Name: single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Vi er taknemmelige for de videnskabelige drøftelser med Dr. Benjamin Chen. Dette arbejde blev finansieret af K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS og KB) og R21AI152833 (THS og KB).

1. Forberedelse af celler til billeddannelse
<ol><li>Forbered frisk Fluo-4 AM-læsseopløsning: Der tilsættes 25 μL 100x koncentreret opløsningsmiddel til vaskemiddel, og tilsæt derefter 2,5 μL Fluo-4 AM 1000x til et 1,5 ml rør. Vortex at blande.</li>
	<li>Pipette 2,5 ml kulturmedier ind i læsseopløsningen og inverter for at blande. Beskyt mod lys.</li>
	<li>Centrifuge 2 x 106 MT-4 celler ved 500 x g i 3 min.</li>
	<li>Fjern medier og genbrug pellet i 2 ml af den forberedte Fluo-4 AM lasteop...

<ol>
	<li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+inflammation,+and+HIV+infection.">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li><li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection.">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li><li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors:+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation.">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).</li><li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions.">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li><li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages.">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors.">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+(IL-10)+and+IL-1&#946;+in+a+human+tonsil+explant+model.">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1&#946; in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).</li><li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures.">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases.">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li><li>Chen, P., H&#252;bner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses.">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li><li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca(2+)-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomi&#263;, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels.">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li><li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs.">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).</li><li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity.">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010 (2018).</li><li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform.">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).</li><li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+cell+identification+and+sorting+(LACIS)+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device.">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41 (2018).</li><li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light.">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li><li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator.">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion.">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion.">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).</li></ol>

Den beskrevne metode til at undersøge forholdet mellem calcium tilstrømning og HIV-1 produktiv infektion i enkeltceller kan tilpasses til at studere intracellulære calcium kinetik som reaktion på andre agonister eller antagonister af interesse. Forberedelsen af celler til billeddannelse er enkel, minimalt tidskrævende, og reagenser fås i praktiske kits fra udbredte producenter. Fluo-4-baseret calciummåling er godt beskrevet i litteraturen, og HIV-1 kan let erstatte andre vira eller forbindelser af interesse for at...

