Name: single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00
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हम डॉ बेंजामिन चेन के साथ वैज्ञानिक चर्चाओं के लिए आभारी हैं । इस काम को K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS और KB), और R21AI152833 (THS और KB) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

1. इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी
<ol><li>ताजा Fluo-4 AM लोडिंग समाधान तैयार करें: 100x केंद्रित डिटर्जेंट सॉल्वेंट के 25 माइक्रोन जोड़ें, फिर 1.5 एमएल ट्यूब में 1000x AM फ्लू-4 एएम 1000x का 2.5 माइक्रोन जोड़ें। भंवर मिश्रण करन?...

<ol>
	<li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+inflammation,+and+HIV+infection.">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li><li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection.">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li><li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors:+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation.">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).</li><li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions.">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li><li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages.">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors.">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+(IL-10)+and+IL-1&#946;+in+a+human+tonsil+explant+model.">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1&#946; in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).</li><li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures.">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases.">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li><li>Chen, P., H&#252;bner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses.">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li><li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca(2+)-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomi&#263;, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels.">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li><li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs.">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).</li><li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity.">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010 (2018).</li><li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform.">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).</li><li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+cell+identification+and+sorting+(LACIS)+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device.">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41 (2018).</li><li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light.">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li><li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator.">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion.">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion.">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).</li></ol>

एकल कोशिकाओं में कैल्शियम की आमद और एचआईवी-1 उत्पादक संक्रमण के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए वर्णित पद्धति को अन्य पीड़ावादियों या ब्याज के विरोधी के जवाब में इंट्रासेलुलर कैल्शियम काइनेटिक्स क?...

