Name: single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

We zijn dankbaar voor de wetenschappelijke gesprekken met Dr. Benjamin Chen. Dit werk werd gefinancierd door K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS en KB) en R21AI152833 (THS en KB).

1. Voorbereiding van cellen voor beeldvorming
<ol><li>Bereid verse Fluo-4 AM-laadoplossing: Voeg 25 μL 100x geconcentreerd reinigingsmiddel toe en voeg vervolgens 2,5 μL Fluo-4 AM 1000x toe aan een buis van 1,5 ml. Vortex om te mengen.</li>
	<li>Pipet 2,5 ml kweekmedia in de laadoplossing en keer om om te mengen. Beschermen tegen licht.</li>
	<li>Centrifugeer 2 x 106 MT-4 cellen bij 500 x g gedurende 3 min.</li>
	<li>Verwijder media en resuspend de pellet in 2 ml van de voorbereide Fluo-4 AM laado...

<ol>
	<li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+inflammation,+and+HIV+infection.">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li><li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection.">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li><li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors:+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation.">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).</li><li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions.">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li><li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages.">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors.">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+(IL-10)+and+IL-1&#946;+in+a+human+tonsil+explant+model.">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1&#946; in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).</li><li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures.">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases.">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li><li>Chen, P., H&#252;bner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses.">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li><li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca(2+)-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomi&#263;, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels.">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li><li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs.">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).</li><li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity.">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010 (2018).</li><li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform.">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).</li><li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+cell+identification+and+sorting+(LACIS)+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device.">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41 (2018).</li><li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light.">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li><li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator.">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion.">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion.">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).</li></ol>

De beschreven methodologie om de relatie tussen calciuminstroom en HIV-1 productieve infectie in enkele cellen te bestuderen, kan worden aangepast om intracellulaire calciumkinetiek te bestuderen als reactie op andere agonisten of antagonisten van belang. De voorbereiding van cellen voor beeldvorming is eenvoudig, minimaal tijdsintensief en reagentia zijn verkrijgbaar in handige kits van veelgebruikte fabrikanten. Fluo-4-gebaseerde calciummeting is goed beschreven in de literatuur en HIV-1 kan gemakkelijk worden vervange...

