Name: single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Somos gratos pelas discussões científicas com o Dr. Benjamin Chen. Este trabalho foi financiado por K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS e KB) e R21AI152833 (THS e KB).

1. Preparação de células para imagem
<ol><li>Prepare a solução de carregamento Fluo-4 AM fresca: Adicione 25 μL de solvente concentrado de detergente de 100x e adicione 2,5 μL de Fluo-4 AM 1000x a um tubo de 1,5 mL. Vórtice para misturar.</li>
	<li>Pipeta 2,5 mL de mídia cultural na solução de carregamento e inverter para misturar. Proteja-se contra a luz.</li>
	<li>Centrífuga 2 x 106 células MT-4 a 500 x g por 3 min.</li>
	<li>Remova a mídia e resuspense a pelota em 2 mL da solução ...

<ol>
	<li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+inflammation,+and+HIV+infection.">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li><li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection.">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li><li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors:+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation.">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).</li><li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions.">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li><li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages.">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors.">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+(IL-10)+and+IL-1&#946;+in+a+human+tonsil+explant+model.">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1&#946; in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).</li><li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures.">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases.">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li><li>Chen, P., H&#252;bner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses.">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li><li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca(2+)-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomi&#263;, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels.">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li><li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs.">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).</li><li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity.">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010 (2018).</li><li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform.">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).</li><li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+cell+identification+and+sorting+(LACIS)+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device.">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41 (2018).</li><li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light.">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li><li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator.">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion.">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion.">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).</li></ol>

A metodologia descrita para estudar a relação entre o fluxo de cálcio e a infecção produtiva pelo HIV-1 em células únicas pode ser adaptada para estudar cinética de cálcio intracelular em resposta a outros agonistas ou antagonistas de interesse. A preparação de células para imagens é simples, minimamente intensiva em tempo, e os reagentes estão disponíveis em kits convenientes de fabricantes amplamente utilizados. A medição de cálcio à base de fluo-4 é bem descrita na literatura, e o HIV-1 pode ser fa...

