Name: single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00
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Estamos agradecidos por las discusiones científicas con el Dr. Benjamin Chen. Este trabajo fue financiado por K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS y KB) y R21AI152833 (THS y KB).

1. Preparación de células para la proyección de imagen
<ol><li>Prepare la solución de carga fresca Fluo-4 AM: Agregue 25 μL de disolvente detergente concentrado 100x, luego agregue 2.5 μL de Fluo-4 AM 1000x a un tubo de 1.5 mL. Vórtice para mezclar.</li>
	<li>Pipetear 2,5 mL de medios de cultivo en la solución de carga e invertir para mezclar. Proteger de la luz.</li>
	<li>Centrífuga 2 x 106 células MT-4 a 500 x g durante 3 min.</li>
	<li>Retire el medio y resuspend el pellet en 2 mL de la...

<ol>
	<li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+inflammation,+and+HIV+infection.">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li><li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection.">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li><li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors:+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation.">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).</li><li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions.">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li><li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+(IL-10)+and+IL-1&#946;+in+a+human+tonsil+explant+model.">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1&#946; in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).</li><li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures.">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases.">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li><li>Chen, P., H&#252;bner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses.">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li><li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca(2+)-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomi&#263;, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels.">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li><li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs.">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).</li><li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity.">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010 (2018).</li><li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform.">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).</li><li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+cell+identification+and+sorting+(LACIS)+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device.">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41 (2018).</li><li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light.">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li><li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator.">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion.">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion.">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).</li></ol>

La metodología descrita para estudiar la relación entre la afluencia de calcio y la infección productiva por VIH-1 en células individuales puede adaptarse para estudiar la cinética intracelular del calcio en respuesta a otros agonistas o antagonistas de interés. La preparación de las células para la obtención de imágenes es simple, requiere un tiempo mínimo, y los reactivos están disponibles en kits convenientes de fabricantes ampliamente utilizados. La medición de calcio basada en Fluo-4 está bien descrita...

