Name: single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Vi er takknemlige for de vitenskapelige diskusjonene med Dr. Benjamin Chen. Dette arbeidet ble finansiert av K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS og KB) og R21AI152833 (THS og KB).

1. Forberedelse av celler for avbildning
<ol><li>Forbered fersk Fluo-4 AM lasteløsning: Tilsett 25 μL 100x konsentrert vaskemiddelløsningsmiddel, tilsett deretter 2,5 μL Fluo-4 AM 1000x til et 1,5 ml rør. Virvel å blande.</li>
	<li>Pipette 2,5 ml kulturmedier inn i lasteløsningen og inverter for å blande. Beskyttes mot lys.</li>
	<li>Sentrifuge 2 x 106 MT-4 celler ved 500 x g i 3 min.</li>
	<li>Fjern media og resuspend pellet i 2 ml av den tilberedte Fluo-4 AM lasteløsningen. Beskyttes mot ...

<ol>
	<li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+inflammation,+and+HIV+infection.">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li><li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection.">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li><li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors:+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation.">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).</li><li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions.">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li><li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages.">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors.">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+(IL-10)+and+IL-1&#946;+in+a+human+tonsil+explant+model.">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1&#946; in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).</li><li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures.">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases.">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li><li>Chen, P., H&#252;bner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses.">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li><li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca(2+)-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomi&#263;, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels.">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li><li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs.">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).</li><li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity.">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010 (2018).</li><li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform.">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).</li><li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+cell+identification+and+sorting+(LACIS)+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device.">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41 (2018).</li><li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light.">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li><li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator.">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion.">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion.">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).</li></ol>

Den beskrevne metodikken for å studere forholdet mellom kalsiumtilstrømning og HIV-1 produktiv infeksjon i enkeltceller kan tilpasses for å studere intracellulær kalsiumkinetikk som svar på andre agonister eller antagonister av interesse. Utarbeidelsen av celler for avbildning er enkel, minimalt tidkrevende, og reagenser er tilgjengelige i praktiske sett fra mye brukte produsenter. Fluo-4-basert kalsiummåling er godt beskrevet i litteraturen, og HIV-1 kan lett erstattes med andre virus eller forbindelser av interes...

