Name: single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Wir sind dankbar für die wissenschaftlichen Gespräche mit Dr. Benjamin Chen. Diese Arbeit wurde von K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS und KB) und R21AI152833 (THS und KB) finanziert.

1. Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung
<ol><li>Bereiten Sie eine frische Fluo-4 AM-Ladelösung vor: Fügen Sie 25 μL 100x konzentriertes Reinigungsmittellösungsmittel hinzu und fügen Sie dann 2,5 μL Fluo-4 AM 1000x in ein 1,5 ml Röhrchen hinzu. Wirbel zum Mischen.</li>
	<li>2,5 ml Nährmedien in die Ladelösung pipetten und zum Mischen invertieren. Vor Licht schützen.</li>
	<li>Zentrifuge 2 x 106 MT-4 Zellen bei 500 x g für 3 min.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und entfernen Sie d...

<ol>
	<li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+inflammation,+and+HIV+infection.">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li><li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection.">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li><li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors:+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation.">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).</li><li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions.">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li><li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages.">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors.">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+(IL-10)+and+IL-1&#946;+in+a+human+tonsil+explant+model.">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1&#946; in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).</li><li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures.">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases.">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li><li>Chen, P., H&#252;bner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses.">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li><li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca(2+)-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomi&#263;, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels.">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li><li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs.">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).</li><li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity.">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010 (2018).</li><li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform.">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).</li><li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+cell+identification+and+sorting+(LACIS)+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device.">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41 (2018).</li><li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light.">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li><li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator.">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion.">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion.">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).</li></ol>

Die beschriebene Methodik zur Untersuchung der Beziehung zwischen Kalziumzustrom und HIV-1-produktiver Infektion in einzelnen Zellen kann angepasst werden, um die intrazelluläre Kalziumkinetik als Reaktion auf andere Agonisten oder Antagonisten von Interesse zu untersuchen. Die Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung ist einfach, minimal zeitintensiv und Reagenzien sind in praktischen Kits von weit verbreiteten Herstellern erhältlich. Die Calciummessung auf Fluo-4-Basis ist in der Literatur gut beschrieben, und HIV...

