Name: single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Siamo grati per le discussioni scientifiche con il dottor Benjamin Chen. Questo lavoro è stato finanziato da K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS e KB) e R21AI152833 (THS e KB).

1. Preparazione di cellule per l'imaging
<ol><li>Preparare la soluzione di carico Fluo-4 AM fresca: Aggiungere 25 μL di solvente detergente concentrato 100x, quindi aggiungere 2,5 μL di Fluo-4 AM 1000x a un tubo da 1,5 ml. Vortice da mescolare.</li>
	<li>Pipetta 2,5 mL di mezzi di coltura nella soluzione di carico e invertire la miscela. Proteggere dalla luce.</li>
	<li>Centrifuga 2 x 106 cellule MT-4 a 500 x g per 3 min.</li>
	<li>Rimuovere i mezzi e rimosogliere il pellet in 2 mL della soluzione...

<ol>
	<li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+inflammation,+and+HIV+infection.">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li><li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection.">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li><li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors:+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation.">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).</li><li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions.">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li><li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages.">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors.">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+(IL-10)+and+IL-1&#946;+in+a+human+tonsil+explant+model.">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1&#946; in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).</li><li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures.">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases.">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li><li>Chen, P., H&#252;bner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses.">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li><li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca(2+)-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomi&#263;, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels.">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li><li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs.">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).</li><li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity.">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010 (2018).</li><li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform.">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).</li><li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+cell+identification+and+sorting+(LACIS)+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device.">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41 (2018).</li><li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light.">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li><li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator.">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion.">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion.">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).</li></ol>

La metodologia descritta per studiare la relazione tra l'afflusso di calcio e l'infezione produttiva dell'HIV-1 in singole cellule può essere adattata per studiare la cinetica del calcio intracellulare in risposta ad altri agonisti o antagonisti di interesse. La preparazione delle celle per l'imaging è semplice, minimamente richiede molto tempo e i reagenti sono disponibili in comodi kit di produttori ampiamente utilizzati. La misurazione del calcio a base di Fluo-4 è ben descritta in letteratura e l'HIV-1 può essere...