La inflamación crónica es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad tempranas asociadas al VIH1,2,3. Hay mecanismos múltiples por los cuales el VIH pueda activar la señalización inflamatoria, y la evidencia reciente sugiere un papel de los receptores P2X en la entrada del VIH que son receptores de trifosfato de adenosina (ATP) de calcio-gating3,4,5,6,7,8,9,10. El subtipo P2X de receptores purinérgicos (P2XR) puede ser facilitadores importantes de esta inflamación. Sin embargo, los mecanismos moleculares de las interacciones VIH-P2XR son en gran parte desconocidos y pueden afectar los pasos tempranos y tardíos del ciclo de vida viral del VIH-1. Definir las vías y la cinética que impulsan la inflamación crónica asociada al VIH es fundamental para avanzar en las opciones de tratamiento para las personas con VIH.
Para evaluar si el VIH-1 agoniza directamente los receptores P2X, la activación de P2XR y la infección por VIH-1 deben medirse en paralelo. Los análisis de la actividad de P2XR y de la infección VIH-1 se han establecido independientemente: La afluencia celular del calcio es un indicador de la activación de P2XR, y la infección productiva VIH-1 se puede cuantificar por abundancia del ARN. La detección de fluorescencia de la afluencia de calcio es posible con el colorante sensible al calcio Fluo-4, y la infección por VIH-1 se puede visualizar con el virus reportero fluorescente mCherry VIH-NLCI11,12,13,14,15.
Debido a que estos indicadores de activación de P2X (afluencia celular aguda de calcio) y la infección por VIH-1 (síntesis de ARN VIH-1) ocurren en diferentes escalas de tiempo (minutos versus días), no hay un método de alto rendimiento que permita el análisis emparejado de la activación de P2XR y la infección por VIH-1. Las técnicas experimentales estándar de alto rendimiento, como la citometría de flujo, permiten el análisis de la población, pero no pueden evaluar la relación entre los eventos agudos y longitudinales en células individuales. Alternativamente, la proyección de imagen unicelular con microscopia estándar de la fluorescencia es de bajo rendimiento. Estas limitaciones experimentales presentan una necesidad de técnicas nuevas, de alto rendimiento para medir las asociaciones entre los eventos celulares agudos y longitudinales directamente.
Un sistema optofluídico descrito es una nueva plataforma capaz de clasificación y aislamiento unicelular, cultivo, imágenes y automatización de software16,17,18,19. Este sistema presenta una alternativa integrada y de alto rendimiento a las limitaciones de los métodos de imagen tradicionales. La plataforma Beacon consiste en una incubadora de dióxido de carbono (CO2)y temperatura controlada que soporta las células contenidas en un chip. El chip posee transistores fotosensibles que generan un gradiente eléctrico en respuesta a la luz dirigida. Esta fuerza dielectroforética resultante se utiliza para mover células individuales a través del chip nanofluídico a las regiones deseadas. Las células se clasifican en bolígrafos en el chip, que proporcionan una barrera para aislar las células individuales físicamente. El flujo laminar continuo de medios de crecimiento a través del chip evita la migración celular de las plumas al tiempo que permite la difusión de partículas pequeñas de nutrientes y reactivos específicos del experimento. Un microscopio de fluorescencia se encuentra por encima del chip. La automatización de software se utiliza para capturar imágenes del chip en el punto de tiempo especificado por el usuario.
Toda la caracterización celular se realizó utilizando un sistema optofluídico para la selección y manipulación unicelular. Este sistema consiste en componentes mecánicos, microfluídicos y ópticos integrados que permiten la manipulación unicelular, el ensayo, el cultivo y la obtención de imágenes. Las células se cargan y cultivan en el dispositivo nanofluídico desechable que consta de 3.500 cámaras individuales (bolígrafos), cada una capaz de contener el volumen sub-nanolitro. Las células pueden colocarse dentro de corrales utilizando "jaulas" dielectroforéticas inducidas por la luz y cultivarse en condiciones controladas por temperatura y CO2. La microfluídica permite la perfusión de medios o tampones en el chip para el cultivo celular o el tratamiento farmacológico. Una aguja accionada permite la importación y exportación de células de placas de pozo incubadas y obturadas. El área del chip se puede tomar imágenes a un aumento de 4x o 10x en canales fluorescentes y de campo brillante (incluidos DAPI, FITC, TRed o Cy5) para caracterizar fenotipos celulares o análisis funcional. Todo el sistema está automatizado mediante software que se puede utilizar para flujos de trabajo prediseñados o experimentos personalizados.
Se han estudiado las relaciones entre la infección por VIH-1 y P2XR, pero no se ha informado de un procedimiento de alto rendimiento para caracterizar directamente estas interacciones en paralelo. Aquí, los autores describen una metodología para estudiar las interacciones VIH-P2XR a través del seguimiento de la afluencia aguda de calcio y la posterior infección productiva por VIH-1 a nivel unicelular. En particular, esto establece una herramienta novedosa que permite la medición directa, de alto rendimiento y longitudinal de múltiples objetivos en celdas individuales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Beacon Optofluidic System</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FIJI</td>
			<td colspan="2">Open-source software</td>
			<td>PMID: 22743772, 22930834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluo-4 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;F10489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;HIV-1 NLCINL4-3</td>
			<td colspan="2">Laboratory of Benjamin Chen</td>
			<td>PMID: 28148796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td colspan="2">GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>&#160;SV30010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MT-4 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent</td>
			<td></td>
			<td>&#160;ARP-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OptoSelect 3500 chip</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Prism 9.0.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform

El VIH-1 causa una infección crónica que afecta a más de 37 millones de personas en todo el mundo. Las personas que viven con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) experimentan comorbilidad relacionada con la inflamación crónica a pesar de la terapia antirretroviral. Sin embargo, estas señales inflamatorias no se han caracterizado completamente. El papel de los eventos de entrada temprana en la activación de los eventos de señalización celular y la expresión génica aguas abajo no se ha capturado a nivel unicelular. Aquí los autores describen un método que aplica los principios de la microscopía de fluorescencia de células vivas a una plataforma unicelular automatizada que cultivos e imágenes de células a través de cursos de tiempo personalizados por el usuario, lo que permite el análisis de alto rendimiento de los procesos celulares dinámicos. Este ensayo puede rastrear la microscopía de fluorescencia en vivo unicelular de los eventos tempranos que siguen inmediatamente a la infección por VIH-1, en particular la afluencia de calcio que acompaña a la exposición al virus y el desarrollo de una infección productiva utilizando un virus reportero fluorescente. Las células MT-4 se cargan con un tinte sensible al calcio y se cultivan en plumas aisladas en un dispositivo nanofluídico. Las células cultivadas están infectadas con un virus reportero del VIH-1 (VIH-1 NLCI). Un microscopio de fluorescencia colocado por encima del dispositivo nanofluídico mide la afluencia de calcio durante un curso de tiempo de 8 minutos después de la exposición aguda al VIH-1. La infección productiva por VIH-1 se mide en esas mismas células durante un intervalo de 4 días. Los datos de imágenes de estos cursos de tiempo se analizan para definir las interacciones virus-receptor huésped y la dinámica de la vía de señalización. Los autores presentan una alternativa integrada y escalable a los métodos de imagen tradicionales utilizando una nueva plataforma optofluídica capaz de clasificar, cultivar, obtener imágenes y automatización de software unicelulares. Este ensayo puede medir la cinética de los eventos bajo diversas condiciones, incluyendo el tipo de célula, agonista, o efecto antagonista, mientras que la medición de una serie de parámetros. Este es el primer método establecido para el cultivo unicelular longitudinal nanofluídico de alto rendimiento y la imagen: Esta técnica se puede adaptar ampliamente para estudiar la cinética de señalización celular y las interacciones moleculares dinámicas.

La Figura 1 ilustra el formato del chip y los datos de imágenes en bruto adquiridos a través del microscopio de fluorescencia. La identificación y agrupación de células no infectadas e infectadas a través de la medición de mCherry se muestran en la Figura 2. Estos grupos se analizan para la cinética de influjo de calcio en la Figura 3,que demuestra la afluencia temprana de calcio en las células infectadas por el VIH. <stron...

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Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

Aquí, presentamos un protocolo en el cual las solas células se supervisan para los eventos agudos y la infección productiva HIV-1 en un dispositivo nanofluidic. Los datos de imágenes definen las interacciones virus-receptor huésped y la dinámica de la vía de señalización. Este es el primer método para el cultivo unicelular longitudinal nanofluídico de alto rendimiento y las imágenes para estudiar la cinética de señalización y las interacciones moleculares.

Caracterización Unicelular De La Afluencia De Calcio Y La Infección Por VIH-1 Utilizando Una Plataforma Optofluídica Multiparámetro