Chronische Entzündungen sind eine der Hauptursachen für HIV-assoziierte frühe Morbiditäten und Mortalität1,2,3. Es gibt mehrere Mechanismen, durch die HIV entzündliche Signale aktivieren kann, und neuere Beweise deuten auf eine Rolle für die P2X-Rezeptoren beim HIV-Eintritt hin, die Calcium-gating Adenosintriphosphat (ATP)-Rezeptorensind 3,4,5,6,7,8,9,10. Der P2X-Subtyp der purinergen Rezeptoren (P2XR) kann wichtige Vermittler dieser Entzündung sein. Die molekularen Mechanismen der HIV-P2XR-Interaktionen sind jedoch weitgehend unbekannt und können sich auf frühe und späte Schritte des viralen HIV-1-Lebenszyklus auswirken. Die Definition der Wege und Kinetik, die HIV-assoziierte chronische Entzündungen antreiben, ist entscheidend für die Weiterentwicklung der Behandlungsmöglichkeiten für Menschen mit HIV.
Um zu beurteilen, ob HIV-1 P2X-Rezeptoren direkt quälisiert, müssen P2XR-Aktivierung und HIV-1-Infektion parallel gemessen werden. Assays der P2XR-Aktivität und der HIV-1-Infektion wurden unabhängig voneinander etabliert: Der zelluläre Kalziumzustrom ist ein Indikator für die P2XR-Aktivierung, und die HIV-1-produktive Infektion kann durch RNA-Häufigkeit quantifiziert werden. Der Fluoreszenznachweis von Kalziumzustrom ist mit dem calciumempfindlichen Farbstoff Fluo-4 möglich, und eine HIV-1-Infektion kann mit dem mCherry Fluoreszenz-Reportervirus HIV-NLCI11,12,13,14,15visualisiert werden .
Da diese Indikatoren für die P2X-Aktivierung (akuter zellulärer Kalziumzustrom) und die HIV-1-Infektion (HIV-1-RNA-Synthese) auf unterschiedlichen Zeitskalen (Minuten versus Tage) auftreten, fehlt eine Hochdurchsatzmethode, die eine gepaarte Analyse der P2XR-Aktivierung und der HIV-1-Infektion ermöglicht. Experimentelle Standardtechniken mit hohem Durchsatz, wie die Durchflusszytometrie, ermöglichen die Populationsanalyse, können jedoch den Zusammenhang zwischen akuten und longitudinalen Ereignissen in einzelnen Zellen nicht beurteilen. Alternativ ist die Einzelzellbildgebung mit Standard-Fluoreszenzmikroskopie ein niedriger Durchsatz. Diese experimentellen Einschränkungen erfordern neuartige Hochdurchsatztechniken, um Assoziationen zwischen akuten und longitudinalen zellulären Ereignissen direkt zu messen.
Ein beschriebenes optofluidisches System ist eine neuartige Plattform, die in der Lage ist, Einzelzellensortierung und -isolierung, Kultivierung, Bildgebung und Softwareautomatisierung16,17,18,19zu verwenden. Dieses System stellt eine integrierte Alternative mit hohem Durchsatz zu den Einschränkungen herkömmlicher bildgebender Verfahren dar. Die Beacon-Plattform besteht aus einem Kohlendioxid (CO2)und einem temperaturgesteuerten Inkubator, der die auf einem Chip enthaltenen Zellen unterstützt. Der Chip besitzt lichtempfindliche Transistoren, die als Reaktion auf gezieltes Licht einen elektrischen Gradienten erzeugen. Diese resultierende dielektrophoretische Kraft wird genutzt, um einzelne Zellen über den nanofluidischen Chip in die gewünschten Regionen zu bewegen. Die Zellen werden auf dem Chip in Stifte sortiert, die eine Barriere darstellen, um einzelne Zellen physisch zu isolieren. Ein kontinuierlicher laminarer Fluss von Wachstumsmedien im gesamten Chip verhindert die Zellmigration aus den Pens und ermöglicht gleichzeitig die Diffusion von Nährstoffen und experimentspezifischen Reagenzien mit kleinen Partikeln. Über dem Chip sitzt ein Fluoreszenzmikroskop. Software-Automatisierung wird verwendet, um Bilder des Chips zum benutzerdefinierten Zeitpunkt zu erfassen.
Die gesamte Zellcharakterisierung wurde mit einem optofluidischen System zur Einzelzellselektion und -manipulation durchgeführt. Dieses System besteht aus integrierten mechanischen, mikrofluidischen und optischen Komponenten, die Einzelzellmanipulation, Assay, Kultur und Bildgebung ermöglichen. Die Zellen werden auf das nanofluidische Einweggerät geladen und kultiviert, das aus 3.500 einzelnen Kammern (Pens) besteht, die jeweils ein Sub-Nanoliter-Volumen halten können. Zellen können in Pens mit lichtinduzierten dielektrophoretischen "Käfigen" positioniert und unter temperatur- und CO2-kontrollierten Bedingungenkultiviert werden. Die Mikrofluidik ermöglicht die Perfusion von Medien oder Puffern auf dem Chip zur Zellkultur oder medikamentösen Behandlung. Eine betätigte Nadel ermöglicht den Import und Export von Zellen aus inkubierten und geschlossenen Brunnenplatten. Der Chipbereich kann bei 4- oder 10-facher Vergrößerung in Hellfeld- und Fluoreszenzkanälen (einschließlich DAPI, FITC, TRed oder Cy5) abgebildet werden, um zelluläre Phänotypen oder Funktionsanalysen zu charakterisieren. Das gesamte System wird mithilfe von Software automatisiert, die für vorgefertigte Workflows oder benutzerdefinierte Experimente verwendet werden kann.
Beziehungen zwischen HIV-1-Infektion und P2XR wurden untersucht, aber ein Hochdurchsatzverfahren zur direkten Charakterisierung dieser Wechselwirkungen parallel wurde nicht berichtet. Hier beschreiben die Autoren eine Methodik zur Untersuchung von HIV-P2XR-Interaktionen durch Verfolgung des akuten Kalziumzustroms und der anschließenden HIV-1-produktiven Infektion auf Einzelzellebene. Insbesondere etabliert dies ein neuartiges Werkzeug, das eine direkte Längsmessung mehrerer Ziele in einzelnen Zellen mit hohem Durchsatz ermöglicht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Beacon Optofluidic System</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FIJI</td>
			<td colspan="2">Open-source software</td>
			<td>PMID: 22743772, 22930834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluo-4 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;F10489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;HIV-1 NLCINL4-3</td>
			<td colspan="2">Laboratory of Benjamin Chen</td>
			<td>PMID: 28148796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td colspan="2">GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>&#160;SV30010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MT-4 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent</td>
			<td></td>
			<td>&#160;ARP-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OptoSelect 3500 chip</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Prism 9.0.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform

