据，以定义病毒-宿主受体相互作用和信号通路动力学。作者使用一种能够单细胞分拣、培养、成像和软件自动化的新型光伏平台，提出了一种集成的可扩展传统成像方法的替代方案。此检测可以测量各种条件下事件的动力学，包括细胞类型、激动剂或拮抗作用，同时测量一系列参数。这是第一个建立的纳米流体高通量纵向单细胞培养和成像方法：该技术可广泛应用于细胞信号动力学和动态分子相互作用的研究。

图1说明了通过荧光显微镜获得的芯片格式和原始成像数据。通过mCherry测量对未受感染和受感染细胞的识别和聚集显示在 图2中。这些聚类被分析为 图3中的钙流入动力学，这表明早期钙在HIV感染细胞中的流入。 图4 显示钙流入和mCherry荧光 20之间有显著的正相关关系。
<p class="jove_content" f...

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Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

在这里，我们提出了一个协议，其中单个细胞被监测急性事件和生产性HIV-1感染的纳米流体设备。成像数据定义病毒-宿主受体相互作用和信号通路动力学。这是研究信号动力学和分子相互作用的纳米流体高通量纵向单细胞培养和成像的第一种方法。

使用多参数光伏平台对钙流入和HIV-1感染进行单细胞特征描述

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

此协议可以在单细胞级别上捕获实时动力学。我们可以测量针对艾滋病毒感染的单个细胞参数，并将早期信号事件与病毒生命周期的延迟步骤联系起来。这是使用新型光伏平台进行单细胞分拣、培养、成像和软件自动化的传统成像方法的集成可扩展替代方案。这是第一个建立的纳米流体、高通量、纵向单细胞培养和成像方法。该技术可广泛采用，研究各种疾病状态下的细胞信号动力学和动态分子相互作用。这种方法的视觉演示对于传达实验是如何建立的、细胞如何被光学分类成笔以及如何通过芯片进行输液非常重要。首先，通过将 25 微升 100 倍浓缩洗涤剂溶剂和 2.5 微升 1000X Fluo-4 AM 添加到 1.5 毫升管中，然后将漩涡混合，从而准备新鲜的 Fluo-4 AM 装载解决方案。派珀特 2.5 毫升培养介质进入加载解决方案并倒置混合。在 500 倍 G 下，以 200 万 MT-4 细胞进行离心，然后取出介质，在准备好的 Fluo-4 AM 加载解决方案的两毫升中重新注入颗粒。派佩特将细胞重新悬浮到35毫米的培养皿中。在37摄氏度下孵育15至30分钟，然后在室温下再孵育15至30分钟。将细胞悬架转移到离心管中，以 500 倍 G 将细胞离心，三分钟，然后去除超母细胞。通过在培养介质的一毫升中管和离心机在 500 倍 G 中重新注入细胞颗粒，洗涤三分钟。通过在培养介质中以每毫升200万个细胞的浓度对至少50微升的细胞进行管道输送来补充细胞颗粒。要用润湿溶液准备芯片，从而促进细胞笔下，请用新的光伏芯片将含有两毫升润湿溶液和 50 毫升除离子水的离心机管加载到仪器上，并运行湿芯片功能，使芯片充满润湿溶液。在 50 摄氏度下孵化芯片，用水冲洗芯片三次。冲水完成后，用三个周期的 250 微升培养介质冲洗芯片。在加载前，每 100 个部件 F127 洗涤剂溶解剂中就有一个补充前一步的细胞悬架，以减少细胞粘附在芯片通道上的可能性。使用仪器导出针从 1.5 毫升离心机管导入细胞，具有负载操作和小批量导入，用于 5 微升电池包体积。使用优化的光电子定位或 OEP 电压为 4.3 伏特和每秒 5 微米的钢笔单元，使用自动笔功能自动检测单个电池，用 OEP 笼环绕它们，并将它们移动到附近的笔中。如果感兴趣的单元格仍然遵循自动笔，请使用手动笔功能选择目标单元格和目标笔。笔下完成后，用三个周期的 250 微升培养介质冲洗芯片，以清除芯片中剩余的未修复细胞。在写入细胞后，获取 FITC、德克萨斯红和 DAPI 通道中细胞的荧光图像，以测量基线 Fluo-4、mCherry 和自流。通过出口针将悬架慢慢输送到芯片中，将 HIV-1 注入微芯片中，浓度为每 200 万个细胞 13 毫微克的 HIV-1 NLCI。在加入艾滋病毒-1后，在10分钟的时间内在FITC和DAPI频道反复获取图像。在感染后一天、二天、三天和四天内在德州红色和 DAPI 频道获取图像。这种方法用于通过mCherry测量识别和聚集艾滋病毒感染者和未受感染的细胞。MCherry信号变化大于或低于4万的细胞平均荧光强度分别聚集在MCherry高或mCherry低种群中。通过在9分钟的时间内反复测量细胞内钙，对钙流入动力学进行分析，证明早期钙在HIV感染细胞中的流入。观察到钙的流入和mCherry花期之间的显著正相关关系。在尝试此过程时，请记住，从病毒生成和感染的指数增长范围内的细胞开始非常重要，因为过度生长的细胞将导致此检测信号的急剧下降。与艾滋病毒-1合作可能是危险的。因此，在执行此程序时应始终采取 OSHA 血液传播病原体标准中所述的 BSL-2 做法。这项技术是令人兴奋的，因为它将允许我们研究单细胞表型或转录变化在受控条件下。这对于将刺激对许多细胞类型分子通路的影响联系起来具有广泛的潜力。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

HIV - 1使用转速依赖的慢病毒表达载体的绿色荧光蛋白阳性细胞的特定标记

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

科研

免疫与感染

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3的HIV - 1取向的基因型推理使用人口为基础的测序

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

使用基因型的方法预测HIV-1辅助用途（归经）的序列分析

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

在体外对HIV - 1核心脱壳

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

单细胞分析枯草芽孢杆菌生物膜，用荧光显微镜和流式细胞仪

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

评估的HIV-1感染的CD4的先天传感<sup&gt; +</sup&gt;性T细胞浆细胞样树突细胞使用<em&gt;体外</em&gt;共培养体系。

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1的三聚体包膜糖蛋白的构象评估使用基于细胞的ELISA检测

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

从HIV-1阳性者的血浆分离外来体的

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

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HIV-1 Gag的可视化绑定到巨人的单片囊泡（GUV）膜

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

测量<em&gt;体外</em&gt; HIV-1 Preintegration配合物的整合活动

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...