Kronisk inflammation er en førende årsag til HIV-associerede tidlige sygelighed ogdødelighed 1,2,3. Der er flere mekanismer, hvor hiv kan aktivere inflammatorisk signalering, og de seneste beviser tyder på en rolle for P2X receptorer i HIV indrejse, som er calcium-gating adenosin triphosphat (ATP) receptorer3,4,5,6,7,8,9,10. P2X-undertypen af purinergiske receptorer (P2XR) kan være vigtige facilitatorer af denne betændelse. Men de molekylære mekanismer i HIV-P2XR interaktioner er stort set ukendt og kan påvirke tidligt og sent HIV-1 viral livscyklus trin. Definition af veje og kinetik kørsel HIV-associeret kronisk inflammation er afgørende for at fremme behandlingsmuligheder for mennesker med HIV.
For at vurdere, om HIV-1 direkte agonizes P2X receptorer, P2XR aktivering og HIV-1 infektion skal måles parallelt. Assays af P2XR aktivitet og HIV-1 infektion er blevet uafhængigt etableret: Cellular calcium tilstrømning er en indikator for P2XR aktivering, og HIV-1 produktiv infektion kan kvantificeres ved RNA overflod. Fluorescens påvisning af calcium tilstrømning er muligt med Fluo-4 calcium-følsomme farvestof, og HIV-1 infektion kan visualiseres med mCherry fluorescerende reporter virus HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Da disse indikatorer for P2X-aktivering (akut cellulær calciumtilstrømning) og HIV-1-infektion (HIV-1 RNA-syntese) forekommer på forskellige tidshorisonter (minutter versus dage), mangler der en høj overførselsmetode, der giver mulighed for parret analyse af P2XR-aktivering og HIV-1-infektion. Eksperimentelle teknikker med høj gennemløb, såsom flowcytometri, giver mulighed for befolkningsanalysen, men kan ikke vurdere forholdet mellem akutte og langsgående hændelser i enkelte celler. Alternativt er enkeltcellebilleddannelse med standard fluorescensmikroskopi lav gennemløb. Disse eksperimentelle begrænsninger udgør et behov for nye, høj-throughput teknikker til at måle sammenhænge mellem akutte og langsgående cellulære begivenheder direkte.
Et optofluidisk system, der beskrives, er en ny platform, der er i stand til enkeltcellesortering og isolation, dyrkning, billedbehandling og softwareautomatisering16,17,18,19. Dette system præsenterer et integreret, højgennemstrømningsalternativ til begrænsningerne i traditionelle billeddannelsesmetoder. Beacon-platformen består af en kuldioxid (CO2)og temperaturstyret inkubator, der understøtter celler indeholdt på en chip. Chippen har lysfølsomme transistorer, der genererer en elektrisk gradient som reaktion på målrettet lys. Denne resulterende dilektrophoretiske kraft bruges til at flytte individuelle celler over den nanofluidiske chip til de ønskede regioner. Celler sorteres i kuglepenne på chippen, hvilket giver en barriere for at isolere individuelle celler fysisk. Kontinuerlig laminar strøm af vækstmedier i hele chippen forhindrer celle migration fra penne og samtidig give mulighed for små-partikel diffusion af næringsstoffer og eksperiment-specifikke reagenser. Et fluorescensmikroskop sidder over chippen. Softwareautomatisering bruges til at tage billeder af chippen på det brugerdefinerede tidspunkt.
Al cellekarakterisering blev udført ved hjælp af et optofluidisk system til markering og manipulation af en enkelt celle. Dette system består af integrerede mekaniske, mikrofluidiske og optiske komponenter, der muliggør enkeltcellemanipulation, analyse, kultur og billeddannelse. Cellerne lastes og dyrkes på den engangs nanofluidiske enhed bestående af 3.500 individuelle kamre (kuglepenne), der hver især er i stand til at holde sub-nanolitervolumen. Celler kan placeres i kuglepenne ved hjælp af lysinducerede dielektrotrophoretiske "bure" og dyrkes under temperatur- og CO2-kontrolleredeforhold. Mikrofluidics tillader perfusion af medier eller buffere på chippen til cellekultur eller lægemiddelbehandling. En aktiveret nål giver mulighed for import og eksport af celler fra inkuberede og lukkede brøndplader. Chipområdet kan afbildes ved 4x eller 10x forstørrelse i brightfield- og fluorescerende kanaler (herunder DAPI, FITC, TRed eller Cy5) for at karakterisere cellulære fænotyper eller funktionel analyse. Hele systemet automatiseres ved hjælp af software, der kan bruges til foruddefinerede arbejdsgange eller brugerdefinerede eksperimenter.
Forholdet mellem HIV-1-infektion og P2XR er blevet undersøgt, men der er ikke rapporteret om en højoverførselsprocedure, der direkte karakteriserer disse interaktioner parallelt. Her beskriver forfatterne en metode til at studere HIV-P2XR-interaktioner gennem sporing af akut calciumtilstrømning og efterfølgende HIV-1-produktiv infektion på enkeltcelleniveau. Dette etablerer især et nyt værktøj, der giver mulighed for direkte, høj gennemstrømning, langsgående måling af flere mål i enkelte celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Beacon Optofluidic System</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FIJI</td>
			<td colspan="2">Open-source software</td>
			<td>PMID: 22743772, 22930834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluo-4 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;F10489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;HIV-1 NLCINL4-3</td>
			<td colspan="2">Laboratory of Benjamin Chen</td>
			<td>PMID: 28148796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td colspan="2">GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>&#160;SV30010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MT-4 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent</td>
			<td></td>
			<td>&#160;ARP-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OptoSelect 3500 chip</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Prism 9.0.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform

