Name: single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Мы благодарны за научные дискуссии с доктором Бенджамином Ченом. Эта работа финансировалась K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS и KB) и R21AI152833 (THS и KB).

1. Подготовка клеток к визуализации
<ol><li>Приготовьте свежий загрузочный раствор Fluo-4 AM: Добавьте 25 мкл 100x концентрированного моющего растворителя, затем добавьте 2,5 мкл Fluo-4 AM 1000x в трубку 1,5 мл. Вихрь для смешивания.</li>
	<li>Пипетка 2,5 мл питательной среды в загрузочный раствор и инвертирует?...

<ol>
	<li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+inflammation,+and+HIV+infection.">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li><li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection.">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li><li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors:+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation.">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).</li><li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions.">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li><li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages.">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors.">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+(IL-10)+and+IL-1&#946;+in+a+human+tonsil+explant+model.">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1&#946; in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).</li><li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures.">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases.">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li><li>Chen, P., H&#252;bner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses.">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li><li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca(2+)-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomi&#263;, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels.">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li><li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs.">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).</li><li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity.">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010 (2018).</li><li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform.">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).</li><li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+cell+identification+and+sorting+(LACIS)+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device.">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41 (2018).</li><li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light.">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li><li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator.">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion.">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion.">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).</li></ol>

Описанная методика изучения взаимосвязи между притоком кальция и продуктивной инфекцией ВИЧ-1 в отдельных клетках может быть адаптирована для изучения внутриклеточной кинетики кальция в ответ на другие интересующий агонисты или антагонисты. Подготовка клеток к визуализации проста, ?...

