Name: single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Vi är tacksamma för de vetenskapliga diskussionerna med dr Benjamin Chen. Detta arbete finansierades av K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS och KB) och R21AI152833 (THS och KB).

1. Beredning av celler för avbildning
<ol><li>Bered färsk Fluo-4 AM lastlösning: Tillsätt 25 μL 100x koncentrerat rengöringsmedelsmedel och tillsätt sedan 2,5 μL Fluo-4 AM 1000x till ett 1,5 ml-rör. Virvel att blanda.</li>
	<li>Pipett 2,5 ml odlingsmedia i lastlösningen och inverterad att blanda. Skydda mot ljus.</li>
	<li>Centrifugera 2 x 106 MT-4 celler vid 500 x g i 3 min.</li>
	<li>Ta bort media och sätt tillbaka pelleten i 2 ml av den beredda Fluo-4 AM-lastlösningen. Skydda mot ljus...

<ol>
	<li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+inflammation,+and+HIV+infection.">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li><li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection.">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li><li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors:+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation.">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).</li><li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions.">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li><li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages.">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors.">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+(IL-10)+and+IL-1&#946;+in+a+human+tonsil+explant+model.">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1&#946; in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).</li><li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures.">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases.">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li><li>Chen, P., H&#252;bner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses.">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li><li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca(2+)-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomi&#263;, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels.">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li><li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs.">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).</li><li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity.">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010 (2018).</li><li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform.">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).</li><li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+cell+identification+and+sorting+(LACIS)+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device.">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41 (2018).</li><li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light.">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li><li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator.">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion.">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion.">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).</li></ol>

Den beskrivna metoden för att studera sambandet mellan kalciumtillströmning och HIV- 1-produktiv infektion i enstaka celler kan anpassas för att studera intracellulär kalciumkinetik som svar på andra agonister eller antagonister av intresse. Beredningen av celler för avbildning är enkel, minimalt tidsintensiv, och reagenser finns i praktiska kit från allmänt använda tillverkare. Fluo-4-baserad kalciummätning är väl beskriven i litteraturen, och HIV-1 kan enkelt ersätta andra virus eller föreningar av intre...