HIV-1 verursacht eine chronische Infektion, von der weltweit mehr als 37 Millionen Menschen betroffen sind. Menschen, die mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) leben, erleben trotz antiretroviraler Therapie eine Komorbidität im Zusammenhang mit chronischen Entzündungen. Diese entzündlichen Signale wurden jedoch nicht vollständig charakterisiert. Die Rolle von Früheintrittsereignissen bei der Aktivierung zellulärer Signalereignisse und der nachgelagerten Genexpression wurde auf Einzelzellebene nicht erfasst. Hier beschreiben die Autoren eine Methode, die Prinzipien der Lebendzellfluoreszenzmikroskopie auf eine automatisierte Einzelzellplattform anwendet, die Zellen über benutzerspezifische Zeitkurse kulturiert und abbildet, was eine Hochdurchsatzanalyse dynamischer zellulärer Prozesse ermöglicht. Dieser Assay kann die einzellige Live-Fluoreszenzmikroskopie von frühen Ereignissen verfolgen, die unmittelbar auf eine HIV-1-Infektion folgen, insbesondere den Zustrom von Kalzium, der mit der Exposition gegenüber dem Virus einhergeht, und die Entwicklung einer produktiven Infektion mit einem fluoreszierenden Reportervirus. MT-4-Zellen werden mit einem kalziumempfindlichen Farbstoff beladen und in isolierten Pens auf einem nanofluidischen Gerät kultiviert. Die kultivierten Zellen sind mit einem HIV-1-Reportervirus (HIV-1 NLCI) infiziert. Ein Fluoreszenzmikroskop, das über dem nanofluidischen Gerät positioniert ist, misst den Kalziumzustrom über einen Zeitraum von 8 Minuten nach akuter HIV-1-Exposition. Die HIV-1-produktive Infektion wird in denselben Zellen über ein 4-Tage-Intervall gemessen. Bildgebende Daten aus diesen Zeitverläufen werden analysiert, um Virus-Wirt-Rezeptor-Interaktionen und Signalwegdynamik zu definieren. Die Autoren präsentieren eine integrierte, skalierbare Alternative zu herkömmlichen Bildgebungsmethoden mit einer neuartigen optofluidischen Plattform, die in der Lage ist, Einzelzellensortierung, Kultivierung, Bildgebung und Softwareautomatisierung zu ermöglichen. Dieser Assay kann die Kinetik von Ereignissen unter verschiedenen Bedingungen messen, einschließlich Zelltyp, Agonist oder Antagonisteneffekt, während er eine Reihe von Parametern misst. Dies ist die erste etablierte Methode für nanofluidische Hochdurchsatz-Längskultur und Bildgebung: Diese Technik kann breit angepasst werden, um zelluläre Signalkinetik und dynamische molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen.

