Name: single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

אנו אסירי תודה על הדיונים המדעיים עם ד"ר בנג'מין צ'ן. עבודה זו מומנה על ידי K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS ו KB), ו R21AI152833 (THS ו KB).

1. הכנת תאים להדמיה
<ol><li>הכן פתרון טעינה טרי Fluo-4 AM: להוסיף 25 μL של ממס דטרגנט מרוכז 100x, ולאחר מכן להוסיף 2.5 μL של Fluo-4 AM 1000x לצינור 1.5 מ"ל. וורטקס לערבב.</li>
	<li>פיפטה 2.5 מ"ל של מדיה תרבותית לפתרון הטעינה והפוך לערבב. הגן מפני אור.</li>
	<li>צנטריפוגה 2 x 106 MT-4 תאים ב 500 x g במשך 3 דקות.</li>
	<li>הסר מדיה ו...

<ol>
	<li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+inflammation,+and+HIV+infection.">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li><li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection.">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li><li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors:+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation.">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).</li><li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions.">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li><li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages.">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors.">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+(IL-10)+and+IL-1&#946;+in+a+human+tonsil+explant+model.">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1&#946; in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).</li><li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures.">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases.">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li><li>Chen, P., H&#252;bner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses.">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li><li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca(2+)-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomi&#263;, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels.">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li><li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs.">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).</li><li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity.">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010 (2018).</li><li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform.">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).</li><li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+cell+identification+and+sorting+(LACIS)+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device.">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41 (2018).</li><li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light.">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li><li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator.">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion.">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion.">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).</li></ol>

המתודולוגיה המתוארת כדי לחקור את הקשר בין זרם סידן לבין זיהום פרודוקטיבי HIV-1 בתאים בודדים ניתן להתאים ללמוד קינטיקה סידן תאיים בתגובה אגוניסטים אחרים או אנטגוניסטים של עניין. הכנת תאים להדמיה היא פשוטה, מינימלית זמן אינטנסיבי, ריאגנטים זמינים ערכות נוחות של יצרנים בשימוש נרחב. מדידת סידן...