पुरानी सूजन एचआईवी से जुड़ी प्रारंभिक रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है1,2,3. ऐसे कई तंत्र हैं जिनके कारण एचआईवी भड़काऊ संकेतों को सक्रिय कर सकता है, और हाल के साक्ष्य एचआईवी प्रवेश में पी 2एक्स रिसेप्टर्स के लिए एक भूमिका का सुझाव देते हैं जो कैल्शियम-गेटिंग एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) रिसेप्टर्स3,4,5,6,7,8,9,10हैं। प्यूरिनेर्जिक रिसेप्टर्स (पी2Xआर) का पी2एक्स उपप्रकार इस सूजन के महत्वपूर्ण सुविधाप्रदाताओं हो सकता है। हालांकि, एचआईवी-P2XR इंटरैक्शन के आणविक तंत्र काफी हद तक अज्ञात हैं और जल्दी और देर से एचआईवी-1 वायरल जीवन चक्र चरणों को प्रभावित कर सकते हैं। एचआईवी से जुड़े पुरानी सूजन ड्राइविंग रास्तों और काइनेटिक्स को परिभाषित एचआईवी के साथ लोगों के लिए उपचार के विकल्प को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है ।
यह आकलन करने के लिए कि क्या एचआईवी-1 सीधे P2X रिसेप्टर्स, P2XR सक्रियण और एचआईवी-1 संक्रमण को समानांतर रूप से मापा जाना चाहिए । P2XR गतिविधि और एचआईवी-1 संक्रमण के परख स्वतंत्र रूप से स्थापित किया गया है: सेलुलर कैल्शियम बाढ़ P2XR सक्रियण का एक संकेतक है, और एचआईवी-1 उत्पादक संक्रमण आरएनए बहुतायत द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । फ्लोरेसेंस का पता लगाना फ्लोरो-4 कैल्शियम-सेंसिटिव डाई के साथ संभव है, और एचआईवी-1 संक्रमण की कल्पना म्हेरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर वायरसएचआईवी-एनएलसीआई 11,12,13,14, 15के साथ की जा सकती है।
क्योंकि P2X सक्रियण (तीव्र सेलुलर कैल्शियम आमद) और एचआईवी-1 संक्रमण (एचआईवी-1 आरएनए संश्लेषण) के ये संकेतक विभिन्न टाइमस्केल (मिनट बनाम दिन) पर होते हैं, इसमें एक उच्च थ्रूपुट विधि का अभाव है जो P2XR सक्रियण और एचआईवी-1 संक्रमण के युग्मित विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। प्रवाह साइटोमेट्री जैसी मानक उच्च-थ्रूपुट प्रयोगात्मक तकनीकें जनसंख्या विश्लेषण के लिए अनुमति देती हैं, लेकिन एकल कोशिकाओं में तीव्र और देशांतर घटनाओं के बीच संबंधों का आकलन नहीं कर सकतीं। वैकल्पिक रूप से, मानक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ एकल-सेल इमेजिंग कम थ्रूपुट है। ये प्रयोगात्मक सीमाएं सीधे तीव्र और देशांतर सेलुलर घटनाओं के बीच संघों को मापने के लिए उपन्यास, उच्च-थ्रूपुट तकनीकों की आवश्यकता प्रस्तुत करती हैं।
वर्णित एक ऑप्टोफ्लुइडिक सिस्टम एक उपन्यास मंच है जो एकल-कोशिका छंटाई और अलगाव, संस्कृति, इमेजिंग और सॉफ्टवेयरस्वचालन16, 17,18,19में सक्षम है। यह प्रणाली पारंपरिक इमेजिंग विधियों की सीमाओं के लिए एक एकीकृत, उच्च थ्रूपुट विकल्प प्रस्तुत करती है। बीकन प्लेटफॉर्म में कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2)और तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर होता है जो चिप पर निहित कोशिकाओं का समर्थन करता है। चिप में फोटोसेंसिटिव ट्रांजिस्टर होते हैं जो लक्षित प्रकाश के जवाब में विद्युत ढाल उत्पन्न करते हैं। इसके परिणामस्वरूप डाइइलोथ्रोपोरेटिक बल का उपयोग नैनोफ्लुइडिक चिप में व्यक्तिगत कोशिकाओं को वांछित क्षेत्रों में ले जाने के लिए किया जाता है। कोशिकाओं को चिप पर कलम में हल किया जाता है, जो व्यक्तिगत कोशिकाओं को शारीरिक रूप से अलग करने के लिए एक बाधा प्रदान करते हैं । चिप भर में विकास मीडिया के निरंतर laminar प्रवाह कलम से सेल प्रवास रोकता है, जबकि पोषक तत्वों और प्रयोग विशिष्ट अभिकर्मकों के छोटे कण प्रसार के लिए अनुमति देता है । एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप चिप के ऊपर बैठता है। सॉफ्टवेयर स्वचालन का उपयोग उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट समय बिंदु पर चिप की छवियों को कैप्चर करने के लिए किया जाता है।
सभी सेल लक्षण वर्णन एकल सेल चयन और हेरफेर के लिए एक ऑप्टोफ्लुइड सिस्टम का उपयोग करके किया गया था। इस प्रणाली में एकीकृत यांत्रिक, माइक्रोफ्लुइडिक और ऑप्टिकल घटक होते हैं जो एकल-कोशिका हेरफेर, परख, संस्कृति और इमेजिंग को सक्षम करते हैं। कोशिकाओं को डिस्पोजेबल नैनोफ्लुइडिक डिवाइस पर लोड और सुसंस्कृत किया जाता है जिसमें 3,500 व्यक्तिगत कक्ष (कलम) होते हैं, प्रत्येक उप-नैनोलीटर मात्रा रखने में सक्षम होता है। कोशिकाओं को प्रकाश-प्रेरित डाइइलेक्टोफोरेटिक "पिंजरों" का उपयोग करके कलम के भीतर तैनात किया जा सकता है और तापमान के तहत सुसंस्कृत-और सीओ2-नियंत्रितस्थितियों । माइक्रोफ्लुइडिक्स सेल कल्चर या ड्रग ट्रीटमेंट के लिए चिप पर मीडिया या बफ़र्स के परफ्यूजन की इजाजत देते हैं । एक एक्ट्यूएटेड सुई इनक्यूबेटेड और बंद अच्छी प्लेटों से कोशिकाओं के आयात और निर्यात के लिए अनुमति देता है। चिप क्षेत्र को सेलुलर फेनोटाइप या कार्यात्मक विश्लेषण की विशेषता के लिए ब्राइटफील्ड और फ्लोरोसेंट चैनलों (डीएपीआई, फिटसी, टेड, या Cy5 सहित) में 4x या 10x आवर्धन पर चित्रित किया जा सकता है। पूरी प्रणाली सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्वचालित है जिसका उपयोग प्रीडिजाइन किए गए वर्कफ़्लो या कस्टम प्रयोगों के लिए किया जा सकता है।
एचआईवी-1 संक्रमण और P2XR के बीच संबंधों का अध्ययन किया गया है, लेकिन समानांतर में इन बातचीत को सीधे चित्रित करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट प्रक्रिया की सूचना नहीं दी गई है । यहां, लेखकों को एक पद्धति का वर्णन करने के लिए तीव्र कैल्शियम बाढ़ और बाद में एचआईवी-1 एकल कोशिका के स्तर पर उत्पादक संक्रमण ट्रैकिंग के माध्यम से एचआईवी-P2XR बातचीत का अध्ययन । विशेष रूप से, यह एक उपन्यास उपकरण स्थापित करता है जो एकल कोशिकाओं में कई लक्ष्यों के प्रत्यक्ष, उच्च-थ्रूपुट, देशांतर माप की अनुमति देता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Beacon Optofluidic System</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FIJI</td>
			<td colspan="2">Open-source software</td>
			<td>PMID: 22743772, 22930834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluo-4 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;F10489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;HIV-1 NLCINL4-3</td>
			<td colspan="2">Laboratory of Benjamin Chen</td>
			<td>PMID: 28148796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td colspan="2">GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>&#160;SV30010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MT-4 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent</td>
			<td></td>
			<td>&#160;ARP-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OptoSelect 3500 chip</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Prism 9.0.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform

एचआईवी-1 एक पुराने संक्रमण का कारण बनता है जो दुनिया भर में 37 मिलियन से अधिक लोगों को प्रभावित करता है। मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) के साथ रहने वाले लोग एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी के बावजूद पुरानी सूजन से संबंधित कोमोर्बिडिटी का अनुभव करते हैं। हालांकि, इन भड़काऊ सिग्नलिंग को पूरी तरह से विशेषता नहीं दी गई है। सेलुलर सिग्नलिंग घटनाओं और डाउनस्ट्रीम जीन अभिव्यक्ति की सक्रियता पर प्रारंभिक प्रवेश घटनाओं की भूमिका एकल कोशिका स्तर पर कब्जा नहीं किया गया है । यहां लेखक एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जो लाइव-सेल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के सिद्धांतों को एक स्वचालित एकल-सेल प्लेटफॉर्म पर लागू करती है जो उपयोगकर्ता-अनुकूलित समय पाठ्यक्रमों पर संस्कृतियों और छवियों की कोशिकाओं को संसाधित करती है, जिससे गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति होती है। यह परख जल्दी घटनाओं की एकल कोशिका लाइव फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को ट्रैक कर सकती है जो तुरंत एचआईवी-1 संक्रमण का पालन करती है, विशेष रूप से कैल्शियम की आमद जो वायरस के संपर्क में आती है और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर वायरस का उपयोग करके उत्पादक संक्रमण के विकास के साथ होती है। एमटी-4 कोशिकाओं को कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई से भरा जाता है और एक नैनोफ्लुइडिक डिवाइस पर अलग कलम में सुसंस्कृत किया जाता है। सुसंस्कृत कोशिकाएं एचआईवी-1 रिपोर्टर वायरस (एचआईवी-1 एनएलसीआई) से संक्रमित होती हैं । नैनोफ्लुइडिक डिवाइस के ऊपर स्थित एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप तीव्र एचआईवी-1 एक्सपोजर के बाद 8-मिनट के समय पाठ्यक्रम पर कैल्शियम की आमद को मापता है। एचआईवी-1 उत्पादक संक्रमण एक 4 दिन के अंतराल पर उन ही कोशिकाओं में मापा जाता है । इन समय पाठ्यक्रमों से इमेजिंग डेटा वायरस-मेजबान रिसेप्टर इंटरैक्शन और सिग्नलिंग मार्ग गतिशीलता को परिभाषित करने के लिए विश्लेषण किया जाता है। लेखक एकल-सेल छंटाई, संस्कृति, इमेजिंग और सॉफ्टवेयर स्वचालन में सक्षम उपन्यास ऑप्टोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का उपयोग करके पारंपरिक इमेजिंग विधियों के लिए एक एकीकृत, स्केलेबल विकल्प प्रस्तुत करते हैं। यह परख विभिन्न परिस्थितियों में घटनाओं की गतिज को माप सकती है, जिसमें कोशिका प्रकार, एगोनिस्ट या विरोधी प्रभाव शामिल हैं, जबकि मापदंडों की एक सरणी को मापने के लिए। यह नैनोफ्लुइडिक हाई-थ्रूपुट देशांतर एकल-कोशिका संस्कृति और इमेजिंग के लिए पहली स्थापित विधि है: इस तकनीक को सेलुलर सिग्नलिंग काइनेटिक्स और गतिशील आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए मोटे तौर पर अनुकूलित किया जा सकता है।