A inflamação crônica é uma das principais causas de morbidades precoces associadas ao HIV e mortalidade1,2,3. Existem múltiplos mecanismos pelos quais o HIV pode ativar a sinalização inflamatória, e evidências recentes sugerem um papel para os receptores P2X na entrada do HIV que são receptores de adenosina triptosfato de adenosina (ATP) de cálcio3,4,5,6,7,8,9,10. O subtipo P2X de receptores purinérgicos (P2XR) pode ser importante facilitador desta inflamação. No entanto, os mecanismos moleculares das interações HIV-P2XR são amplamente desconhecidos e podem impactar as etapas do ciclo de vida viral do HIV-1. Definir os caminhos e cinéticas que conduzem a inflamação crônica associada ao HIV é fundamental para o avanço das opções de tratamento para pessoas com HIV.
Para avaliar se o HIV-1 agoniza diretamente os receptores P2X, a ativação P2XR e a infecção pelo HIV-1 devem ser medidos em paralelo. Ensaios da atividade P2XR e infecção pelo HIV-1 foram estabelecidos de forma independente: o fluxo de cálcio celular é um indicador da ativação P2XR, e a infecção produtiva pelo HIV-1 pode ser quantificada pela abundância de RNA. A detecção de fluorescência do fluxo de cálcio é possível com o corante sensível ao cálcio Fluo-4, e a infecção pelo HIV-1 pode ser visualizada com o vírus mCherry fluorescente HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Como esses indicadores de ativação P2X (fluxo de cálcio celular agudo) e infecção pelo HIV-1 (síntese de RNA HIV-1) ocorrem em diferentes escalas de tempo (minutos versus dias), falta um método de alta produtividade que permita a análise emparelhada da ativação P2XR e da infecção pelo HIV-1. Técnicas experimentais padrão de alto rendimento, como a citometria de fluxo, permitem a análise populacional, mas não podem avaliar a relação entre eventos agudos e longitudinais em células únicas. Alternativamente, a imagem unicelular com microscopia de fluorescência padrão é de baixa produtividade. Essas limitações experimentais apresentam a necessidade de novas técnicas de alta produtividade para medir associações entre eventos celulares agudos e longitudinais diretamente.
Um sistema optofluido descrito é uma nova plataforma capaz de triagem e isolamento unicelulares, culminando, imagem e automação de software16,17,18,19. Este sistema apresenta uma alternativa integrada e de alto rendimento às limitações dos métodos tradicionais de imagem. A plataforma Beacon consiste em um dióxido de carbono (CO2) e uma incubadora controlada pela temperatura que suporta células contidas em um chip. O chip possui transistores fotosensíveis que geram um gradiente elétrico em resposta à luz direcionada. Esta força dielectrophoretic resultante é usada para mover células individuais através do chip nanofluido para as regiões desejadas. As células são classificadas em canetas no chip, que fornecem uma barreira para isolar células individuais fisicamente. O fluxo contínuo de mídia de crescimento em todo o chip impede a migração celular das canetas, permitindo a difusão de pequenas partículas de nutrientes e reagentes específicos do experimento. Um microscópio de fluorescência fica acima do chip. A automação de software é usada para capturar imagens do chip no ponto de tempo especificado pelo usuário.
Toda a caracterização celular foi realizada utilizando-se um sistema optofluido para seleção e manipulação de células únicas. Este sistema consiste em componentes mecânicos, microfluidos e ópticos integrados que permitem manipulação de células únicas, ensaio, cultura e imagem. As células são carregadas e cultivadas no dispositivo nanofluido descartável composto por 3.500 câmaras individuais (canetas), cada uma capaz de segurar volume sub-nanolílito. As células podem ser posicionadas dentro de canetas usando "gaiolas" dielectrophoretic induzidas pela luz e cultivadas sob condições controladas por temperatura e CO2. Os microfluidos permitem a perfusão de mídia ou buffers no chip para cultura celular ou tratamento medicamentoso. Uma agulha acionada permite a importação e exportação de células de placas de poços incubadas e fechadas. A área do chip pode ser visualizada em ampliação de 4x ou 10x em canais brightfield e fluorescentes (incluindo DAPI, FITC, TRed ou Cy5) para caracterizar fenótipos celulares ou análise funcional. Todo o sistema é automatizado usando software que pode ser usado para fluxos de trabalho pré-projetados ou experimentos personalizados.
Foram estudadas relações entre a infecção pelo HIV-1 e o P2XR, mas não foi relatado um procedimento de alto rendimento para caracterizar diretamente essas interações em paralelo. Aqui, os autores descrevem uma metodologia para estudar as interações HIV-P2XR através do rastreamento do fluxo agudo de cálcio e da infecção produtiva subsequente do HIV-1 no nível unicelular. Notavelmente, isso estabelece uma nova ferramenta que permite a medição direta, de alto rendimento e longitudinal de múltiplos alvos em células únicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Beacon Optofluidic System</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FIJI</td>
			<td colspan="2">Open-source software</td>
			<td>PMID: 22743772, 22930834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluo-4 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;F10489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;HIV-1 NLCINL4-3</td>
			<td colspan="2">Laboratory of Benjamin Chen</td>
			<td>PMID: 28148796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td colspan="2">GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>&#160;SV30010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MT-4 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent</td>
			<td></td>
			<td>&#160;ARP-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OptoSelect 3500 chip</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Prism 9.0.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform

O HIV-1 causa uma infecção crônica que afeta mais de 37 milhões de pessoas em todo o mundo. Pessoas vivendo com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) experimentam comorbidade relacionada à inflamação crônica, apesar da terapia antirretroviral. No entanto, essas sinalizações inflamatórias não foram totalmente caracterizadas. O papel dos eventos de entrada precoce na ativação de eventos de sinalização celular e expressão genética a jusante não foi capturado no nível de célula única. Aqui, os autores descrevem um método que aplica princípios da microscopia de fluorescência de células vivas a uma plataforma automatizada de células únicas que culturas e células de imagens ao longo de cursos de tempo personalizados pelo usuário, permitindo a análise de alto rendimento de processos celulares dinâmicos. Este ensaio pode rastrear a microscopia de fluorescência ao vivo unicelular de eventos precoces que seguem imediatamente a infecção pelo HIV-1, notadamente o fluxo de cálcio que acompanha a exposição ao vírus e o desenvolvimento de infecção produtiva usando um vírus repórter fluorescente. As células MT-4 são carregadas com um corante sensível ao cálcio e cultivadas em canetas isoladas em um dispositivo nanofluido. As células cultivadas estão infectadas com um vírus repórter HIV-1 (HIV-1 NLCI). Um microscópio de fluorescência posicionado acima do dispositivo nanofluido mede o fluxo de cálcio ao longo de um curso de tempo de 8 minutos após a exposição aguda ao HIV-1. A infecção produtiva do HIV-1 é medida nessas mesmas células durante um intervalo de 4 dias. Os dados de imagem desses cursos de tempo são analisados para definir interações receptoras de receptores de vírus e dinâmicas de caminhos de sinalização. Os autores apresentam uma alternativa integrada e escalável aos métodos tradicionais de imagem usando uma nova plataforma optofluidic capaz de classificação unicelular, cultivo, imagem e automação de software. Este ensaio pode medir a cinética dos eventos em várias condições, incluindo tipo de célula, efeito agonista ou antagonista, enquanto mede uma série de parâmetros. Este é o primeiro método estabelecido para a cultura e imagem longitudinal de alta produtividade de alta throughput: Esta técnica pode ser amplamente adaptada para estudar cinética de sinalização celular e interações moleculares dinâmicas.

A Figura 1 ilustra o formato do chip e dados de imagem bruta adquiridos através do microscópio de fluorescência. A identificação e agrupamento de células não infectadas e infectadas através da medição mCherry são mostradas na Figura 2. Esses aglomerados são analisados para cinética de influxo de cálcio na Figura 3,o que demonstra o fluxo precoce de cálcio em células infectadas pelo HIV. A Figura ...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

Aqui, apresentamos um protocolo no qual células únicas são monitoradas para eventos agudos e infecção produtiva pelo HIV-1 em um dispositivo nanofluido. Os dados de imagem definem interações entre receptores de receptores de vírus e dinâmicas de caminhos de sinalização. Este é o primeiro método para a cultura e imagem longitudinal de alta produtividade para estudar a cinética e as interações moleculares.

Caracterização unicelular de influxo de cálcio e infecção pelo HIV-1 usando uma plataforma optofluidica multiparmétrica