Abbildung 1 zeigt das Format des Chips und die mit dem Fluoreszenzmikroskop erfassten Rohdaten. Die Identifizierung und Clusterung von nicht infizierten und infizierten Zellen mittels mCherry-Messung ist in Abbildung 2 dargestellt. Diese Cluster werden in Abbildung 3auf Kalziumzuflusskinetik analysiert, die einen frühen Kalziumzustrom in HIV-infizierten Zellen zeigt. Abbildung 4 zeigt eine signifikante...

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Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

Hier stellen wir ein Protokoll vor, in dem einzelne Zellen auf akute Ereignisse und produktive HIV-1-Infektionen auf einem nanofluidischen Gerät überwacht werden. Bildgebende Daten definieren Virus-Wirt-Rezeptor-Interaktionen und Signalwegdynamik. Dies ist die erste Methode für nanofluidische Hochdurchsatz-Längskultur und Bildgebung von Einzelzellen, um Signalkinetik und molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen.

Einzelzellcharakterisierung von Kalziumzufluss und HIV-1-Infektion mit einer multiparametern optofluidischen Plattform

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

Dieses Protokoll kann Echtzeitkinetik auf Einzelzellebene erfassen. Wir können einzelne Zellparameter als Reaktion auf eine HIV-Infektion messen und frühe Signalereignisse mit verzögerten Schritten des viralen Lebenszyklus in Verbindung bringen. Dies ist eine integrierte, skalierbare Alternative zu herkömmlichen Bildgebungsmethoden mit einer neuartigen optofluidischen Plattform für Einzelzellsortierung, Kultivierung, Bildgebung und Softwareautomatisierung.Dies ist die erste etablierte Methode für nanofluidische, hochdurchsatzige, longitudinale Einzelzellkultur und Bildgebung. Diese Technik kann breit eingesetzt werden, um zelluläre Signalkinetik und dynamische molekulare Interaktionen in einer Vielzahl von Krankheitszuständen zu untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, um zu vermitteln, wie das Experiment aufgebaut ist, wie Zellen optisch in Stifte sortiert werden und wie Infusionen durch den Chip eingerichtet werden.Bereiten Sie zunächst eine frische Fluo-4 AM-Ladelösung vor, indem Sie 25 Mikroliter 100X konzentriertes Reinigungsmittellösungsmittel und 2,5 Mikroliter 1.000X Fluo-4 AM in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen geben und dann Wirbel mischen. 2,5 Milliliter Nährmedien in die Ladelösung pipetten und zum Mischen invertieren. Zentrifugieren Sie zwei Millionen MT-4-Zellen bei 500 mal G für drei Minuten, entfernen Sie dann das Medium und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern der vorbereiteten Fluo-4 AM-Ladelösung.Pipetette re-suspendierte Zellen in eine 35 Millimeter Petrischale. Bei 37 Grad Celsius 15 bis 30 Minuten inkubieren und dann weitere 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen geben und die Zellen drei Minuten lang bei 500 mal G zentrifugieren, dann den Überstand entfernen.Das Zellpellet wird durch Pipettieren in einem Milliliter des Kulturmediums wieder aufgebläsen und bei 500 mal G zentrifugiert, um drei Minuten lang zu waschen. Resuspendieren Sie das Zellpellet durch Pipettieren im Kulturmedium in einer Konzentration von zwei Millionen Zellen pro Milliliter für mindestens 50 Mikroliter. Um einen Chip mit der Benetzungslösung vorzubereiten, der das Zellpfing erleichtert, laden Sie Zentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern Benetzungslösung und 50 Milliliter entionisiertem Wasser mit einem neuen optofluidischen Chip auf das Instrument und führen Sie die Nasschipfunktion aus, die den Chip mit der Benetzungslösung überflutet.Inkubieren Sie den Chip bei 50 Grad Celsius und spülen Sie den Chip dreimal mit Wasser. Sobald die Wasserspülung abgeschlossen ist, spülen Sie den