HIV-1 forårsager en kronisk infektion, der påvirker mere end 37 millioner mennesker verden over. Mennesker, der lever med human immundefekt virus (HIV) oplever comorbiditet relateret til kronisk inflammation på trods af antiretroviral behandling. Disse inflammatoriske signalering er dog ikke fuldt karakteriseret. Den tidlige indgangsrolle ved aktivering af cellulære signalhændelser og downstream-genekspression er ikke blevet fanget på enkeltcelleniveau. Her beskriver forfatterne en metode, der anvender principper for live-celle fluorescensmikroskopi til en automatiseret enkeltcelleplatform, der kulturer og billeder celler over brugertilpassede tidskurser, hvilket giver mulighed for analyse af dynamiske cellulære processer med høj gennemløb. Denne analyse kan spore encellet levende fluorescensmikroskopi af tidlige hændelser, der umiddelbart følger hiv-1-infektion, især tilstrømningen af calcium, der ledsager eksponering for virussen og udvikling af produktiv infektion ved hjælp af en fluorescerende reportervirus. MT-4 celler er fyldt med et calciumfølsomt farvestof og dyrket i isolerede penne på en nanofluidisk enhed. De dyrkede celler er inficeret med en HIV-1 reporter virus (HIV-1 NLCI). Et fluorescensmikroskop placeret over den nanofluidiske enhed måler calciumtilstrømningen over et 8-minutters tidsforløb efter akut HIV-1-eksponering. HIV-1 produktiv infektion måles i de samme celler over en 4-dages interval. Billeddata fra disse tidskurser analyseres for at definere virus-host receptor interaktioner og signaleringsvej dynamik. Forfatterne præsenterer et integreret, skalerbart alternativ til traditionelle billeddannelsesmetoder ved hjælp af en ny optofluidic platform, der er i stand til enkeltcellesortering, dyrkning, billeddannelse og softwareautomatisering. Denne analyse kan måle kinetik af begivenheder under forskellige forhold, herunder celletype, agonist eller antagonistisk effekt, mens du måler en række parametre. Dette er den første etablerede metode til nanofluidic high-throughput langsgående enkeltcellekultur og billeddannelse: Denne teknik kan tilpasses bredt til at studere cellulære signalering kinetik og dynamiske molekylære interaktioner.

Figur 1 illustrerer formatet af de chip- og råbilleddata, der er opnået gennem fluorescensmikroskopet. Identifikation og klyngedannelse af uinficerede og inficerede celler via mCherry-måling er vist i figur 2. Disse klynger analyseres for calciumtilstrømning kinetik i figur 3, som viser tidlig calciumtilstrømning i HIV-inficerede celler. Figur 4 viser en signifikant positiv sammenhæng mellem calci...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

Her præsenterer vi en protokol, hvor enkelte celler overvåges for akutte hændelser og produktiv HIV-1-infektion på en nanofluidisk enhed. Billeddata definerer virusværtsreceptorinteraktioner og signalvejsdynamik. Dette er den første metode til nanofluidic high-throughput langsgående enkeltcellekultur og billeddannelse til at studere signalering af kinetik og molekylære interaktioner.

Enkeltcellekarakterisering af calciumtilstrømning og HIV-1-infektion ved hjælp af en multiparameter optofluidisk platform