Kronisk inflammation är en ledande orsak till HIV-associerade tidiga sjukligheter ochdödlighet 1,2,3. Det finns flera mekanismer där HIV kan aktivera inflammatorisk signalering, och nya bevis tyder på en roll för P2X-receptorerna i HIV-ingång som är kalcium-gating adenosin triphosphate (ATP) receptorer3,4,5,6,7,8,9,10. P2X subtyp av purinergic receptorer (P2XR) kan vara viktiga facilitatorer av denna inflammation. De molekylära mekanismerna i HIV-P2XR interaktioner är dock till stor del okända och kan påverka tidiga och sena HIV-1 virala livscykelsteg. Att definiera de vägar och kinetik som driver hiv-associerade kroniska inflammationer är avgörande för att främja behandlingsalternativ för personer med HIV.
För att bedöma om HIV-1 direkt våndas P2X-receptorer måste P2XR-aktivering och HIV-1-infektion mätas parallellt. Analyser av P2XR-aktivitet och HIV-1-infektion har oberoende fastställts: Cellulär kalciumtillströmning är en indikator på P2XR-aktivering, och HIV- 1-produktiv infektion kan kvantifieras av RNA överflöd. Fluorescensdetektering av kalciumtillströmning är möjlig med Fluo-4 kalciumkänsligt färgämne, och HIV-1-infektion kan visualiseras med mCherry fluorescerande reportervirus HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Eftersom dessa indikatorer för P2X aktivering (akut cellulär kalcium tillströmning) och HIV-1 infektion (HIV-1 RNA syntes) förekommer på olika tidsskalor (minuter mot dagar), saknar det en hög genomströmningsmetod som möjliggör parisk analys av P2XR aktivering och HIV-1 infektion. Standard experimentella tekniker med hög genomströmning, såsom flödescytometri, möjliggör populationsanalysen men kan inte bedöma sambandet mellan akuta och longitudinella händelser i enstaka celler. Alternativt är encellig avbildning med standard fluorescensmikroskopi låg genomströmning. Dessa experimentella begränsningar utgör ett behov av nya, hög genomströmningstekniker för att mäta associationer mellan akuta och longitudinella cellulära händelser direkt.
Ett optofluidiskt system som beskrivs är en ny plattform som kan sortera och isolera en cell, odling, bildbehandling och programvaruautomation16,17,18,19. Detta system presenterar ett integrerat, hög genomströmningsalternativ till begränsningarna för traditionella avbildningsmetoder. Beacon-plattformen består av en koldioxid (CO2)och temperaturstyrd inkubator som stöder celler som finns på ett chip. Chipet har ljuskänsliga transistorer som genererar en elektrisk lutning som svar på riktat ljus. Denna resulterande dielektrofatiska kraft används för att flytta enskilda celler över det nanofluidiska chipet till önskade regioner. Celler sorteras i pennor på chipet, vilket ger en barriär för att isolera enskilda celler fysiskt. Kontinuerligt laminärt flöde av tillväxtmedier i hela chipet förhindrar cellmigration från pennorna samtidigt som det möjliggör småpartikeldiffusion av näringsämnen och experimentspecifika reagenser. Ett fluorescensmikroskop sitter ovanför chippet. Programvaruautomatisering används för att ta bilder av chipet vid den användarspecificerade tidpunkten.
All cell karakterisering utfördes med hjälp av ett optofluidic system för encellig markering och manipulering. Detta system består av integrerade mekaniska, mikrofluidiska och optiska komponenter som möjliggör encellig manipulering, analys, kultur och avbildning. Cellerna laddas och odlas på den nanofluidiska engångsanordningen som består av 3 500 enskilda kammare (pennor), som var och en kan hålla undernanolitervolym. Celler kan placeras i pennor med ljusinducerade dielektrofatiska "burar" och odlas under temperatur- och CO2-kontrolleradeförhållanden. Mikrofluidik tillåter perfusion av media eller buffertar på chipet för cellkultur eller läkemedelsbehandling. En aktiverad nål möjliggör import och export av celler från inkuberade och stängda brunnsplattor. Chipområdet kan avbildas vid 4x eller 10x förstoring i brightfield och fluorescerande kanaler (inklusive DAPI, FITC, TRed eller Cy5) för att karakterisera cellulära fenotyper eller funktionell analys. Hela systemet automatiseras med hjälp av programvara som kan användas för fördesignade arbetsflöden eller anpassade experiment.
Samband mellan HIV-1 infektion och P2XR har studerats, men en hög genomströmning förfarande för att direkt karakterisera dessa interaktioner parallellt har inte rapporterats. Här beskriver författarna en metodik för att studera HIV-P2XR interaktioner genom att spåra akut kalcium tillströmning och efterföljande HIV-1 produktiv infektion på encellsnivå. Detta etablerar särskilt ett nytt verktyg som möjliggör direkt, hög genomströmning, longitudinell mätning av flera mål i enstaka celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Beacon Optofluidic System</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FIJI</td>
			<td colspan="2">Open-source software</td>
			<td>PMID: 22743772, 22930834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluo-4 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;F10489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;HIV-1 NLCINL4-3</td>
			<td colspan="2">Laboratory of Benjamin Chen</td>
			<td>PMID: 28148796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td colspan="2">GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>&#160;SV30010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MT-4 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent</td>
			<td></td>
			<td>&#160;ARP-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OptoSelect 3500 chip</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Prism 9.0.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform

HIV-1 orsakar en kronisk infektion som drabbar mer än 37 miljoner människor över hela världen. Personer som lever med humant immunbristvirus (HIV) upplever komorbiditet relaterad till kronisk inflammation trots antiretroviral behandling. Dessa inflammatoriska signalering har dock inte helt karakteriserats. Rollen av tidiga inträde händelser på aktivering av cellulära signalering händelser och nedströms gen uttryck har inte fångats på encellig nivå. Här beskriver författarna en metod som tillämpar principer för live-cell fluorescensmikroskopi till en automatiserad encellig plattform som kulturer och avbildar celler över användaranpassade tidskurser, vilket möjliggör analys av dynamiska cellulära processer med hög genomströmning. Denna analys kan spåra encellig levande fluorescensmikroskopi av tidiga händelser som omedelbart följer HIV-1-infektion, särskilt tillströmningen av kalcium som åtföljer exponering för viruset och utvecklingen av produktiv infektion med hjälp av ett fluorescerande reportervirus. MT-4-celler är laddade med ett kalciumkänsligt färgämne och odlas i isolerade pennor på en nanofluidisk enhet. De odlade cellerna är infekterade med ett HIV-1-reportervirus (HIV-1 NLCI). Ett fluorescensmikroskop placerat ovanför den nanofluidiska enheten mäter kalciumtillströmningen under en 8-minuters tidskurs efter akut HIV-1-exponering. HIV-1 produktiv infektion mäts i samma celler under ett 4-dagars intervall. Bilddata från dessa tidskurser analyseras för att definiera virus-värdreceptorinteraktioner och signalvägsdynamik. Författarna presenterar ett integrerat, skalbart alternativ till traditionella bildframställningsmetoder med hjälp av en ny optofluidisk plattform som kan sortera, odla, avbilda och automatisera programvara. Denna analys kan mäta kinetiken för händelser under olika förhållanden, inklusive celltyp, agonist eller antagonisteffekt, samtidigt som en rad parametrar mäts. Detta är den första etablerade metoden för nanofluidisk hög genomströmning längsgående encellig kultur och avbildning: Denna teknik kan i stort sett anpassas för att studera cellulära signalering kinetik och dynamiska molekylära interaktioner.

Figur 1 illustrerar formatet på chipet och rådata som förvärvats genom fluorescensmikroskopet. Identifiering och klustring av oinfekterade och infekterade celler via mCherry-mätning visas i figur 2. Dessa kluster analyseras för kalciumtillströmningskinetik i figur 3, vilket visar tidig kalciumtillströmning i HIV-infekterade celler. Figur 4 visar ett signifikant positivt samband mellan kalciumtil...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

Här presenterar vi ett protokoll där enstaka celler övervakas för akuta händelser och produktiv HIV-1-infektion på en nanofluidisk enhet. Bilddata definierar interaktioner mellan virusvärdreceptorer och signalvägsdynamik. Detta är den första metoden för nanofluidisk hög genomströmnings longitudinell encellig kultur och avbildning för att studera signaleringsk kinetik och molekylära interaktioner.

Encellig karakterisering av kalciumtillströmning och HIV-1-infektion med hjälp av en multiparameter optofluidisk plattform