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

Este protocolo pode capturar cinética em tempo real em um nível de célula única. Podemos medir parâmetros celulares individuais em resposta à infecção pelo HIV e associar eventos de sinalização precoce com etapas atrasadas do ciclo de vida viral. Esta é uma alternativa escalável integrada aos métodos tradicionais de imagem usando uma nova plataforma optofluidic para classificação de células únicas, cultivo, imagem e automação de software.Este é o primeiro método estabelecido para cultura e imagem de células únicas nanofluidas, de alta produtividade e longitudinais. Essa técnica pode ser amplamente adotada para estudar cinética de sinalização celular e interações moleculares dinâmicas em uma variedade de estados da doença. A demonstração visual deste método é importante para transmitir como o experimento é configurado, como as células são classificadas opticamente em canetas e como configurar infusões através do chip.Para começar, prepare a solução de carregamento Fluo-4 AM fresca adicionando 25 microliters de solvente concentrado de detergente 100X e 2,5 microliters de 1.000X Fluo-4 AM a um tubo de 1,5 mililitro, depois vórtice de tex para misturar. Pipeta 2,5 mililitros de mídia cultural na solução de carregamento e inverter para misturar. Centrifugar dois milhões de células MT-4 a 500 vezes G por três minutos, depois remover a mídia e resuspensar a pelota em dois mililitros da solução de carregamento Fluo-4 AM preparada.Células suspensas de pipeta em uma placa de Petri de 35 milímetros. Incubar a 37 graus Celsius por 15 a 30 minutos e incubar por mais 15 a 30 minutos à temperatura ambiente. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga e centrífuga as células a 500 vezes G por três minutos, em seguida, remova o supernatante.Resuspengue a pelota celular pipetando em um mililitro do meio cultural e centrífuga a 500 vezes G durante três minutos para lavar. Resuspend a pelota celular por pipetação no meio da cultura a uma concentração de dois milhões de células por mililitro para pelo menos 50 microlitres. Para preparar um chip com a solução de molhar, que facilita a escrita celular, carregue tubos de centrífugas contendo dois mililitros de solução de molhar e 50 mililitros de água desionizada no instrumento com um novo chip optofluido e execute a função de chip molhado que inundará o chip com a solução de molhar.Incubar o chip a 50 graus Celsius e lavar o chip com água três vezes. Uma vez feito o flushing de água, lave o chip com três ciclos de 250 microliters de mídia cultural. Suplemente a suspensão celular da etapa anterior com uma por 100 partes de detergente F127 soluto antes do carregamento para reduzir a probabilidade de as células grudando nos canais do chip.Use a agulha de exportação de instrumentos para importar células de um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro com a operação de carga e importação de pequeno volume para um volume de embalagem de cinco microliter. Células de caneta usando um posicionamento optoeletrônico otimizado ou tensão OEP de 4,3 volts e cinco micrômetros por segunda velocidade de gaiola usando a função auto-caneta, que irá detectar automaticamente células únicas, cercá-las com uma gaiola OEP, e movê-las para uma caneta próxima. Se as células de interesse permanecerem após a escrita automática, use a função de caneta manual para selecionar células-alvo e uma caneta de destino.Uma vez que a escrita esteja completa, lave o chip com três ciclos de 250 microliters de mídia cultural para limpar quaisquer células não gastas restantes do chip. Após a escrita de células, obtenha imagens fluorescentes de células nos canais FITC, Texas Red e DAPI para medir a linha de base Fluo-4, mCherry e autofluorescência. Infundir HIV-1 no microchip a uma concentração de 13 nanogramas de HIV-1 NLCI por dois milhões de células, canalizar lentamente a suspensão para dentro do chip através da agulha de exportação.Imediatamente após a adição do HIV-1, obtenha repetidamente imagens nos canais FITC e DAPI ao longo de um curso de tempo de 10 minutos. Obtenha imagens nos canais Texas Red e DAPI em um, dois, três e quatro dias após a infecção. Essa metodologia foi utilizada para identificação e agrupamento de células infectadas pelo HIV e não infectadas por meio da medição do mCherry.Células com uma mudança no sinal mCherry maior ou menor que 40.000 intensidade fluorescente média foram agrupadas na alta mCherry ou mCherry baixa população, respectivamente. Esses aglomerados foram analisados para cinética de influxo de cálcio medindo cálcio intracelular usando fluorescência Fluo-4 repetidamente durante um curso de nove minutos, o que demonstrou o fluxo precoce de cálcio em células infectadas pelo HIV. Observou-se correlação positiva significativa entre o influxo de cálcio e a florescência mCherry.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de começar com as células dentro da faixa de crescimento exponencial tanto para a produção de vírus quanto para a infecção, porque as células supercultivadas resultarão em uma redução drástica do sinal a partir deste ensaio. Trabalhar com HIV-1 pode ser perigoso. Portanto, as práticas BSL-2, conforme indicado no OSHA Bloodborne Pathogen Standard, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.Esta técnica é excitante porque nos permitirá estudar alterações fenotípicas ou transcritórias de células únicas em condições controladas. Isso tem amplo potencial para correlacionar o impacto dos estímulos nas vias moleculares em muitos tipos de células.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Marcação específica de HIV-1 células positivas utilizando um Vector Rev-dependente Lentivirus Expressando a Proteína Verde Fluorescente

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Imunologia e Infecção

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Previsão do HIV-1 de uso co-receptor (tropismo) por análise de seqüência usando uma abordagem genotípica

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Análise de uma única célula de Bacillus subtilis Os biofilmes utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolamento de exossomas a partir do plasma de indivíduos HIV-1 positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualização de HIV-1 Gag vinculação a gigante Unilamelares vesículas (GUV) Membranas

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Medição de<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...