चित्रा 1 फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के माध्यम से प्राप्त चिप और कच्चे इमेजिंग डेटा के प्रारूप को दिखाता है। रीचेरी माप के माध्यम से असंक्रमित और संक्रमित कोशिकाओं की पहचान और क्लस्टरिंग <strong cla...

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Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

यहां, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें एक नैनोफ्लुइडिक डिवाइस पर तीव्र घटनाओं और उत्पादक एचआईवी-1 संक्रमण के लिए एकल कोशिकाओं की निगरानी की जाती है। इमेजिंग डेटा वायरस-होस्ट रिसेप्टर इंटरैक्शन और सिग्नलिंग पाथवे डायनामिक्स को परिभाषित करता है। यह नैनोफ्लुइडिक हाई-थ्रूपुट देशांतर एकल-कोशिका संस्कृति और इमेजिंग के लिए सिग्नलिंग काइनेटिक्स और आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए पहली विधि है।

मल्टीपैमीटर ऑप्टोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का उपयोग करके कैल्शियम आई आमद और एचआईवी-1 संक्रमण का एकल-सेल लक्षण वर्णन

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

यह प्रोटोकॉल एकल-कोशिका स्तर पर वास्तविक समय की गतिज को कैप्चर कर सकता है। हम एचआईवी संक्रमण के जवाब में व्यक्तिगत सेल मापदंडों को माप सकते हैं और वायरल जीवनचक्र के विलंबित चरणों के साथ प्रारंभिक संकेत घटनाओं को संबद्ध कर सकते हैं। यह एकल सेल छंटाई, संस्कृति, इमेजिंग और सॉफ्टवेयर स्वचालन के लिए एक उपन्यास ऑप्टोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का उपयोग करके पारंपरिक इमेजिंग विधियों के लिए एक एकीकृत स्केलेबल विकल्प है।यह नैनोफ्लुइडिक, उच्च थ्रूपुट, देशांतर एकल-कोशिका संस्कृति और इमेजिंग के लिए पहली स्थापित विधि है। इस तकनीक को विभिन्न रोग राज्यों में सेलुलर सिग्नलिंग काइनेटिक्स और गतिशील आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए मोटे तौर पर अपनाया जा सकता है। इस विधि का दृश्य प्रदर्शन यह व्यक्त करने के लिए महत्वपूर्ण है कि प्रयोग कैसे स्थापित किया जाता है, कोशिकाओं को कैसे ऑप्टिकल रूप से कलम में हल किया जाता है, और चिप के माध्यम से इन्फ्यूजन कैसे स्थापित किया जाता है।शुरू करने के लिए, 100X केंद्रित डिटर्जेंट सॉल्वेंट के 25 माइक्रोलीटर और 1, 000X फ्लूओ-4 एएम के 2.5 माइक्रोलीटर को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़कर ताजा फ्लू-4 एएम लोडिंग समाधान तैयार करें, फिर मिश्रण करने के लिए भंवर। पाइपेट लोडिंग समाधान में संस्कृति मीडिया के 2.5 मिलीलीटर और मिश्रण करने के लिए उलटा। तीन मिनट के लिए ५०० बार जी पर दो लाख मीट्रिक टन-4 कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, तो मीडिया को हटाने और तैयार Fluo-4 AM लोडिंग समाधान के दो मिलीलीटर में गोली resuspend ।पिपेट ने कोशिकाओं को 35 मिलीमीटर पेट्री डिश में फिर से निलंबित कर दिया। 15 से 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, तो कमरे के तापमान पर एक अतिरिक्त 15 से 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट। सेल सस्पेंशन को सेंट्रलाइज ट्यूब में ट्रांसफर करें और कोशिकाओं को तीन मिनट के लिए 500 बार जी पर सेंट्रलाइज करें, फिर सुपरनेट निकालें।संस्कृति माध्यम के एक मिलीलीटर में पाइपिंग करके सेल पेलेट को फिर से खर्च करें और धोने के लिए तीन मिनट के लिए 500 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें। कम से कम 50 माइक्रोलीटर के लिए मिलीलीटर प्रति दो मिलियन कोशिकाओं की एकाग्रता पर संस्कृति माध्यम में पाइपिंग करके सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। गीला समाधान है, जो सेल पेनिंग की सुविधा के साथ एक चिप तैयार करने के लिए, गीला समाधान के दो मिलीलीटर और एक नई ऑप्टोफ्लैडिक चिप के साथ उपकरण पर deionized पानी के ५० मिलीलीटर युक्त अपकेंद्रित्र ट्यूब लोड और गीला चिप समारोह जो गीला समाधान के साथ चिप बाढ़ जाएगा चलाते हैं ।