דלקת כרונית היא הגורם המוביל לתחלואה מוקדמת הקשורה ל- HIV ותמותה1,2,3. ישנם מנגנונים רבים לפיהם HIV יכול להפעיל איתות דלקתי, והראיות האחרונות מצביעות על תפקיד עבור קולטני P2X בהזנת HIV שהם סידן-gating אדנוזין טריפוספט (ATP) קולטנים3,4,5,6,7,8,9,10. תת סוג P2X של קולטנים purinergic (P2XR) עשוי להיות מנחים חשובים של דלקת זו. עם זאת, המנגנונים המולקולריים של אינטראקציות HIV-P2XR אינם ידועים במידה רבה ועשויים להשפיע על צעדי מחזור החיים הנגיפיים המוקדמים והמאוחרים של HIV-1. הגדרת המסלולים והקינטיקה המניעים דלקת כרונית הקשורה ל- HIV היא קריטית לקידום אפשרויות הטיפול עבור אנשים עם HIV.
כדי להעריך אם HIV-1 מייסר ישירות קולטני P2X, הפעלת P2XR וזיהום HIV-1 חייב להימדד במקביל. מבחנים של פעילות P2XR וזיהום HIV-1 הוקמו באופן עצמאי: זרם הסידן התאי הוא אינדיקטור להפעלת P2XR, וזיהום פרודוקטיבי HIV-1 יכול להיות מכמת על ידי שפע RNA. גילוי פלואורסצנטי של זרם סידן אפשרי עם צבע פלואו-4 סידן רגיש, וזיהום HIV-1 ניתן לדמיין עם וירוס הכתב פלורסנט mCherry HIV-NLCI11,12,13,14,15.
מכיוון שאינדיקטורים אלה להפעלת P2X (זרם סידן תאי חריף) וזיהום HIV-1 (סינתזת HIV-1 RNA) מתרחשים על צירי זמן שונים (דקות לעומת ימים), חסרה שיטת תפוקה גבוהה המאפשרת ניתוח מזווג של הפעלת P2XR וזיהום HIV-1. טכניקות ניסיוניות סטנדרטיות בעלות תפוקה גבוהה, כגון ציטומטריית זרימה, מאפשרות ניתוח אוכלוסין אך אינן יכולות להעריך את הקשר בין אירועים אקוטיים לאירועים אורך בתאים בודדים. לחלופין, הדמיה חד-תאית עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי היא בעלת תפוקה נמוכה. מגבלות ניסיוניות אלה מציגות צורך בטכניקות חדשניות בעלות תפוקה גבוהה למדידת קשרים בין אירועים תאיים חריפים ואורך ישירות.
מערכת אופטופלוידית המתוארת היא פלטפורמה חדשנית המסוגלת למיין ולבודד תא יחיד, culturing, הדמיה, ואוטומציה תוכנה16,17,18,19. מערכת זו מציגה חלופה משולבת ובעלת תפוקה גבוהה למגבלות של שיטות הדמיה מסורתיות. פלטפורמת ביקון מורכבת מפחמן דו חמצני (CO2)ואינקובטור מבוקר טמפרטורה התומך בתאים הכלולים בשבב. השבב בעל טרנזיסטורים רגישים לאור המייצרים שיפוע חשמלי בתגובה לאור ממוקד. כוח דיאלקטרופורטי זה משמש להעברת תאים בודדים על פני השבב הננופלואידי לאזורים הרצויים. תאים ממוינים לתוך עטים על השבב, אשר מספקים מחסום לבודד תאים בודדים פיזית. זרימה למינארית רציפה של מדיית צמיחה בכל השבב מונעת נדידת תאים מן העטים תוך מתן אפשרות לפיזור חלקיקים קטנים של חומרים מזינים ריאגנטים ספציפיים לניסוי. מיקרוסקופ פלואורסצנטי יושב מעל השבב. אוטומציית תוכנה משמשת ללכידת תמונות של השבב בנקודת הזמן שצוינה על-ידי המשתמש.
כל אפיון התאים בוצע באמצעות מערכת אופטופלוידית לבחירה ומניפולציה של תא יחיד. מערכת זו מורכבת מרכיבים מכניים, מיקרופלואידיים ואופטיים משולבים המאפשרים מניפולציה, מבחנים, תרבות והדמיה חד-תאיים. התאים טעונים ומתרבתים במכשיר הננו-פלוואידי החד פעמי המורכב מ-3,500 תאים בודדים (עטים), שכל אחד מהם מסוגל להחזיק נפח תת-ננו-ליטר. תאים יכולים להיות ממוקמים בתוך עטים באמצעות אור המושרה "כלובים" dielectrophoretic ותרבית בתנאים מבוקרים טמפרטורה ו- CO2. microfluidics לאפשר זלוף של מדיה או חוצצים על השבב לתרבות התא או טיפול תרופתי. מחט מופעלת מאפשרת ייבוא וייצוא של תאים מצלחות באר דגירה ותריסים. ניתן לדמיין את אזור השבב בהגדלה של פי 4 או 10 בערוצי brightfield ופלואורסצנטיים (כולל DAPI, FITC, TRed או Cy5) כדי לאפיין פנוטיפים תאיים או ניתוח פונקציונלי. המערכת כולה אוטומטית באמצעות תוכנה שניתן להשתמש בה עבור זרימות עבודה מעוצבות מראש או ניסויים מותאמים אישית.
יחסים בין זיהום HIV-1 ו P2XR נחקרו, אבל הליך תפוקה גבוהה לאפיין ישירות אינטראקציות אלה במקביל לא דווח. כאן, המחברים מתארים מתודולוגיה לחקור אינטראקציות HIV-P2XR באמצעות מעקב אחר זרם סידן חריף וזיהום פרודוקטיבי HIV-1 הבאים ברמת תא יחיד. יש לציין, זה יוצר כלי חדשני המאפשר ישיר, תפוקה גבוהה, מדידה אורך של מטרות מרובות בתאים בודדים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Beacon Optofluidic System</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FIJI</td>
			<td colspan="2">Open-source software</td>
			<td>PMID: 22743772, 22930834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluo-4 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;F10489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;HIV-1 NLCINL4-3</td>
			<td colspan="2">Laboratory of Benjamin Chen</td>
			<td>PMID: 28148796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td colspan="2">GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>&#160;SV30010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MT-4 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent</td>
			<td></td>
			<td>&#160;ARP-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OptoSelect 3500 chip</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Prism 9.0.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform

HIV-1 גורם לזיהום כרוני המשפיע על יותר מ -37 מיליון אנשים ברחבי העולם. אנשים החיים עם וירוס כשל חיסוני אנושי (HIV) חווים תחלואה הקשורה לדלקת כרונית למרות טיפול תרופתי. עם זאת, איתות דלקתי אלה לא התאפיינו באופן מלא. תפקידם של אירועי כניסה מוקדמת על הפעלת אירועי איתות תאיים וביטוי גנים במורד הזרם לא נלכד ברמת תא יחיד. כאן המחברים מתארים שיטה המחילה עקרונות של מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של תאים חיים על פלטפורמה אוטומטית של תא יחיד, המתרבתת ודימוי תאים במהלך קורסי זמן מותאמים אישית על-ידי המשתמש, ומאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של תהליכים תאיים דינמיים. בדיקה זו יכולה לעקוב אחר מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חיה חד-תאית של אירועים מוקדמים מיד לאחר הידבקות ב- HIV-1, במיוחד זרם הסידן המלווה חשיפה לנגיף ופיתוח זיהום פרודוקטיבי באמצעות וירוס כתב פלואורסצנטי. תאי MT-4 עמוסים בצבע רגיש לסידן ומתרבים בעטים מבודדים במכשיר ננופלואידי. התאים התרבותיים נגועים בנגיף כתב HIV-1 (HIV-1 NLCI). מיקרוסקופ פלואורסצנטי הממוקם מעל המכשיר הננופלואידי מודד זרימת סידן לאורך 8 דקות לאחר חשיפה חריפה ל- HIV-1. זיהום פרודוקטיבי HIV-1 נמדד באותם תאים על פני מרווח של 4 ימים. נתוני הדמיה מקורסי זמן אלה מנותחים כדי להגדיר אינטראקציות קולטן מארח וירוסים ודינמיקת מסלול איתות. המחברים מציגים חלופה משולבת ומדרגית לשיטות הדמיה מסורתיות באמצעות פלטפורמה אופטופלוידית חדשנית המסוגלת למיין תא יחיד, culturing, הדמיה ואוטומציה של תוכנה. מבחנים אלה יכולים למדוד את הקינטיקה של אירועים בתנאים שונים, כולל סוג התא, אגוניסט או אפקט אנטגוניסט, תוך מדידת מערך של פרמטרים. זוהי השיטה המבוססת הראשונה לתרבות חד-תאית ננופלואידית בעלת תפוקה גבוהה והדמיה: טכניקה זו יכולה להיות מותאמת באופן נרחב לחקר קינטיקה איתות תאי ואינטראקציות מולקולריות דינמיות.

איור 1 מדגים את הפורמט של נתוני השבב וההדמיה הגולמית הנרכשים באמצעות מיקרוסקופ הפלואורסצנטי. הזיהוי והקיבוץ באשכולות של תאים לא נגועים ונדבקים באמצעות מדידת mCherry מוצגים באיור 2. אשכולות אלה מנותחים לקינטיקה של זרם הסידן באיור 3, הממחישה זרם ...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שבו תאים בודדים מנוטרים לאירועים חריפים וזיהום HIV-1 פרודוקטיבי במכשיר ננופלואידי. נתוני דימות מגדירים אינטראקציות של קולטן מארח וירוסים ודינמיקה של מסלולי איתות. זוהי השיטה הראשונה עבור תרבות תא יחיד אורך תפוקה גבוהה ננופלואידית והדמיה ללמוד קינטיקה איתות ואינטראקציות מולקולריות.