Chronische ontsteking is een belangrijke oorzaak van hiv-geassocieerde vroege morbiditeiten enmortaliteit 1,2,3. Er zijn meerdere mechanismen waarbij HIV inflammatoire signalering kan activeren, en recent bewijs suggereert een rol voor de P2X-receptoren in hiv-binnenkomst die calcium-gating adenosinetrifosfaat (ATP) receptoren3,4,5,6,7,8,9,10zijn . Het P2X-subtype van purinergische receptoren (P2XR) kan belangrijke facilitators van deze ontsteking zijn. De moleculaire mechanismen van HIV-P2XR interacties zijn echter grotendeels onbekend en kunnen van invloed zijn op vroege en late HIV-1 virale levenscyclusstappen. Het definiëren van de trajecten en kinetiek die hiv-geassocieerde chronische ontstekingen veroorzaken, is van cruciaal belang voor het bevorderen van behandelingsopties voor mensen met hiv.
Om te beoordelen of HIV-1 P2X-receptoren direct pijnigt, moeten P2XR-activering en HIV-1-infectie parallel worden gemeten. Assays van P2XR-activiteit en HIV-1-infectie zijn onafhankelijk vastgesteld: Cellulaire calciuminstroom is een indicator voor P2XR-activering en HIV-1 productieve infectie kan worden gekwantificeerd door RNA-overvloed. Fluorescentiedetectie van calciuminstroom is mogelijk met de Fluo-4 calciumgevoelige kleurstof, en HIV-1-infectie kan worden gevisualiseerd met het mCherry fluorescent reporter virus HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Omdat deze indicatoren van P2X-activering (acute cellulaire calciuminstroom) en HIV-1-infectie (HIV-1 RNA-synthese) op verschillende tijdschalen (minuten versus dagen) voorkomen, ontbreekt er een methode met hoge doorvoer die een gepaarde analyse van P2XR-activering en HIV-1-infectie mogelijk maakt. Standaard experimentele technieken met hoge doorvoer, zoals flowcytometrie, maken de populatieanalyse mogelijk, maar kunnen de relatie tussen acute en longitudinale gebeurtenissen in afzonderlijke cellen niet beoordelen. Als alternatief is eencellige beeldvorming met standaard fluorescentiemicroscopie een lage doorvoer. Deze experimentele beperkingen bieden de behoefte aan nieuwe technieken met hoge doorvoer om associaties tussen acute en longitudinale cellulaire gebeurtenissen rechtstreeks te meten.
Een beschreven optofluidic-systeem is een nieuw platform dat in staat is tot eencellige sortering en isolatie, cultivering, beeldvorming en softwareautomatisering16,17,18,19. Dit systeem biedt een geïntegreerd alternatief met hoge doorvoer voor de beperkingen van traditionele beeldvormingsmethoden. Het Beacon-platform bestaat uit een koolstofdioxide (CO2)en temperatuurgecontroleerde incubator die cellen op een chip ondersteunt. De chip beschikt over lichtgevoelige transistors die een elektrische gradiënt genereren als reactie op gericht licht. Deze resulterende dielectroforetische kracht wordt gebruikt om individuele cellen over de nanofluïdische chip naar de gewenste gebieden te verplaatsen. Cellen worden gesorteerd in pennen op de chip, die een barrière vormen om individuele cellen fysiek te isoleren. Continue laminaire stroom van groeimedia door de chip voorkomt celmigratie uit de pennen en zorgt tegelijkertijd voor de verspreiding van kleine deeltjes van voedingsstoffen en experimentspecifieke reagentia. Een fluorescentiemicroscoop zit boven de chip. Softwareautomatisering wordt gebruikt om afbeeldingen van de chip vast te leggen op het door de gebruiker opgegeven tijdstip.
Alle celkarakterisering werd uitgevoerd met behulp van een optofluidic systeem voor eencellige selectie en manipulatie. Dit systeem bestaat uit geïntegreerde mechanische, microfluïdische en optische componenten die manipulatie, assay, cultuur en beeldvorming met één cel mogelijk maken. Cellen worden geladen en gekweekt op het wegwerp nanofluïdische apparaat bestaande uit 3.500 individuele kamers (pennen), elk in staat om subnanolitervolume vast te houden. Cellen kunnen in hokken worden geplaatst met behulp van lichtgeïnduceerde dielectroforetische "kooien" en gekweekt onder temperatuur- en CO2-gecontroleerdeomstandigheden. De microfluïdica maken perfusie van media of buffers op de chip mogelijk voor celkweek of medicamenteuze behandeling. Een bediende naald maakt de import en export van cellen uit geïncubeerde en geblindeerde putplaten mogelijk. Het chipgebied kan worden afgebeeld op 4x of 10x vergroting in brightfield- en fluorescerende kanalen (inclusief DAPI, FITC, TRed of Cy5) om cellulaire fenotypen of functionele analyse te karakteriseren. Het hele systeem is geautomatiseerd met behulp van software die kan worden gebruikt voor vooraf ontworpen workflows of aangepaste experimenten.
Relaties tussen HIV-1-infectie en P2XR zijn bestudeerd, maar een procedure met hoge doorvoer om deze interacties direct parallel te karakteriseren, is niet gemeld. Hier beschrijven de auteurs een methodologie om HIV-P2XR-interacties te bestuderen door acute calciuminstroom en daaropvolgende HIV-1 productieve infectie op ééncellig niveau te volgen. Dit creëert met name een nieuw hulpmiddel dat directe, hoge doorvoer, longitudinale meting van meerdere doelen in afzonderlijke cellen mogelijk maakt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Beacon Optofluidic System</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FIJI</td>
			<td colspan="2">Open-source software</td>
			<td>PMID: 22743772, 22930834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluo-4 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;F10489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;HIV-1 NLCINL4-3</td>
			<td colspan="2">Laboratory of Benjamin Chen</td>
			<td>PMID: 28148796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td colspan="2">GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>&#160;SV30010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MT-4 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent</td>
			<td></td>
			<td>&#160;ARP-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OptoSelect 3500 chip</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Prism 9.0.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform

HIV-1 veroorzaakt een chronische infectie die wereldwijd meer dan 37 miljoen mensen treft. Mensen met humaan immunodeficiëntievirus (HIV) ervaren comorbiditeit gerelateerd aan chronische ontsteking ondanks antiretrovirale therapie. Deze ontstekingssignalering is echter niet volledig gekarakteriseerd. De rol van vroege ingangsgebeurtenissen bij de activering van cellulaire signaleringsgebeurtenissen en downstream genexpressie is niet vastgelegd op het niveau van één cel. Hier beschrijven de auteurs een methode die principes van live-cell fluorescentiemicroscopie toepast op een geautomatiseerd eencellig platform dat cellen kweekt en afbeelden gedurende door de gebruiker aangepaste tijdcursussen, waardoor een analyse met hoge doorvoer van dynamische cellulaire processen mogelijk is. Deze test kan eencellige levende fluorescentiemicroscopie volgen van vroege gebeurtenissen die onmiddellijk volgen op hiv-1-infectie, met name de instroom van calcium die gepaard gaat met blootstelling aan het virus en de ontwikkeling van productieve infectie met behulp van een fluorescerend reportervirus. MT-4 cellen worden geladen met een calciumgevoelige kleurstof en gekweekt in geïsoleerde pennen op een nanofluïdisch apparaat. De gekweekte cellen zijn geïnfecteerd met een HIV-1 reporter virus (HIV-1 NLCI). Een fluorescentiemicroscoop boven het nanofluïdische apparaat meet de calciuminstroom gedurende een tijdsverloop van 8 minuten na acute hiv-1-blootstelling. Hiv-1 productieve infectie wordt gemeten in diezelfde cellen over een interval van 4 dagen. Beeldvormingsgegevens uit deze tijdscursussen worden geanalyseerd om virus-host receptorinteracties en signaalroutedynamiek te definiëren. De auteurs presenteren een geïntegreerd, schaalbaar alternatief voor traditionele beeldvormingsmethoden met behulp van een nieuw optofluidic-platform dat in staat is om eencellige sortering, cultivering, imaging en softwareautomatisering te gebruiken. Deze test kan de kinetiek van gebeurtenissen onder verschillende omstandigheden meten, waaronder celtype, agonist of antagonisteffect, terwijl een reeks parameters wordt gemeten. Dit is de eerste gevestigde methode voor nanofluïdische longitudinale eencellige cultuur en beeldvorming met hoge doorvoer: deze techniek kan breed worden aangepast om cellulaire signaalkinetiek en dynamische moleculaire interacties te bestuderen.

Figuur 1 illustreert het formaat van de chip en ruwe beeldvormingsgegevens die via de fluorescentiemicroscoop zijn verkregen. De identificatie en clustering van niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde cellen via mCherry-meting zijn weergegeven in figuur 2. Deze clusters worden geanalyseerd op calciuminfluxkinetiek in figuur 3, die vroege calciuminstroom in hiv-geïnfecteerde cellen aantoont. Figuur 4 toon...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

Hier presenteren we een protocol waarin afzonderlijke cellen worden gecontroleerd op acute gebeurtenissen en productieve HIV-1-infectie op een nanofluïdisch apparaat. Beeldvormingsgegevens definiëren virus-host receptorinteracties en signaalroutedynamiek. Dit is de eerste methode voor nanofluïdische longitudinale eencellige cultuur en beeldvorming met hoge doorvoer om signaalkinetiek en moleculaire interacties te bestuderen.

Eencellige karakterisering van calciuminstroom en HIV-1-infectie met behulp van een Multiparameter Optofluidic Platform