Kronisk betennelse er en ledende årsak til HIV-assosierte tidlige sykeligheter ogdødelighet 1,2,3. Det finnes flere mekanismer der HIV kan aktivere inflammatorisk signalering, og nyere bevis tyder på en rolle for P2X-reseptorene i HIV-oppføring som er kalsium-gating adenosin triphosfat (ATP)reseptorer 3,4,5,6,7,8,9,10. P2X-undertypen av purinergiske reseptorer (P2XR) kan være viktige tilretteleggere for denne betennelsen. Imidlertid er de molekylære mekanismene for HIV-P2XR-interaksjoner i stor grad ukjente og kan påvirke tidlige og sene HIV-1 virale livssyklustrinn. Å definere veier og kinetikk som driver HIV-assosiert kronisk betennelse er avgjørende for å fremme behandlingstilbud for personer med HIV.
For å vurdere om HIV-1 direkte plager P2X-reseptorer, må P2XR-aktivering og HIV-1-infeksjon måles parallelt. Analyser av P2XR-aktivitet og HIV-1-infeksjon er uavhengig etablert: Cellulær kalsiumtilstrømning er en indikator på P2XR-aktivering, og HIV-1 produktiv infeksjon kan kvantifiseres av RNA-overflod. Fluorescensdeteksjon av kalsiumtilstrømning er mulig med Fluo-4 kalsiumsensitiv fargestoff, og HIV-1-infeksjon kan visualiseres med mCherry fluorescerende reportervirus HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Fordi disse indikatorene for P2X-aktivering (akutt cellulær kalsiumtilstrømning) og HIV-1-infeksjon (HIV-1 RNA-syntese) forekommer på forskjellige tidsskalaer (minutter kontra dager), mangler det en høy gjennomstrømningsmetode som muliggjør sammenkoblet analyse av P2XR-aktivering og HIV-1-infeksjon. Standard eksperimentelle teknikker med høy gjennomstrømning, for eksempel strømningscytometri, tillater populasjonsanalysen, men kan ikke vurdere forholdet mellom akutte og langsgående hendelser i enkeltceller. Alternativt er encellet avbildning med standard fluorescensmikroskopi lav gjennomstrømning. Disse eksperimentelle begrensningene gir et behov for nye teknikker med høy gjennomstrømning for å måle assosiasjoner mellom akutte og langsgående cellulære hendelser direkte.
Et optofluidisk system som beskrives er en ny plattform som kan sortere og isolere enkeltceller, kultivering, bildebehandling og programvareautomatisering16,17,18,19. Dette systemet presenterer et integrert, høygjennomstrømningsalternativ til begrensningene ved tradisjonelle avbildningsmetoder. Beacon-plattformen består av et karbondioksid (CO2) og temperaturkontrollert inkubator som støtter celler som finnes på en brikke. Brikken har lysfølsomme transistorer som genererer en elektrisk gradient som svar på målrettet lys. Denne resulterende dielektrophoretiske kraften brukes til å flytte individuelle celler over nanofluidisk chip til de ønskede områdene. Celler sorteres i penner på brikken, noe som gir en barriere for å isolere individuelle celler fysisk. Kontinuerlig laminær strøm av vekstmedier gjennom hele brikken forhindrer cellemigrering fra pennene samtidig som det muliggjør småpartikkeldiffusjon av næringsstoffer og eksperimentspesifikke reagenser. Et fluorescensmikroskop sitter over brikken. Programvareautomatisering brukes til å ta bilder av brikken på det brukerangitte tidspunktet.
All cellekarakterisering ble utført ved hjelp av et optofluidisk system for enkeltcellet utvalg og manipulering. Dette systemet består av integrerte mekaniske, mikrofluidiske og optiske komponenter som muliggjør encellet manipulering, analyse, kultur og avbildning. Celler lastes og dyrkes på den engangs nanofluidiske enheten som består av 3500 individuelle kamre (penner), som hver er i stand til å holde sub-nanolitervolum. Celler kan plasseres i penner ved hjelp av lysinduserte dielektrophoretiske "bur" og dyrkes under temperatur- og CO2-kontrollerteforhold. Mikrofluidene tillater perfusjon av medier eller buffere på brikken for cellekultur eller narkotikabehandling. En aktivert nål gjør det mulig å importere og eksportere celler fra inkuberte og lukkede brønnplater. Sponområdet kan avbildes ved 4x eller 10x forstørrelse i brightfield og fluorescerende kanaler (inkludert DAPI, FITC, TRed eller Cy5) for å karakterisere cellulære fenotyper eller funksjonell analyse. Hele systemet automatiseres ved hjelp av programvare som kan brukes til forhåndsutformede arbeidsflyter eller egendefinerte eksperimenter.
Sammenhenger mellom HIV-1-infeksjon og P2XR er studert, men det er ikke rapportert en høy gjennomstrømningsprosedyre for å direkte karakterisere disse interaksjonene parallelt. Her beskriver forfatterne en metodikk for å studere HIV-P2XR-interaksjoner gjennom sporing av akutt kalsiumtilstrømning og påfølgende HIV-1-produktiv infeksjon på encellet nivå. Spesielt etablerer dette et nytt verktøy som muliggjør direkte, høy gjennomstrømning, langsgående måling av flere mål i enkeltceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Beacon Optofluidic System</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FIJI</td>
			<td colspan="2">Open-source software</td>
			<td>PMID: 22743772, 22930834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluo-4 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;F10489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;HIV-1 NLCINL4-3</td>
			<td colspan="2">Laboratory of Benjamin Chen</td>
			<td>PMID: 28148796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td colspan="2">GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>&#160;SV30010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MT-4 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent</td>
			<td></td>
			<td>&#160;ARP-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OptoSelect 3500 chip</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Prism 9.0.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform