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

Denne protokol kan fange kinetik i realtid på et enkeltcelleniveau. Vi kan måle individuelle celleparametre som reaktion på HIV-infektion og forbinde tidlige signalhændelser med forsinkede trin i den virale livscyklus. Dette er et integreret skalerbart alternativ til traditionelle billeddannelsesmetoder ved hjælp af en ny optofluidic platform til enkeltcellesortering, kulturing, billedbehandling og softwareautomatisering.Dette er den første etablerede metode til nanofluidic, high-throughput, langsgående enkeltcellet kultur og billeddannelse. Denne teknik kan bredt vedtages for at studere cellulære signalering kinetik og dynamisk molekylær interaktion i en række forskellige sygdomstilstande. Visuel demonstration af denne metode er vigtig for at formidle, hvordan eksperimentet er sat op, hvordan celler er optisk sorteret i kuglepenne, og hvordan man opsætter infusioner gennem chippen.Til at begynde med skal du forberede frisk Fluo-4 AM-lasteopløsning ved at tilføje 25 mikroliter 100X koncentreret opløsningsmiddel til vaskemiddel og 2,5 mikroliter på 1.000X Fluo-4 AM til et 1,5 milliliter rør og derefter vortex at blande. Pipette 2,5 milliliter kulturmedier ind i læsseopløsningen og inverteres for at blande. Centrifuge to millioner MT-4 celler ved 500 gange G i tre minutter, fjern derefter medier og genbrug pellet i to milliliter af den forberedte Fluo-4 AM lasteopløsning.Pipette re-suspenderet celler i en 35 millimeter Petri parabol. Inkuber ved 37 grader Celsius i 15 til 30 minutter, og inkubiter derefter i yderligere 15 til 30 minutter ved stuetemperatur. Overfør celleaffjedringen til et centrifugerør, og centrifuge cellerne ved 500 gange G i tre minutter, og fjern derefter supernatanten.Resuspend cell pellet ved pipetter i en milliliter af kulturmediet og centrifuge ved 500 gange G i tre minutter til vask. Resuspend cellepillen ved pipettering i dyrkningsmediet ved en koncentration på to millioner celler pr. milliliter for mindst 50 mikroliter. At forberede en chip med befugtningsopløsningen, som letter cellespærring, belastningscentrifugerør, der indeholder to milliliter befugtningsopløsning og 50 milliliter deioniseret vand på instrumentet med en ny optofluidic chip og kør den våde chipfunktion, som vil oversvømme chippen med befugtningsopløsningen.Inkubat chippen ved 50 grader Celsius og skyl chippen med vand tre gange. Når vandskylningen er færdig, skylles chippen med tre cyklusser på 250 mikroliter af kulturmedier. Supplere celle suspension fra det foregående trin med en pr 100 dele F127 vaskemiddel opløst før lastning for at reducere sandsynligheden for celler klæber til chip-kanaler.Brug instrumenteksportnålen til at importere celler fra et 1,5 milliliter centrifugerør med belastningsoperationen og lille volumenimport for et fem mikrolitercellepakkevolumen. Pen celler ved hjælp af en optimeret optoelektronisk positionering eller OEP spænding på 4,3 volt og fem mikrometer per sekund bur hastighed ved hjælp af auto-pen funktion, som automatisk vil opdage enkelte celler, omgiver dem med en OEP bur, og flytte dem ind i en nærliggende pen. Hvis der stadig er celler af interesse efter automatisk penning, skal du bruge den manuelle pennefunktion til at markere målceller og en destinationspen.Når penning er færdig, skylles chippen med tre cyklusser af 250 mikroliter af kultur medier for at rydde eventuelle resterende ubrugte celler fra chippen. Når du har skrevet celler, skal du hente fluorescerende billeder af celler i FITC-, Texas Red- og DAPI-kanaler for at måle den oprindelige Fluo-4, mCherry og autofluorescens. Indgyde HIV-1 i mikrochippen i en koncentration på 13 nanogram hiv-1 NLCI pr to millioner celler ved langsomt pipetter suspensionen i chippen gennem eksport nålen.Umiddelbart efter HIV-1 desuden gentagne gange få billeder i FITC og DAPI kanaler over en 10-minutters tidsforløb. Få billeder i Texas Red- og DAPI-kanalerne på en, to, tre og fire dage efter infektionen. Denne metode blev anvendt til identifikation og klyngedannelse af hiv-inficerede og uinficerede celler via mCherry-måling.Celler med en ændring i mCherry signal større eller lavere end 40.000 gennemsnitlige fluorescerende intensitet blev grupperet i mCherry høj eller mCherry lav befolkning hhv. Disse klynger blev analyseret for calcium tilstrømning kinetik ved at måle intracellulære calcium ved hjælp af Fluo-4 fluorescens gentagne gange over en ni-minutters tid kursus, som viste tidlig calcium tilstrømning i HIV-inficerede celler. Der blev observeret en signifikant positiv korrelation mellem calciumtilstrømning og mCherry florescence.Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at starte med cellerne inden for eksponentiel vækstområde for både virusproduktion og infektion, fordi tilgroede celler vil resultere i et dramatisk fald i signalet fra denne analyse. Det kan være farligt at arbejde med HIV-1. Derfor bør BSL-2-praksis som angivet i OSHA Bloodborne Pathogen Standard altid tages, mens denne procedure udføres.Denne teknik er spændende, fordi det vil give os mulighed for at studere enkeltcellede fænotypiske eller transskriptionelle ændringer under kontrollerede forhold. Dette har et bredt potentiale for at korrelere virkningen af stimuli på molekylære veje i mange celletyper.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating af HIV-1 kerner

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Encellede Analyse af Bacillus subtilis Biofilm Brug fluorescensmikroskopi og Flowcytometri

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdering af Innate Sensing af HIV-1 inficerede CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved plasmacytoide dendritiske celler ved hjælp af en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-dyrkningssystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Konformationel Evaluering af HIV-1 trimere kappeglycoproteinerne hjælp af en celle-ELISA-assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolering af Exosomer fra plasma af HIV-1 Positive Personer

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualisering af HIV-1 Gag binding til Giant unilamellare vesikel (GUV) Membraner

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

måling af<em&gt; In vitro</em&gt; Integration aktivitet af HIV-1 Preintegration komplekser

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...