Chip mit drei Zyklen von 250 Mikrolitern Nährmedien. Ergänzen Sie die Zellsuspension aus dem vorherigen Schritt mit einem pro 100 Teile F127-Waschmittel gelöstem Stoff vor der Beladung, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass Zellen an den Chipkanälen haften.Verwenden Sie die Instrumentenexportnadel, um Zellen aus einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr mit dem Lastbetrieb und dem Import kleiner Mengen für ein Zellpaketvolumen von fünf Mikrolitern zu importieren. Stiftzellen mit einer optimierten optoelektronischen Positionierung oder OEP-Spannung von 4,3 Volt und fünf Mikrometern pro Sekunde Käfiggeschwindigkeit unter Verwendung der Auto-Pen-Funktion, die einzelne Zellen automatisch erkennt, sie mit einem OEP-Käfig umgibt und sie in einen nahe gelegenen Stift bewegt. Wenn nach dem automatischen Penning noch interessante Zellen übrig bleiben, verwenden Sie die manuelle Stiftfunktion, um Zielzellen und einen Zielstift auszuwählen.Sobald das Penning abgeschlossen ist, spülen Sie den Chip mit drei Zyklen von 250 Mikrolitern Nährmedien, um alle verbleibenden nicht verbrauchten Zellen vom Chip zu befreien. Nach dem Penning von Zellen erhalten Sie fluoreszierende Bilder von Zellen in FITC-, Texas Red- und DAPI-Kanälen, um die Ausgangswerte Fluo-4, mCherry und Autofluoreszenz zu messen. Infundieren Sie HIV-1 in einer Konzentration von 13 Nanogramm HIV-1 NLCI pro zwei Millionen Zellen in den Mikrochip, indem Sie die Suspension langsam durch die Exportnadel in den Chip pipettieren.Unmittelbar nach der HIV-1-Zugabe erhalten Sie wiederholt Bilder in den FITC- und DAPI-Kanälen über einen 10-minütigen Zeitverlauf. Erhalten Sie Bilder in den Texas Red- und DAPI-Kanälen ein, zwei, drei und vier Tage nach der Infektion. Diese Methodik wurde für die Identifizierung und Clusterung von HIV-infizierten und nicht infizierten Zellen mittels mCherry-Messung verwendet.Zellen mit einer Änderung des mCherry-Signals größer oder niedriger als 40.000 mittlere Fluoreszenzintensität wurden in die mCherry High bzw. mCherry Low Population gruppiert. Diese Cluster wurden auf Kalzium-Zuflusskinetik analysiert, indem intrazelluläres Kalzium mit Fluo-4-Fluoreszenz wiederholt über einen neunminütigen Zeitverlauf gemessen wurde, was einen frühen Kalziumzustrom in HIV-infizierten Zellen zeigte. Es wurde eine signifikante positive Korrelation zwischen Kalziumzufluss und mCherry-Floreszenz beobachtet.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, mit den Zellen innerhalb des exponentiellen Wachstumsbereichs sowohl für die Virusproduktion als auch für die Infektion zu beginnen, da überwachsene Zellen zu einer dramatischen Abnahme des Signals dieses Assays führen. Die Arbeit mit HIV-1 kann gefährlich sein. Daher sollten BSL-2-Praktiken, wie im OSHA Bloodborne Pathogen Standard angegeben, während dieses Verfahrens immer durchgeführt werden.Diese Technik ist spannend, weil sie es uns ermöglicht, einzellige phänotypische oder transkriptionelle Veränderungen unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. Dies hat ein breites Potenzial, den Einfluss von Reizen auf molekulare Signalwege in vielen Zelltypen zu korrelieren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Spezielle Kennzeichnung von HIV-1 positiven Zellen mit Hilfe eines Rev-abhängigen Lentivirale Vector mit dem Ausdruck des Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Vorhersage von HIV-1 Korezeptor Usage (Tropismus) durch Sequenzanalyse mit einem Genotypische Ansatz

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualisierung von HIV-1 Gag Bindung an Riesen unilamellare Vesikeln (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Messung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...