Хроническое воспаление является основной причиной ВИЧ-ассоциированных ранних заболеваний и смертности1,2,3. Существует несколько механизмов, посредством которых ВИЧ может активировать воспалительную сигнализацию, и последние данные свидетельствуют о роли рецепторов P2X во входеВИЧ,которые являются кальциево-гатирующими аденозинтрифосфатными (АТФ) рецепторами3,4,5,6,7,8,9,10. Подтип пуринергических рецепторов P2X (P2XR) может быть важным фактором этого воспаления. Однако молекулярные механизмы взаимодействий ВИЧ-P2XR в значительной степени неизвестны и могут влиять на ранние и поздние этапы жизненного цикла вируса ВИЧ-1. Определение путей и кинетики, приводящих к хроническому воспалению, связанному с ВИЧ, имеет решающее значение для продвижения вариантов лечения людей с ВИЧ.
Чтобы оценить, агонизирует ли ВИЧ-1 непосредственно рецепторы P2X, активация P2XR и инфекция ВИЧ-1 должны измеряться параллельно. Независимо установлены анализы активности P2XR и инфекции ВИЧ-1: клеточный приток кальция является показателем активации P2XR, а продуктивная инфекция ВИЧ-1 может быть количественно определена по обилию РНК. Флуоресцентное обнаружение притока кальция возможно с помощью чувствительного к кальцию красителя Fluo-4, а вич-1-инфекцию можно визуализировать с помощью флуоресцентного репортерного вируса ВИЧ-NLCI11,12,13,14,15.
Поскольку эти показатели активации P2X (острый клеточный приток кальция) и инфекции ВИЧ-1 (синтез РНК ВИЧ-1) происходят в разных временных масштабах (минуты против дней), отсутствует высокопроизводительный метод, который позволяет проводить парный анализ активации P2XR и инфекции ВИЧ-1. Стандартные высокопроизводительные экспериментальные методы, такие как проточная цитометрия, позволяют проводить популяционный анализ, но не могут оценить взаимосвязь между острыми и продольными событиями в отдельных клетках. Альтернативно, одноклеточная визуализация со стандартной флуоресцентной микроскопией является низкопроизводительной. Эти экспериментальные ограничения представляют собой потребность в новых высокопроизводительных методах измерения связей между острыми и продольными клеточными событиями напрямую.
Описанная оптофлюидная система представляет собой новую платформу, способную к одноклеточной сортировке и изоляции, культивации, визуализации и программной автоматизации16,17,18,19. Эта система представляет собой интегрированную, высокопроизводительную альтернативу ограничениям традиционных методов визуализации. Платформа Beacon состоит из углекислого газа (CO2)и инкубатора с контролируемой температурой, который поддерживает ячейки, содержащиеся на чипе. Чип обладает светочувствительными транзисторами, которые генерируют электрический градиент в ответ на целевой свет. Эта результирующая диэлектрофоретическая сила используется для перемещения отдельных клеток через нанофлюидный чип в нужные области. Клетки сортируются в ручки на чипе, которые обеспечивают барьер для физической изоляции отдельных клеток. Непрерывный ламинарный поток питательных сред по всему чипу предотвращает миграцию клеток из ручек, обеспечивая при этом диффузию питательных веществ и реагентов, специфичных для эксперимента, рассеивая мелкие частицы. Флуоресцентный микроскоп находится над чипом. Программная автоматизация используется для захвата изображений чипа в указанный пользователем момент времени.
Всю клеточную характеристику выполняли с использованием оптофлюидной системы для одноклеточного отбора и манипуляций. Эта система состоит из интегрированных механических, микрофлюидных и оптических компонентов, которые позволяют манипулировать одноклеточными клетками, проводить анализ, культивировать и визуализировать. Клетки загружаются и культивируются на одноразовом нанофлюидном устройстве, состоящем из 3 500 отдельных камер (ручек), каждая из которых способна удерживать субнанолитровый объем. Клетки могут быть расположены внутри ручек с использованием светоиндуцированных диэлектрофоретических «клеток» и культивированы в условиях, контролируемых температурой иCO2. Микрофлюидика позволяет перфузию сред или буферов на чипе для клеточной культуры или лечения лекарственными препаратами. Приводимая в действие игла позволяет импортировать и экспортировать клетки из инкубированных и закрытых пластин колодца. Область чипа может быть визуализирована при 4-кратном или 10-кратном увеличении в ярко-полевом и флуоресцентном каналах (включая DAPI, FITC, TRed или Cy5) для характеристики клеточных фенотипов или функционального анализа. Вся система автоматизирована с помощью программного обеспечения, которое можно использовать для предварительно разработанных рабочих процессов или пользовательских экспериментов.