HIV-1 forårsaker en kronisk infeksjon som rammer mer enn 37 millioner mennesker over hele verden. Personer som lever med humant immunsviktvirus (HIV) opplever komorbiditet relatert til kronisk betennelse til tross for antiretroviral behandling. Imidlertid har disse inflammatoriske signalene ikke blitt fullstendig karakterisert. Rollen til tidlige inngangshendelser om aktivering av cellulære signalhendelser og nedstrøms genuttrykk er ikke fanget opp på encellet nivå. Her beskriver forfatterne en metode som anvender prinsipper for levende celle fluorescensmikroskopi til en automatisert encellet plattform som kulturer og bildeceller over brukertilpassede tidskurs, noe som muliggjør høy gjennomstrømningsanalyse av dynamiske cellulære prosesser. Denne analysen kan spore encellet levende fluorescensmikroskopi av tidlige hendelser som umiddelbart følger HIV-1-infeksjon, spesielt tilstrømningen av kalsium som følger med eksponering for viruset og utvikling av produktiv infeksjon ved hjelp av et fluorescerende reportervirus. MT-4 celler er lastet med kalsiumfølsomt fargestoff og dyrket i isolerte penner på en nanofluidisk enhet. De kultiverte cellene er infisert med et HIV-1-reportervirus (HIV-1 NLCI). Et fluorescensmikroskop plassert over nanofluidisk enhet måler kalsiumtilstrømning over et 8-minutters tidsforløp etter akutt HIV-1-eksponering. HIV-1 produktiv infeksjon måles i de samme cellene over et 4-dagers intervall. Bildedata fra disse tidskursene analyseres for å definere interaksjoner mellom virusvertsreseptorer og signalveidynamikk. Forfatterne presenterer et integrert, skalerbart alternativ til tradisjonelle bildemetoder ved hjelp av en ny optofluidisk plattform som er i stand til encellet sortering, kulturing, avbildning og programvareautomatisering. Denne analysen kan måle kinetikken til hendelser under ulike forhold, inkludert celletype, agonist eller antagonistisk effekt, mens du måler en rekke parametere. Dette er den første etablerte metoden for nanofluidisk høygjennomstrømning langsgående encellet kultur og avbildning: Denne teknikken kan tilpasses bredt for å studere cellulær signaleringskinetikk og dynamiske molekylære interaksjoner.

Figur 1 illustrerer formatet på brikken og råavbildningsdata som er samlet inn gjennom fluorescensmikroskopet. Identifisering og klyngering av uinfiserte og infiserte celler via mCherry-måling vises i figur 2. Disse klyngene analyseres for kalsiumtilstrømningskinetikk i figur 3, som viser tidlig kalsiumtilstrømning i HIV-infiserte celler. Figur 4 viser en signifikant positiv sammenheng mellom kalsi...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

Her presenterer vi en protokoll der enkeltceller overvåkes for akutte hendelser og produktiv HIV-1-infeksjon på en nanofluidisk enhet. Bildedata definerer interaksjoner mellom virusvertsreseptorer og signalveidynamikk. Dette er den første metoden for nanofluidisk høygjennomstrømning langsgående encellet kultur og avbildning for å studere signalkinetikk og molekylære interaksjoner.

Encellet karakterisering av kalsiumtilstrømning og HIV-1-infeksjon ved hjelp av en multiparameter optofluidisk plattform