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

Dit protocol kan real-time kinetiek vastleggen op een enkelcellig niveau. We kunnen individuele celparameters meten als reactie op hiv-infectie en vroege signaleringsgebeurtenissen koppelen aan vertraagde stappen van de virale levenscyclus. Dit is een geïntegreerd schaalbaar alternatief voor traditionele beeldvormingsmethoden met behulp van een nieuw optofluidic-platform voor het sorteren, cultiveren, weergeven en automatiseren van één cel.Dit is de eerste gevestigde methode voor nanofluïdische, high-throughput, longitudinale eencellige cultuur en beeldvorming. Deze techniek kan in grote lijnen worden gebruikt om cellulaire signaalkinetiek en dynamische moleculaire interacties in verschillende ziektetoestanden te bestuderen. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk om over te brengen hoe het experiment is opgezet, hoe cellen optisch in pennen worden gesorteerd en hoe infusies via de chip kunnen worden opgezet.Bereid om te beginnen verse Fluo-4 AM-laadoplossing door 25 microliters van 100X geconcentreerd reinigingsmiddel en 2,5 microliter 1,000X Fluo-4 AM toe te voegen aan een buis van 1,5 milliliter en vervolgens vortex om te mengen. Pipetteer 2,5 milliliter kweekmedia in de laadoplossing en keer om om te mengen. Centrifugeer twee miljoen MT-4 cellen op 500 maal G gedurende drie minuten, verwijder vervolgens media en resuspendeer de pellet in twee milliliter van de bereide Fluo-4 AM laadoplossing.Pipet opnieuw opgehangen cellen in een 35 millimeter Petrischaal. Incubeer gedurende 15 tot 30 minuten op 37 graden Celsius en incubeer vervolgens nog eens 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis en centrifugeer de cellen gedurende drie minuten op 500 maal G en verwijder vervolgens het supernatant.Resuspendeer de celkorrel door een milliliter van het kweekmedium in te pipetten en centrifugeer gedurende drie minuten op 500 maal G om te wassen. Resuspendeer de celkorrel door het kweekmedium in te pipetten met een concentratie van twee miljoen cellen per milliliter voor ten minste 50 microliter. Om een chip te bereiden met de bevochtigingsoplossing, die het pennen van cellen vergemakkelijkt, laadt u centrifugebuizen met twee milliliter bevochtigingsoplossing en 50 milliliter gedeioneerd water op het instrument met een nieuwe optofluidische chip en voert u de natte spaanfunctie uit die de chip zal overspoelen met de bevochtigingsoplossing.Incubeer de chip op 50 graden Celsius en spoel de chip drie keer door met water. Zodra het spoelen van water is voltooid, spoelt u de chip met drie cycli van 250 microliter kweekmedia. Vul de celsuspensie van de vorige stap aan met één per 100 delen F127-reinigingsmiddel voor het laden om de kans te verkleinen dat cellen aan de spaankanalen blijven plakken.Gebruik de instrument export naald om cellen te importeren uit een 1,5 milliliter centrifuge buis met de belasting werking en klein volume importeren voor een vijf microliter cel pakket volume. Pencellen met behulp van een geoptimaliseerde opto-elektronische positionering of OEP-spanning van 4,3 volt en vijf micrometer per seconde kooisnelheid met behulp van de auto-penfunctie, die afzonderlijke cellen automatisch detecteert, ze omringt met een OEP-kooi en ze naar een nabijgelegen pen verplaatst. Als cellen van belang blijven na automatisch schrijven, gebruikt u de handmatige penfunctie om doelcellen en een doelpen te selecteren.Zodra het pennen is voltooid, spoelt u de chip met drie cycli van 250 microliter kweekmedia om eventuele resterende niet-getinte cellen uit de chip te wissen. Na het schrijven van cellen, verkrijg fluorescerende beelden van cellen in FITC, Texas Red en DAPI kanalen om de baseline Fluo-4, mCherry en autofluorescentie te meten. Giet HIV-1 in de microchip bij een concentratie van 13 nanogram HIV-1 NLCI per twee miljoen cellen door de suspensie langzaam via de exportsaald in de chip te gieten.Onmiddellijk na hiv-1 toevoeging, herhaaldelijk verkrijgen van beelden in de FITC en DAPI kanalen over een 10-minuten durende tijd cursus. Verkrijg beelden in de Texas Red- en DAPI-kanalen op één, twee, drie en vier dagen na infectie. Deze methode werd gebruikt voor de identificatie en clustering van hiv-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen via mCherry-meting.Cellen met een verandering in mCherry signaal groter of lager dan 40,000 gemiddelde fluorescerende intensiteit werden geclusterd in de mCherry hoge of mCherry lage populatie respectievelijk. Deze clusters werden geanalyseerd op calciuminfluxkinetiek door intracellulair calcium te meten met behulp van Fluo-4 fluorescentie herhaaldelijk gedurende een tijdsverloop van negen minuten, wat vroege calciuminstroom in hiv-geïnfecteerde cellen aantoonde. Een significante positieve correlatie tussen calciuminstroom en mCherry florescentie werd waargenomen.Tijdens het proberen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om te beginnen met de cellen binnen het exponentiële groeibereik voor zowel virusproductie als infectie, omdat overwoekerde cellen zullen resulteren in een dramatische afname van het signaal van deze test. Werken met HIV-1 kan gevaarlijk zijn. Daarom moeten BSL-2-praktijken zoals aangegeven in de OSHA Bloodborne Pathogen Standard altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.Deze techniek is opwindend omdat het ons in staat zal stellen om eencellige fenotypische of transcriptieveranderingen onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen. Dit heeft een breed potentieel voor het correleren van de impact van stimuli op moleculaire paden in veel celtypen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Specifieke markering van de HIV-1 positieve cellen met behulp van een Rev-afhankelijke lentivirale vector uitdrukken van de Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Voorspelling van HIV-1 coreceptor Usage (tropisme) Sequentie analyse met een Genotypische Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro uncoating van HIV-1 Kernen

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Het beoordelen van de Aangeboren Sensing van HIV-1 geïnfecteerde CD4<sup&gt; +</sup&gt; T cellen door plasmacytoïde dendritische cellen gebruiken een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultuur systeem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Conformationele Evaluatie van HIV-1 Trimere envelop glycoproteïnen met een cel-gebaseerde ELISA test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolatie van exosomen uit het plasma van HIV-1 positieve personen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualisatie van HIV-1 Gag Binding aan Giant Unilamellaire bolletjes (GUV) Membranen

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Meting van<em&gt; In Vitro</em&gt; Integratie activiteit van HIV-1 Preintegration Complexen

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...