Были изучены взаимосвязи между вич-1-инфекцией и P2XR, но о высокопроизводительной процедуре для непосредственной характеристики этих взаимодействий параллельно не сообщалось. Здесь авторы описывают методологию изучения взаимодействий ВИЧ-P2XR путем отслеживания острого притока кальция и последующей продуктивной инфекции ВИЧ-1 на одноклеточном уровне. Примечательно, что это создает новый инструмент, который позволяет проводить прямые, высокопроизводительный, продольные измерения нескольких мишеней в отдельных клетках.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Beacon Optofluidic System</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FIJI</td>
			<td colspan="2">Open-source software</td>
			<td>PMID: 22743772, 22930834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluo-4 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;F10489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;HIV-1 NLCINL4-3</td>
			<td colspan="2">Laboratory of Benjamin Chen</td>
			<td>PMID: 28148796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td colspan="2">GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>&#160;SV30010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MT-4 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent</td>
			<td></td>
			<td>&#160;ARP-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OptoSelect 3500 chip</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Prism 9.0.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform

ВИЧ-1 вызывает хроническую инфекцию, которая поражает более 37 миллионов человек во всем мире. Люди, живущие с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), испытывают коморбидность, связанную с хроническим воспалением, несмотря на антиретровирусную терапию. Однако эти воспалительные сигналы не были полностью охарактеризованы. Роль ранних событий входа в активацию клеточных сигнальных событий и последующей экспрессии генов не была отражена на уровне одной клетки. Здесь авторы описывают метод, который применяет принципы флуоресцентной микроскопии живых клеток к автоматизированной одноклеточной платформе, которая культурирует и визуаизирует клетки в течение пользовательских курсов времени, что позволяет проводить высокопроизводительный анализ динамических клеточных процессов. Этот анализ может отслеживать одноклеточную живую флуоресцентную микроскопию ранних событий, которые непосредственно следуют за инфекцией ВИЧ-1, в частности приток кальция, который сопровождает воздействие вируса и развитие продуктивной инфекции с использованием флуоресцентного репортерного вируса. Клетки MT-4 нагружают чувствительным к кальцию красителем и культивируют в изолированных ручках на нанофлюидном устройстве. Культивированные клетки инфицированы вирусом-репортером ВИЧ-1 (ВИЧ-1 NLCI). Флуоресцентный микроскоп, расположенный над нанофлюидным устройством, измеряет приток кальция в течение 8-минутного временного времени после острого воздействия ВИЧ-1. Продуктивная инфекция ВИЧ-1 измеряется в тех же клетках в течение 4-дневного интервала. Данные визуализации из этих временных курсов анализируются для определения взаимодействий вируса и рецептора хозяина и динамики сигнального пути. Авторы представляют интегрированную, масштабируемую альтернативу традиционным методам визуализации с использованием новой оптофлюидной платформы, способной к одноклеточной сортировке, культивации, визуализации и автоматизации программного обеспечения. Этот анализ может измерять кинетику событий при различных условиях, включая тип клетки, агонист или эффект антагониста, при измерении массива параметров. Это первый установленный метод для нанофлюидной высокопроизводительной продольной одноклеточной культуры и визуализации: этот метод может быть широко адаптирован для изучения кинетики клеточной сигнализации и динамических молекулярных взаимодействий.