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

Denne protokollen kan fange opp kinetikk i sanntid på et enkeltcellenivå. Vi kan måle individuelle celleparametere som svar på HIV-infeksjon og assosiere tidlige signalhendelser med forsinkede trinn i viruslivssyklusen. Dette er et integrert skalerbart alternativ til tradisjonelle avbildningsmetoder ved hjelp av en ny optofluidisk plattform for sortering, dyrking, avbildning og programvareautomatisering.Dette er den første etablerte metoden for nanofluidisk, høy gjennomstrømning, langsgående encellet kultur og avbildning. Denne teknikken kan i stor grad vedtas for å studere cellulær signaleringskinetikk og dynamiske molekylære interaksjoner i en rekke sykdomstilstander. Visuell demonstrasjon av denne metoden er viktig for å formidle hvordan eksperimentet er satt opp, hvordan celler er optisk sortert i penner, og hvordan du setter opp infusjoner gjennom brikken.Til å begynne med, lag fersk Fluo-4 AM lasteløsning ved å tilsette 25 mikroliter 100X konsentrert vaskemiddelløsningsmiddel og 2,5 mikroliter 1000X Fluo-4 AM til et 1,5 milliliterrør, deretter virvel å blande. Pipette 2,5 milliliter kulturmedier inn i lasteløsningen og invertere for å blande. Sentrifuger to millioner MT-4-celler ved 500 ganger G i tre minutter, fjern deretter media og resuspend pellet i to milliliter av den tilberedte Fluo-4 AM lasteløsningen.Pipette re-suspendert celler i en 35 millimeter Petri tallerken. Inkuber ved 37 grader Celsius i 15 til 30 minutter, og inkuber deretter i ytterligere 15 til 30 minutter ved romtemperatur. Overfør cellefjæringen til et sentrifugerør og sentrifuger cellene ved 500 ganger G i tre minutter, og fjern deretter supernatanten.Resuspend cellepellet ved pipettering i en milliliter av kulturmediet og sentrifuger på 500 ganger G i tre minutter å vaske. Resuspend cellepellet ved pipettering i kulturmediet i en konsentrasjon på to millioner celler per milliliter for minst 50 mikroliter. For å forberede en chip med fuktløsningen, som letter cellemerking, last sentrifugerør som inneholder to milliliter fuktløsning og 50 milliliter deionisert vann på instrumentet med en ny optofluidisk chip og kjør våtbrikkefunksjonen som vil oversvømme brikken med fuktløsningen.Inkuber brikken ved 50 grader Celsius og skyll brikken med vann tre ganger. Når vannspylingen er ferdig, skyll brikken med tre sykluser med 250 mikroliter kulturmedier. Suppler cellefjæringen fra forrige trinn med en per 100 deler F127 vaskemiddelløsning før lasting for å redusere sannsynligheten for at celler stikker til sponkanalene.Bruk instrumenteksportnålen til å importere celler fra et sentrifugerør på 1,5 milliliter med lastoperasjon og lite volumimport for et fem mikrolitercellepakkevolum. Pennceller som bruker en optimalisert optoelektronisk posisjonering eller OEP-spenning på 4,3 volt og fem mikrometer per sekund burhastighet ved hjelp av autopennfunksjonen, som automatisk vil oppdage enkeltceller, omgi dem med et OEP-bur og flytte dem inn i en nærliggende penn. Hvis det gjenstår celler av interesse etter automatisk penning, bruker du den manuelle pennfunksjonen til å velge målceller og en målpenn.Når penningen er fullført, skyll brikken med tre sykluser på 250 mikroliter kulturmedier for å fjerne eventuelle gjenværende upennede celler fra brikken. Etter å ha skrevet celler, få fluorescerende bilder av celler i FITC, Texas Red og DAPI kanaler for å måle baseline Fluo-4, mCherry, og autofluorescence. Tilsett HIV-1 i mikrochipen i en konsentrasjon på 13 nanogram HIV-1 NLCI per to millioner celler ved å sakte pipetter suspensjonen inn i brikken gjennom eksportnålen.Umiddelbart etter HIV-1-tillegg, få gjentatte ganger bilder i FITC- og DAPI-kanalene over et 10-minutters tidskurs. Få bilder i Texas Red- og DAPI-kanalene på en, to, tre og fire dager etter infeksjon. Denne metoden ble brukt til identifisering og klynge av HIV-infiserte og uinfiserte celler via mCherry-måling.Celler med en endring i mCherry signal større eller lavere enn 40,000 gjennomsnittlig fluorescerende intensitet ble gruppert i henholdsvis mCherry høy eller mCherry lav populasjon. Disse klyngene ble analysert for kalsiumtilstrømningskinetikk ved å måle intracellulært kalsium ved hjelp av Fluo-4 fluorescens gjentatte ganger over et ni minutters tidsforløp, som viste tidlig kalsiumtilstrømning i HIV-infiserte celler. En signifikant positiv sammenheng mellom kalsiumtilstrømning og mCherry florescens ble observert.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å starte med cellene i eksponentiell vekstområde for både virusproduksjon og infeksjon fordi overgrodde celler vil resultere i en dramatisk reduksjon i signalet fra denne analysen. Det kan være farlig å jobbe med HIV-1. Derfor bør BSL-2 praksis som angitt i OSHA Bloodborne Pathogen Standard alltid tas mens du utfører denne prosedyren.Denne teknikken er spennende fordi den vil tillate oss å studere encellede fenotypiske eller transkripsjonelle endringer under kontrollerte forhold. Dette har et bredt potensial for å korrelere virkningen av stimuli på molekylære veier i mange celletyper.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating av HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-celle Analyse av Bacillus subtilis Biofilm Bruke fluorescensmikroskopi og flowcytometrisystemer

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdere Medfødt Sensing av HIV-1 infiserte CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved Plasmacytoid dendrittiske celler ved hjelp av en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Conformational Evaluering av HIV-1 Trimeric kappeglykoproteiner Ved hjelp av en Cell-basert ELISA-analysen

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolering av Exosomes fra Plasma av HIV-1 Positive Personer

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualisering av HIV-1 Gag Binding til Giant unilamelære vesikkel (GUV) Membraner

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

måling av<em&gt; In Vitro</em&gt; Integrering Aktivitet av HIV-1 Preintegration Komplekser

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...