L'infiammazione cronica è una delle principali cause di morbilità precoce associata all'HIV emortalità 1,2,3. Esistono diversi meccanismi in base ai quali l'HIV può attivare la segnalazione infiammatoria, e recenti prove suggeriscono un ruolo per i recettori P2X nell'ingresso dell'HIV che sono recettori del trifosfato di adenosina (ATP) che gatingcalcio 3,4,5,6,7,8,9,10. Il sottotipo P2X dei recettori purinergici (P2XR) può essere importante facilitatore di questa infiammazione. Tuttavia, i meccanismi molecolari delle interazioni HIV-P2XR sono in gran parte sconosciuti e possono avere un impatto sulle fasi del ciclo di vita virale dell'HIV-1 precoce e tardivo. Definire i percorsi e la cinetica che guidano l'infiammazione cronica associata all'HIV è fondamentale per far avanzare le opzioni di trattamento per le persone con HIV.
Per valutare se l'HIV-1 agonizza direttamente i recettori P2X, l'attivazione P2XR e l'infezione da HIV-1 devono essere misurate in parallelo. I test sull'attività P2XR e sull'infezione da HIV-1 sono stati stabiliti in modo indipendente: l'afflusso di calcio cellulare è un indicatore dell'attivazione P2XR e l'infezione produttiva dell'HIV-1 può essere quantificata dall'abbondanza di RNA. Il rilevamento della fluorescenza dell'afflusso di calcio è possibile con il colorante sensibile al calcio Fluo-4 e l'infezione da HIV-1 può essere visualizzato con il virus reporter fluorescente mCherry HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Poiché questi indicatori di attivazione P2X (afflusso acuto di calcio cellulare) e infezione da HIV-1 (sintesi dell'RNA HIV-1) si verificano su scale temporali diverse (minuti contro giorni), manca un metodo ad alta produttività che consenta un'analisi accoppiata dell'attivazione P2XR e dell'infezione da HIV-1. Le tecniche sperimentali standard ad alta produttività, come la citometria del flusso, consentono l'analisi della popolazione ma non possono valutare la relazione tra eventi acuti e longitudinali in singole cellule. In alternativa, l'imaging a cella singola con microscopia a fluorescenza standard è a bassa produttività. Questi limiti sperimentali presentano la necessità di nuove tecniche ad alta produttività per misurare direttamente le associazioni tra eventi cellulari acuti e longitudinali.
Un sistema optofluidico descritto è una nuova piattaforma in grado di smistamento e isolamento a cella singola, 15, imaging e automazione software16,17,18,19. Questo sistema presenta un'alternativa integrata ad alta produttività ai limiti dei metodi di imaging tradizionali. La piattaforma Beacon è costituita da un'anidride carbonica (CO2)e un incubatore a temperatura controllata che supporta le cellule contenute in un chip. Il chip possiede transistor fotosensibili che generano un gradiente elettrico in risposta alla luce mirata. Questa forza dielettroforetica risultante è usata per spostare singole cellule attraverso il chip nanofluidico nelle regioni desiderate. Le cellule sono ordinate in penne sul chip, che forniscono una barriera per isolare fisicamente le singole cellule. Il flusso laminare continuo dei mezzi di crescita in tutto il chip impedisce la migrazione cellulare dalle penne, consentendo al contempo la diffusione di piccole particelle di nutrienti e reagenti specifici dell'esperimento. Un microscopio a fluorescenza si trova sopra il chip. L'automazione del software viene utilizzata per acquisire immagini del chip nel punto di tempo specificato dall'utente.
Tutta la caratterizzazione delle celle è stata eseguita utilizzando un sistema optofluidico per la selezione e la manipolazione a cella singola. Questo sistema è costituito da componenti meccanici, microfluidici e ottici integrati che consentono la manipolazione, il dosaggio, la coltura e l'imaging a cella singola. Le cellule vengono caricate e coltivate sul dispositivo nanofluidico usa e getta costituito da 3.500 camere singole (penne), ognuna in grado di contenere volume sub-nanoliter. Le cellule possono essere posizionate all'interno di penne utilizzando "gabbie" dielettroforetiche indotte dalla luce e coltivate in condizioni controllate da temperatura e CO2. Le microfluidica consentono la perfusione di supporti o tamponi sul chip per la coltura cellulare o il trattamento farmacologico. Un ago azionato consente l'importazione e l'esportazione di cellule da piastre di pozzo incubate e tappate. L'area del chip può essere immagine con ingrandimento 4x o 10x in canali fluorescenti e a campo luminoso (inclusi DAPI, FITC, TRed o Cy5) per caratterizzare fenotipi cellulari o analisi funzionali. L'intero sistema è automatizzato utilizzando software che può essere utilizzato per flussi di lavoro predesignati o esperimenti personalizzati.
Sono state studiate le relazioni tra l'infezione da HIV-1 e la P2XR, ma non è stata riportata una procedura ad alta produttività per caratterizzare direttamente queste interazioni in parallelo. Qui, gli autori descrivono una metodologia per studiare le interazioni HIV-P2XR attraverso il monitoraggio dell'afflusso acuto di calcio e della successiva infezione produttiva dell'HIV-1 a livello di singola cellula. In particolare, questo stabilisce un nuovo strumento che consente la misurazione longitudinale diretta, ad alta produttività e longitudinale di più bersagli in singole celle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Beacon Optofluidic System</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FIJI</td>
			<td colspan="2">Open-source software</td>
			<td>PMID: 22743772, 22930834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluo-4 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;F10489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;HIV-1 NLCINL4-3</td>
			<td colspan="2">Laboratory of Benjamin Chen</td>
			<td>PMID: 28148796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td colspan="2">GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>&#160;SV30010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MT-4 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent</td>
			<td></td>
			<td>&#160;ARP-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OptoSelect 3500 chip</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Prism 9.0.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform

L'HIV-1 causa un'infezione cronica che colpisce più di 37 milioni di persone in tutto il mondo. Le persone che vivono con il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) sperimentano comorbilità correlata all'infiammazione cronica nonostante la terapia antiretrovirale. Tuttavia, questi segnali infiammatori non sono stati completamente caratterizzati. Il ruolo degli eventi di ingresso precoce sull'attivazione degli eventi di segnalazione cellulare e sull'espressione genica a valle non è stato catturato a livello di singola cellula. Qui gli autori descrivono un metodo che applica i principi della microscopia a fluorescenza a cellule vive a una piattaforma automatizzata a cella singola che colture e immagini le cellule rispetto ai corsi di tempo personalizzati dall'utente, consentendo l'analisi ad alta produttività dei processi cellulari dinamici. Questo saggio può tracciare la microscopia a fluorescenza viva a singola cellula dei primi eventi che seguono immediatamente l'infezione da HIV-1, in particolare l'afflusso di calcio che accompagna l'esposizione al virus e lo sviluppo di infezioni produttive utilizzando un virus reporter fluorescente. Le cellule MT-4 sono caricate con un colorante sensibile al calcio e coltivate in penne isolate su un dispositivo nanofluidico. Le cellule coltivate sono infettate da un virus reporter HIV-1 (HIV-1 NLCI). Un microscopio a fluorescenza posizionato sopra il dispositivo nanofluidico misura l'afflusso di calcio su un decorso di 8 minuti dopo l'esposizione acuta all'HIV-1. L'infezione produttiva dell'HIV-1 viene misurata in quelle stesse cellule per un intervallo di 4 giorni. I dati di imaging di questi corsi di tempo vengono analizzati per definire le interazioni del recettore virus-host e la dinamica del percorso di segnalazione. Gli autori presentano un'alternativa integrata e scalabile ai metodi di imaging tradizionali utilizzando una nuova piattaforma optofluidica in grado di smistamento, 1500, imaging e automazione del software a cella singola. Questo saggio può misurare la cinetica degli eventi in varie condizioni, tra cui il tipo di cellula, l'agonista o l'effetto antagonista, misurando al contempo una serie di parametri. Questo è il primo metodo stabilito per la coltura e l'imaging longitudinali a singola cellula ad alta produttività nanofluidica: questa tecnica può essere ampiamente adattata per studiare la cinetica di segnalazione cellulare e le interazioni molecolari dinamiche.

La figura 1 illustra il formato dei dati di imaging grezzo e del chip acquisiti attraverso il microscopio a fluorescenza. L'identificazione e il raggruppamento di cellule non infette e infette mediante misurazione mCherry sono mostrati nella figura 2. Questi ammassi vengono analizzati per la cinetica dell'afflusso di calcio nella figura 3, che dimostra l'afflusso precoce di calcio nelle cellule infettate dall'HIV. <strong class="xfi...

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Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

Qui, presentiamo un protocollo in cui le singole cellule vengono monitorate per eventi acuti e infezioni produttive da HIV-1 su un dispositivo nanofluidico. I dati di imaging definiscono le interazioni del recettore virus-host e la dinamica del percorso di segnalazione. Questo è il primo metodo per la coltura e l'imaging longitudinali a singola cellula ad alta produttività nanofluidica per studiare la cinetica segnalante e le interazioni molecolari.

Caratterizzazione a una cellula dell'afflusso di calcio e dell'infezione da HIV-1 utilizzando una piattaforma optofluidica multiparametro