אפיון תא יחיד של זרם סידן וזיהום HIV-1 באמצעות פלטפורמה אופטופלוידית רב-מפרקית

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

פרוטוקול זה יכול ללכוד קינטיקה בזמן אמת ברמת תא יחיד. אנו יכולים למדוד פרמטרים בודדים של התאים בתגובה לזיהום ב- HIV ולשייך אירועי איתות מוקדמים עם צעדים מאוחרים של מחזור החיים הנגיפי. זוהי חלופה מדרגית משולבת לשיטות הדמיה מסורתיות באמצעות פלטפורמה אופטופלוידית חדשנית למיון תאים בודדים, פולחן, הדמיה ואוטומציה של תוכנה.זוהי השיטה הראשונה הוקמה עבור ננופלואידית, תפוקה גבוהה, תרבית תא יחיד אורך והדמיה. טכניקה זו יכולה להיות מאומצת באופן נרחב כדי ללמוד קינטיקה איתות הסלולר אינטראקציות מולקולריות דינמיות במגוון מצבי מחלה. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה כדי להעביר את האופן שבו הניסוי מוגדר, כיצד התאים ממוינים אופטית לתוך עטים, וכיצד להגדיר חליטות דרך השבב.כדי להתחיל, להכין פתרון טעינה טרי Fluo-4 AM על ידי הוספת 25 microliters של ממס דטרגנט מרוכז 100X ו 2.5 microliters של 1, 000X Fluo-4 AM לצינור 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן מערבולת לערבב. פיפטה 2.5 מיליליטר של מדיה תרבותית לפתרון הטעינה וההפך לערבב. צנטריפוגה שני מיליון MT-4 תאים ב 500 פעמים G במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להסיר את המדיה ולהשתעלות מחדש את גלולה בשני מיליליטר של פתרון הטעינה המוכן Fluo-4 AM.פיפט השעתה מחדש תאים לצלחת פטרי 35 מ"מ. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 עד 30 דקות, ולאחר מכן דגירה במשך 15 עד 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. להעביר את ההשעיה התא צינור צנטריפוגה צנטריפוגה צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים G במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.Resuspend גלולת התא על ידי pipetting במיליליטר אחד של מדיום התרבות צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך שלוש דקות לשטוף. Resuspend גלולת התא על ידי pipetting במדיום התרבות בריכוז של שני מיליון תאים למיליליטר עבור לפחות 50 microliters. כדי להכין שבב עם פתרון הרטבה, אשר מקל על כתיבת תאים, לטעון צינורות צנטריפוגה המכילים שני מיליליטר של פתרון הרטבה ו 50 מיליליטר של מים deionized על המכשיר עם שבב optofluidic חדש ולהפעיל את פונקציית שבב רטוב אשר להציף את השבב עם פתרון הרטבה.דגירה השבב ב 50 מעלות צלזיוס ולשטוף את השבב עם מים שלוש פעמים. לאחר שטיפת מים נעשה, לשטוף את השבב עם שלושה מחזורים של 250 microliters של מדיה תרבות. להשלים את השעיית התא מהשלב הקודם עם אחד לכל 100 חלקים F127 חומר ניקוי מסיס לפני הטעינה כדי להפחית את הסבירות של תאים נדבקים לערוצי השבב.השתמש במחט ייצוא המכשיר כדי לייבא תאים מצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר עם פעולת העומס וייבוא נפח קטן עבור נפח חבילת תאים חמישה microliter. תאי עט המשתמשים במיקום אופטו-אלקטרוני ממוטב או במתח OEP של 4.3 וולט וחמישה מיקרומטרים לשניה במהירות כלוב באמצעות פונקציית העט האוטומטי, שתזהה תאים בודדים באופן אוטומטי, תקיף אותם בכלוב OEP ותעביר אותם לעט סמוך. אם תאים מעניינים נשארים לאחר ההטבעה האוטומטית, השתמש בפונקציית העט הידנית כדי לבחור תאי יעד ועט יעד.לאחר השלמת ה penning, לשטוף את השבב עם שלושה מחזורים של 250 microliters של מדיה תרבות כדי לנקות את כל התאים שנותרו unpenned מהשבב. לאחר כתיבת תאים, השג תמונות פלואורסצנטיות של תאים בערוצי FITC, טקסס רד ו- DAPI כדי למדוד את פלואו-4 הבסיסי, mCherry ושפע אוטומטי. להחדיר HIV-1 לתוך השבב בריכוז של 13 ננוגרם של HIV-1 NLCI לכל שני מיליון תאים על ידי צינור איטי את ההשעיה לתוך השבב באמצעות מחט הייצוא.מיד לאחר תוספת HIV-1, שוב ושוב להשיג תמונות בערוצי FITC ו DAPI על פני קורס זמן של 10 דקות. השג תמונות בערוצי טקסס רד ו-DAPI באחד, שניים, שלושה וארבעה ימים לאחר ההדבקה. מתודולוגיה זו שימשה לזיהוי וקיבוץ של תאים נגועים ב- HIV ולא נגועים באמצעות מדידת mCherry.תאים עם שינוי באות mCherry גדול או נמוך מ 40, 000 ממוצע עוצמת פלואורסצנט היו מקובצים לתוך mCherry גבוהה או mCherry אוכלוסייה נמוכה בהתאמה. אשכולות אלה נותחו עבור קינטיקה זרם סידן על ידי מדידת סידן תאיים באמצעות פלואורסצנטיות Fluo-4 שוב ושוב על פני קורס זמן של תשע דקות, אשר הוכיח זרם סידן מוקדם בתאים נגועים ב- HIV. מתאם חיובי משמעותי בין זרם סידן לבין פלורסנט mCherry נצפתה.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להתחיל עם התאים בטווח הצמיחה המעריכי הן עבור ייצור וירוסים והן זיהום כי תאים מגודלים יגרום לירידה דרמטית באות ממסיפת תינוק זו. עבודה עם HIV-1 יכולה להיות מסוכנת. לכן, BSL-2 שיטות כפי שצוין בתקן פתוגן המועבר בדם OSHA תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.טכניקה זו היא מרגשת כי זה יאפשר לנו ללמוד שינויים פנוטיפיים חד תאיים או שעתוק בתנאים מבוקרים. יש לזה פוטנציאל רחב לתאם את ההשפעה של גירויים על מסלולים מולקולריים בסוגי תאים רבים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

סימון ספציפיות של HIV-1 תאים חיוביים באמצעות וקטור Rev-מותנה lentiviral מבטא את חלבון פלואורסצנטי ירוק

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

ניבוי של שימוש בנגיף HIV-1 Coreceptor (זיקה) על ידי ניתוח רצף באמצעות גישת genotypic

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

ויזואליזציה של HIV-1 Gag מחייב את הענק Unilamellar שלפוחיות (בוס) ממברנות

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...