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

Este protocolo puede capturar cinética en tiempo real a nivel unicelular. Podemos medir parámetros celulares individuales en respuesta a la infección por VIH y asociar eventos de señalización temprana con pasos retrasados del ciclo de vida viral. Esta es una alternativa escalable integrada a los métodos de imagen tradicionales que utilizan una nueva plataforma optofluídica para la clasificación unicelular, el cultivo, la creación de imágenes y la automatización de software.Este es el primer método establecido para el cultivo unicelular longitudinal nanofluídico, de alto rendimiento y la obtención de imágenes. Esta técnica se puede adoptar ampliamente para estudiar la cinética de señalización celular y las interacciones moleculares dinámicas en una variedad de estados de la enfermedad. La demostración visual de este método es importante para transmitir cómo se configura el experimento, cómo se clasifican ópticamente las células en bolígrafos y cómo configurar infusiones a través del chip.Para comenzar, prepare la solución de carga fresca Fluo-4 AM agregando 25 microlitros de disolvente detergente concentrado 100X y 2.5 microlitros de 1, 000X Fluo-4 AM a un tubo de 1.5 mililitros, luego vórtice para mezclar. Pipetear 2,5 mililitros de medios de cultivo en la solución de carga e invertir para mezclar. Centrifugar dos millones de células MT-4 a 500 veces G durante tres minutos, luego retire los medios y vuelva a llenar el pellet en dos mililitros de la solución de carga Fluo-4 AM preparada.Pipeta re-suspendió las células en una placa de Petri de 35 milímetros. Incubar a 37 grados Centígrados durante 15 a 30 minutos, luego incubar durante 15 a 30 minutos adicionales a temperatura ambiente. Transfiera la suspensión de la célula a un tubo de centrífuga y centrífuga las células a 500 veces G durante tres minutos, luego retire el sobrenadante.Resuspend el pellet celular pipeteando en un mililitro del medio de cultivo y centrífuga a 500 veces G durante tres minutos para lavar. Resuspend el pellet celular pipeteando en el medio de cultivo a una concentración de dos millones de células por mililitro durante al menos 50 microlitros. Para preparar un chip con la solución humectante, que facilita la fijación de la célula, cargue tubos centrífugos que contengan dos mililitros de solución humectante y 50 mililitros de agua desionizada en el instrumento con un nuevo chip optofluídico y ejecute la función de chip húmedo que inundará el chip con la solución humectante.Incube el chip a 50 grados Centígrados y enjuague el chip con agua tres veces. Una vez que se realiza el lavado de agua, enjuague el chip con tres ciclos de 250 microlitros de medios de cultivo. Complemente la suspensión celular del paso anterior con una por cada 100 partes de soluto detergente F127 antes de la carga para reducir la probabilidad de que las células se peguen a los canales de la viruta.Utilice la aguja de exportación del instrumento para importar células de un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros con la operación de carga y la importación de pequeño volumen para un volumen de paquete de celdas de cinco microlitros. Celdas de pluma que utilizan un posicionamiento optoelectrónico optimizado o voltaje OEP de 4.3 voltios y cinco micrómetros por segundo de velocidad de la jaula mediante el uso de la función de lápiz automático, que detectará automáticamente las celdas individuales, las rodeará con una jaula OEP y las moverá a una pluma cercana. Si las celdas de interés permanecen después del esclarecer automático, utilice la función de lápiz manual para seleccionar las celdas de destino y un lápiz de destino.Una vez que se haya completado el penning, enjuague el chip con tres ciclos de 250 microlitros de medios de cultivo para eliminar cualquier celda restante sin costo del chip. Después de escribir las células, obtenga imágenes fluorescentes de las células en los canales FITC, Texas Red y DAPI para medir la línea de base Fluo-4, mCherry y autofluorescencia. Infundir el VIH-1 en el microchip a una concentración de 13 nanogramos de NLCI vih-1 por cada dos millones de células mediante la canalización lenta de la suspensión en el chip a través de la aguja de exportación.Inmediatamente después de la adición del VIH-1, obtenga repetidamente imágenes en los canales FITC y DAPI durante un curso de tiempo de 10 minutos. Obtenga imágenes en los canales Texas Red y DAPI a los uno, dos, tres y cuatro días después de la infección. Esta metodología se utilizó para la identificación y agrupación de células infectadas y no infectadas por el VIH a través de la medición de mCherry.Las células con un cambio en la señal de mCherry mayor o inferior a 40, 000 intensidad fluorescente media se agruparon en la población alta o baja de mCherry, respectivamente. Estos racimos eran analizados para la cinética de la afluencia del calcio midiendo el calcio intracelular usando fluorescencia Fluo-4 en varias ocasiones sobre un curso de nueve minutos del tiempo, que demostró afluencia temprana del calcio en células VIH-infectadas. Una correlación positiva significativa entre la afluencia del calcio y la florescencia del mCherry fue observada.Al intentar este procedimiento, es importante recordar comenzar con las células dentro del rango de crecimiento exponencial tanto para la producción de virus como para la infección porque las células cubiertas de vegetación resultarán en una disminución dramática de la señal de este ensayo. Trabajar con el VIH-1 puede ser peligroso. Por lo tanto, las prácticas de BSL-2 como se indica en el Estándar de Patógenos transmitidos por la sangre de OSHA siempre deben tomarse mientras se realiza este procedimiento.Esta técnica es emocionante porque nos permitirá estudiar los cambios fenotípicos o transcripcionales unicelulares en condiciones controladas. Esto tiene un amplio potencial para correlacionar el impacto de los estímulos en las vías moleculares en muchos tipos de células.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Marcado específico del VIH-1 células positivas utilizando un vector lentiviral Ap-dependientes que expresan la proteína verde fluorescente

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Predicción del VIH-1 usos correceptor (tropismo) por análisis de secuencia utilizando un enfoque genotípica

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

En uncoating in vitro del VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualización de VIH-1 Gag unión a Giant unilamelares vesículas membranas (GUV)

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Medida de<em&gt; In Vitro</em&gt; Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...