चिप को 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और चिप को तीन बार पानी से फ्लश करें। एक बार पानी फ्लशिंग किया जाता है, संस्कृति मीडिया के २५० माइक्रोलीटर के तीन चक्रों के साथ चिप फ्लश । चिप चैनलों से चिपके कोशिकाओं की संभावना को कम करने के लिए लोडिंग से पहले प्रति 100 भागों F127 डिटर्जेंट सॉल्यूट के साथ पिछले चरण से सेल निलंबन को पूरक करें।पांच माइक्रोलीटर सेल पैकेज वॉल्यूम के लिए लोड ऑपरेशन और छोटी मात्रा आयात के साथ 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब से कोशिकाओं को आयात करने के लिए साधन निर्यात सुई का उपयोग करें। ऑटो-पेन फ़ंक्शन का उपयोग करके एक अनुकूलित ऑप्टोइलेक्ट्रॉनिक पोजिशनिंग या 4.3 वोल्ट और पांच माइक्रोमीटर प्रति सेकंड पिंजरे की गति का उपयोग करके पेन कोशिकाएं, जो एकल कोशिकाओं का पता लगाएगी, उन्हें ओईपी पिंजरे से घेर लेगी, और उन्हें पास के पेन में ले जाएगी। यदि रुचि की कोशिकाएं ऑटो-पेनिंग का पालन करती रहती हैं, तो लक्ष्य कोशिकाओं और गंतव्य पेन का चयन करने के लिए मैनुअल पेन फ़ंक्शन का उपयोग करें।एक बार पेनिंग पूरा हो जाने के बाद, चिप से किसी भी शेष अपंजीकृत कोशिकाओं को साफ करने के लिए संस्कृति मीडिया के २५० माइक्रोलीटर के तीन चक्रों के साथ चिप को फ्लश करें । कोशिकाओं को लिखने के बाद, बेसलाइन फ्लोरो-4, रीचेरी और ऑटोफ्लोरेसेंस को मापने के लिए फिटसी, टेक्सास रेड और डीएपीआई चैनलों में कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियां प्राप्त करें। निर्यात सुई के माध्यम से चिप में निलंबन को धीरे-धीरे पाइपिंग करके एचआईवी-1 एनएलसीआई प्रति २,०,० कोशिकाओं के 13 नैनोग्राम की एकाग्रता पर माइक्रोचिप में एचआईवी-1 को संचार करें ।एचआईवी-1 के अलावा के तुरंत बाद, 10 मिनट के समय पाठ्यक्रम पर फिटसी और डीएपीआई चैनलों में बार-बार छवियां प्राप्त करें। एक, दो, तीन, और चार दिनों के बाद संक्रमण पर टेक्सास लाल और DAPI चैनलों में छवियों को प्राप्त करें । इस पद्धति का उपयोग रीचेरी माप के माध्यम से एचआईवी संक्रमित और असंक्रमित कोशिकाओं की पहचान और क्लस्टरिंग के लिए किया गया था।रीचेरी सिग्नल में बदलाव के साथ कोशिकाओं को क्रमशः 40, 000 से कम मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता को रीचेरी उच्च या रीचेरी कम आबादी में संकुलित किया गया था। इन समूहों को नौ मिनट के समय पाठ्यक्रम पर बार-बार फ्लोरो-4 फ्लोरेसेंस का उपयोग करके इंट्रासेलुलर कैल्शियम को मापने के द्वारा कैल्शियम आमद काइनेटिक्स के लिए विश्लेषण किया गया था, जिसने एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं में जल्दी कैल्शियम की आमद का प्रदर्शन किया था । कैल्शियम की आमद और रीचेरी फ्लोरेस के बीच एक महत्वपूर्ण सकारात्मक संबंध देखा गया।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, वायरस उत्पादन और संक्रमण दोनों के लिए घातीय विकास सीमा के भीतर कोशिकाओं के साथ शुरू करना याद रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि ऊंचा हो गया कोशिकाओं के परिणामस्वरूप इस परख से संकेत में नाटकीय कमी आएगी। एचआईवी-1 के साथ काम करना खतरनाक हो सकता है। इसलिए, पीएसएश ब्लडबोर्न रोगजनक मानक में दर्शाए गए बीएसएल-2 प्रथाओं को इस प्रक्रिया को करते समय हमेशा लिया जाना चाहिए।यह तकनीक रोमांचक है क्योंकि यह हमें नियंत्रित परिस्थितियों में एकल-सेल फेनोटाइपिक या ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों का अध्ययन करने की अनुमति देगा। इसमें कई कोशिका प्रकारों में आणविक मार्गों पर उत्तेजनाओं के प्रभाव को सहसंबंधित करने की व्यापक क्षमता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