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

Questo protocollo può acquisire cinetica in tempo reale a livello di singola cella. Possiamo misurare i singoli parametri cellulari in risposta all'infezione da HIV e associare eventi di segnalazione precoce a passaggi ritardati del ciclo di vita virale. Questa è un'alternativa scalabile integrata ai metodi di imaging tradizionali che utilizzano una nuova piattaforma optofluidica per lo smistamento, la ristrutturazione, l'imaging e l'automazione del software a cella singola.Questo è il primo metodo stabilito per la coltura e l'imaging nanofluidici, ad alta produttività e longitudinali a singola cellula. Questa tecnica può essere ampiamente adottata per studiare la cinetica del segnale cellulare e le interazioni molecolari dinamiche in una varietà di stati di malattia. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante per trasmettere come viene impostato l'esperimento, come le cellule vengono ordinate otticamente in penne e come impostare le infusioni attraverso il chip.Per iniziare, preparare una soluzione di carico Fluo-4 AM fresca aggiungendo 25 microlitri di solvente detergente concentrato 100X e 2,5 microlitri di 1.000X Fluo-4 AM a un tubo da 1,5 millilitri, quindi vortice da mescolare. Pipetta 2,5 millilitri di mezzi di coltura nella soluzione di carico e invertire la miscela. Centrifugare due milioni di cellule MT-4 a 500 volte G per tre minuti, quindi rimuovere il supporto e rimosogliere il pellet in due millilitri della soluzione di carico Fluo-4 AM preparata.Pipetta ha sospeso le cellule in una piastra di Petri di 35 millimetri. Incubare a 37 gradi Celsius per 15-30 minuti, quindi incubare per altri 15-30 minuti a temperatura ambiente. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga e centrifugare le cellule a 500 volte G per tre minuti, quindi rimuovere il supernatante.Rimorsi il pellet cellulare con pipettando in un millilitro del mezzo di coltura e centrifugando a 500 volte G per tre minuti per lavarlo. Rimorsiva il pellet cellulare con pipettando nel mezzo di coltura ad una concentrazione di due milioni di cellule per millilitro per almeno 50 microlitri. Per preparare un chip con la soluzione di bagnatura, che facilita la penning cellulare, caricare tubi di centrifuga contenenti due millilitri di soluzione bagnante e 50 millilitri di acqua deionizzata sullo strumento con un nuovo chip optofluidico ed eseguire la funzione del chip bagnato che inonderà il chip con la soluzione bagnante.Incubare il chip a 50 gradi Celsius e sciacquare il truciolo con acqua tre volte. Una volta fatto lo sciacquone dell'acqua, sciacquare il chip con tre cicli di 250 microlitri di mezzi di coltura. Integrare la sospensione cellulare del passaggio precedente con una per 100 parti di soluto detergente F127 prima del caricamento per ridurre la probabilità che le cellule si attacchino ai canali del chip.Utilizzare l'ago di esportazione dello strumento per importare celle da un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri con il funzionamento di carico e l'importazione di piccoli volumi per un volume di confezione di celle a cinque microlitri. Celle a penna che utilizzano un posizionamento optoelettronico ottimizzato o una tensione OEP di 4,3 volt e cinque micrometri al secondo di velocità della gabbia utilizzando la funzione auto-penna, che rileverà automaticamente singole celle, le circonderà con una gabbia OEP e le sposterà in una penna vicina. Se le celle di interesse rimangono dopo la scrittura automatica, utilizzare la funzione penna manuale per selezionare le celle di destinazione e una penna di destinazione.Una volta completato il penning, sciacquare il chip con tre cicli di 250 microlitri di mezzi di coltura per cancellare eventuali celle nonpennate rimanenti dal chip. Dopo aver scritto le celle, ottenere immagini fluorescenti di cellule nei canali FITC, Texas Red e DAPI per misurare la linea di base Fluo-4, mCherry e autofluorescenza. Infondere HIV-1 nel microchip ad una concentrazione di 13 nanogrammi di NLCI HIV-1 per due milioni di cellule intubando lentamente la sospensione nel chip attraverso l'ago da esportazione.Immediatamente dopo l'aggiunta di HIV-1, ottenere ripetutamente immagini nei canali FITC e DAPI in un corso di 10 minuti. Ottenere immagini nei canali Texas Red e DAPI a uno, due, tre e quattro giorni dopo l'infezione. Questa metodologia è stata utilizzata per l'identificazione e il raggruppamento di cellule infettate da HIV e non infette mediante misurazione mCherry.Le cellule con un cambiamento nel segnale mCherry maggiore o inferiore a 40.000 intensità fluorescente media sono state raggruppate rispettivamente nella bassa popolazione mCherry alta o mCherry. Questi cluster sono stati analizzati per la cinetica dell'afflusso di calcio misurando il calcio intracellulare usando ripetutamente la fluorescenza Fluo-4 in un corso di nove minuti, che ha dimostrato l'afflusso precoce di calcio nelle cellule infettate dall'HIV. È stata osservata una significativa correlazione positiva tra l'afflusso di calcio e la florescenza mCherry.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di iniziare con le cellule all'interno dell'intervallo di crescita esponenziale sia per la produzione di virus che per l'infezione perché le cellule invase si tradurranno in una drastica diminuzione del segnale da questo saggio. Lavorare con HIV-1 può essere pericoloso. Pertanto, le pratiche BSL-2 come indicato nello standard OSHA Bloodborne Pathogen devono sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.Questa tecnica è eccitante perché ci permetterà di studiare i cambiamenti fenotipico o trascrizionale a cella singola in condizioni controllate. Questo ha un ampio potenziale per correlare l'impatto degli stimoli sulle vie molecolari in molti tipi di cellule.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Pronostico di HIV-1 Uso corecettore (tropismo) mediante analisi della sequenza utilizzando un approccio genotipica

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In uncoating vitro di HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Valutare l&#39;innato rilevamento dell&#39;infezione da HIV-1 CD4 infetti<sup&gt; +</sup&gt; Cellule T dalle cellule dendritiche plasmacitoidi Utilizzando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema di co-coltura.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine ​​Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualizzazione del virus HIV-1 gag rilegatura a Giant unilamellari vescicole (GUV) Membrane

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Misurazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Integrazione di attività del virus HIV-1 preintegrazione Complessi

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...