Рисунок 1 иллюстрирует формат чипа и необработанных данных изображения, полученных с помощью флуоресцентного микроскопа. Идентификация и кластеризация неинфицированных и инфицированных клеток с помощью измерения mCherry показаны на рисунке 2. Эти кластер...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

Здесь мы представляем протокол, в котором отдельные клетки контролируются на острые события и продуктивную инфекцию ВИЧ-1 на нанофлюидном устройстве. Данные визуализации определяют взаимодействие вируса и рецептора хозяина и динамику сигнального пути. Это первый метод нанофлюидной высокопроизводительной продольной одноклеточной культуры и визуализации для изучения кинетики передачи сигналов и молекулярных взаимодействий.

Одноклеточная характеристика притока кальция и инфекции ВИЧ-1 с использованием многопараметрической оптофлюидной платформы

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

Этот протокол может захватывать кинетику в реальном времени на уровне одной клетки. Мы можем измерять отдельные параметры клеток в ответ на ВИЧ-инфекцию и связывать ранние сигнальные события с отсроченными этапами жизненного цикла вируса. Это интегрированная масштабируемая альтернатива традиционным методам визуализации с использованием новой оптофлюидной платформы для одноклеточной сортировки, культивирования, визуализации и автоматизации программного обеспечения.Это первый установленный метод для нанофлюидной, высокопроизводительной, продольной одноклеточной культуры и визуализации. Этот метод может быть широко принят для изучения кинетики клеточной сигнализации и динамических молекулярных взаимодействий в различных болезненных состояниях. Визуальная демонстрация этого метода важна для передачи того, как проводится эксперимент, как ячейки оптически сортируются в ручки и как настраивать инфузии через чип.Для начала приготовьте свежий раствор Fluo-4 AM, добавив 25 микролитров концентрированного моющего растворителя 100X и 2,5 микролитра 1, 000X Fluo-4 AM в 1,5 миллилитровую трубку, затем вихрь для смешивания. Пипетка 2,5 миллилитра питательной среды в загрузочный раствор и инвертируется для смешивания. Центрифугируют два миллиона ячеек МТ-4 в 500 раз G в течение трех минут, затем удаляют жижу и повторно суспендируют гранулу в двух миллилитрах подготовленного загрузочного раствора Fluo-4 AM.Пипетка повторно подвешивает клетки в 35-миллиметровую чашку Петри. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15-30 минут, затем инкубировать еще 15-30 минут при комнатной температуре. Перенесите клеточную суспензию в трубку центрифуги и центрифугируют ячейки в 500 раз G в течение трех минут, затем удалите супернатант.Повторно суспендируют гранулу клетки путем пипетки в одном миллилитрах питательной среды и центрифуги в 500 раз G в течение трех минут для промывки. Повторно суспендируют клеточную гранулу путем пипетки в культуральная среда в концентрации двух миллионов клеток на миллилитр в течение не менее 50 микролитров. Чтобы приготовить чип с смачивающим раствором, который облегчает выемку ячейки, загрузите трубки центрифуги, содержащие два миллилитра смачивающего раствора и 50 миллилитров деионизированной воды, на инструмент с новым оптофлюидным чипом и запустите функцию мокрого чипа, которая заположит чип смачивающим раствором.Инкубируют чип при 50 градусах Цельсия и трижды промывайте чип водой. После промывки водой промывки промывки чипа тремя циклами по 250 микролитров питательной среды. Дополняйте клеточную суспензию с предыдущей ступени одним на 100 частей моющего средства F127 перед загрузкой, чтобы уменьшить вероятность прилипания клеток к каналам чипа.Используйте иглу экспорта инструмента для импорта ячеек из 1,5-миллилитровой центрифужной трубки с операцией загрузки и импортом небольшого объема для пятимиллитрового пакета ячейки. Перьевые ячейки, использующие оптимизированное оптоэлектронное позиционирование или напряжение OEP 4,3 вольта и скорость клетки пять микрометров в секунду с помощью функции автоматического пера, которая автоматически обнаруживает отдельные ячейки, окружает их клеткой OEP и перемещает их в ближайшую ручку. Если интересующие ячейки остаются после автоматического написания, используйте функцию ручного пера для выбора целевых ячеек и целевого пера.После завершения написания промывайте чип тремя циклами по 250 микролитров питательной среды, чтобы очистить оставшиеся неоткопимые клетки от чипа. После написания клеток получите флуоресцентные изображения клеток в каналах FITC, Texas Red и DAPI для измерения базового уровня Fluo-4, mCherry и автофлуоресценции. Вливать ВИЧ-1 в микрочип в концентрации 13 нанограммов ВИЧ-1 NLCI на два миллиона клеток, медленно пипетируя суспензию в чип через экспортную иглу.Сразу после добавления ВИЧ-1 многократно получать изображения в каналах FITC и DAPI в течение 10-минутного временного курса. Получайте изображения в каналах Texas Red и DAPI через один, два, три и четыре дня после заражения. Эта методология использовалась для идентификации и кластеризации ВИЧ-инфицированных и неинфицированных клеток с помощью измерения mCherry.Клетки с изменением сигнала mCherry больше или ниже средней интенсивности флуоресцентности 40 000 были сгруппированы в популяцию mCherry high или mCherry low соответственно. Эти кластеры были проанализированы на кинетику притока кальция путем измерения внутриклеточного кальция с использованием флуоресценции Fluo-4 многократно в течение девяти минут времени, что продемонстрировало ранний приток кальция в ВИЧ-инфицированные клетки. Наблюдалась значительная положительная корреляция между притоком кальция и цветением мвышни.При попытке этой процедуры важно не забывать начинать с клеток в пределах экспоненциального диапазона роста как для производства вируса, так и для инфекции, потому что разросшиеся клетки приведут к резкому снижению сигнала от этого анализа. Работа с ВИЧ-1 может быть опасной. Поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует принимать методы BSL-2, указанные в стандарте OSHA bloodborne Pathogen Standard.Этот метод интересен, потому что он позволит нам изучать одноклеточные фенотипические или транскрипционные изменения в контролируемых условиях. Это имеет широкий потенциал для корреляции влияния стимулов на молекулярные пути во многих типах клеток.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Конкретные Маркировка ВИЧ-1-положительных клеток использованием Rev-зависимый лентивирусов Векторный выражая зеленый флуоресцентный белок

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Генотипическая вывода ВИЧ-1 тропизм Использование Популяционные Секвенирование V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Прогнозирование ВИЧ-1 корецепторов использования (тропизм) анализом последовательности использования Генотипическая подход

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

В пробирке раздевания ВИЧ-1 сердечников

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Одноклеточный анализ Сенная Bacillus Биопленки с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Оценка Врожденная зондирование инфицированных ВИЧ-1 CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток плазмоцитов дендритных клеток с помощью<em&gt; Экс естественных</em&gt; Совместное культивирование системы.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Конформационный Оценка ВИЧ-1 тримерных гликопротеинов с помощью мобильного основе ELISA Пробирной

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Выделение экзосомы из плазмы ВИЧ-1-инфицированных

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Визуализация ВИЧ-1 Gag Связывание с Giant однослойные везикулы (ГУВ) Мембраны

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Измерение<em&gt; In Vitro</em&gt; Интеграция активность ВИЧ-1 Preintegration Комплексы

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...