एचआईवी -1 सकारात्मक कक्ष का उपयोग एक रेव निर्भर lentiviral वेक्टर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त की विशिष्ट चिह्नित

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3 के एचआईवी -1 tropism के genotypic निष्कर्ष का प्रयोग जनसंख्या आधारित अनुक्रमण

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

एचआईवी 1 अनुक्रम विश्लेषण द्वारा Coreceptor का उपयोग (tropism) की भविष्यवाणी एक genotypic दृष्टिकोण का उपयोग

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

एचआईवी-1 कोर की इन विट्रो Uncoating में

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

एकल कक्ष का विश्लेषण बेसिलस subtilis प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और फ्लो का उपयोग Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

एचआईवी -1 संक्रमित सीडी 4 की सहज सेंसिंग का आकलन<sup&gt; +</sup&gt; एक का उपयोग Plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं द्वारा टी कोशिकाओं<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; प्रणाली सह संस्कृति।

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

एक सेल आधारित एलिसा परख का उपयोग एचआईवी -1 trimeric लिफाफा glycoproteins के गठनात्मक मूल्यांकन

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

एचआईवी -1 सकारात्मक व्यक्तियों के प्लाज्मा से Exosomes का अलगाव

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

एचआईवी -1 चुप के दृश्य विशालकाय unilamellar पुटिका (GUV) झिल्ली के लिए बाइंडिंग

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

का नाप<em&gt; इन विट्रो</em&gt; एचआईवी -1 Preintegration परिसर की एकता गतिविधि

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...