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

Det här protokollet kan fånga kinetik i realtid på en encellig nivå. Vi kan mäta enskilda cellparametrar som svar på HIV-infektion och associera tidiga signaleringshändelser med fördröjda steg i viruslivscykeln. Detta är ett integrerat skalbart alternativ till traditionella bildframställningsmetoder med hjälp av en ny optofluidisk plattform för encellssortering, odling, avbildning och programvaruautomation.Detta är den första etablerade metoden för nanofluidisk, hög genomströmning, longitudinell encellig kultur och avbildning. Denna teknik kan i stort sett antas för att studera cellulära signalering kinetik och dynamiska molekylära interaktioner i en mängd olika sjukdom stater. Visuell demonstration av denna metod är viktig för att förmedla hur experimentet är inställt, hur celler sorteras optiskt i pennor och hur man ställer in infusioner genom chipet.Till att börja med bereda färsk Fluo-4 AM lastlösning genom att tillsätta 25 mikroliter 100X koncentrerat lösningsmedel för tvättmedel och 2,5 mikroliter 1 000X Fluo-4 AM till ett 1,5 milliliter rör och sedan virvel att blanda. Pipett 2,5 milliliter odlingsmedia i lastlösningen och inverterad att blanda. Centrifugera två miljoner MT-4-celler vid 500 gånger G i tre minuter, ta sedan bort media och återanvänd pelleten i två milliliter av den beredda Fluo-4 AM-lastningslösningen.Pipetten återhängde celler i en 35 millimeters Petri-skål. Inkubera vid 37 grader Celsius i 15 till 30 minuter och inkubera sedan i ytterligare 15 till 30 minuter vid rumstemperatur. Överför cellfjädringen till ett centrifugeringsrör och centrifugera cellerna vid 500 gånger G i tre minuter och ta sedan bort supernaten.Återanvänd cellpelleten genom att pipetta i en milliliter av odlingsmediet och centrifugera vid 500 gånger G i tre minuter för att tvätta. Återanvänd cellpelleten genom att pipetting i odlingsmediet vid en koncentration av två miljoner celler per milliliter för minst 50 mikroliter. För att förbereda ett chip med våtlösningen, som underlättar cell penning, ladda centrifugrör som innehåller två milliliter våtlösning och 50 milliliter avjoniserat vatten på instrumentet med ett nytt optofluidiskt chip och kör våtchipfunktionen som kommer att översvämma chipet med våtlösningen.Inkubera chipet vid 50 grader Celsius och spola chipet med vatten tre gånger. När vattenspolningen är klar, spola chipet med tre cykler av 250 mikroliter kulturmedier. Komplettera cellfjädringen från föregående steg med en per 100 delar F127 tvättmedel solut innan lastningen för att minska sannolikheten för celler som fastnar på spånkanalerna.Använd instrumentets exportnål för att importera celler från ett 1,5 milliliter centrifugeringsrör med lastdrift och liten volymimport för en volym på fem mikroliterceller. Pennceller med en optimerad optoelektronisk positionering eller OEP-spänning på 4,3 volt och fem mikrometer per sekund burhastighet med hjälp av autopennans funktion, som automatiskt kommer att upptäcka enstaka celler, omge dem med en OEP-bur och flytta dem till en närliggande penna. Om celler av intresse fortsätter att följa automatisk penning använder du den manuella pennfunktionen för att markera målceller och en målpenna.När penning är klar, spola chipet med tre cykler av 250 mikroliter kulturmedier för att rensa eventuella återstående oanvända celler från chipet. Efter penningceller, få fluorescerande bilder av celler i FITC, Texas Red och DAPI kanaler för att mäta baslinjen Fluo-4, mCherry och autofluorescens. Ingjut HIV-1 i mikrochipet vid en koncentration av 13 nanogram HIV-1 NLCI per två miljoner celler genom att långsamt leda suspensionen i chipet genom exportnålen.Omedelbart efter HIV-1-tillägget, få upprepade gånger bilder i FITC- och DAPI-kanalerna under en 10-minuters tidskurs. Få bilder i Texas Red och DAPI kanaler på en, två, tre och fyra dagar efter infektion. Denna metod användes för identifiering och klustring av hiv-infekterade och oinfekterade celler via mCherry-mätning.Celler med en förändring i mCherry signal större eller lägre än 40, 000 genomsnittliga fluorescerande intensitet grupperades i mCherry hög eller mCherry låg befolkning respektive. Dessa kluster analyserades för kalcium tillströmning kinetik genom att mäta intracellulära kalcium med Fluo-4 fluorescens upprepade gånger under en nio minuters tid kurs, som visat tidig kalcium tillströmning i HIV-infekterade celler. En betydande positiv korrelation mellan kalcium tillströmning och mCherry florescence observerades.När du försöker denna procedur är det viktigt att komma ihåg att börja med cellerna inom det exponentiella tillväxtområdet för både virusproduktion och infektion eftersom övervuxna celler kommer att resultera i en dramatisk minskning av signalen från denna analys. Att arbeta med HIV-1 kan vara farligt. Därför bör BSL-2-metoder som anges i OSHA Bloodborne Pathogen Standard alltid tas när denna procedur utförs.Denna teknik är spännande eftersom det kommer att göra det möjligt för oss att studera encelliga fenotypiska eller transkriptionella förändringar under kontrollerade förhållanden. Detta har stor potential att korrelera effekten av stimuli på molekylära vägar i många celltyper.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Särskild märkning av HIV-1 positiva celler med hjälp av en Rev-beroende Lentiviral Vector uttrycka det grönt fluorescerande proteinet

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypisk Inferens av HIV-1 Tropism Använda Befolkning-sekvensering av V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediktion av HIV-1 coreceptor användning (Tropism) genom sekvensanalys med en genotypisk strategi

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating av HIV-1 kärnor

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Encelliga Analys av Bacillus subtilis Biofilmer Använda fluorescensmikroskopi och flödescytometri

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Bedömning av Innate Sensing av HIV-1 infekterade CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler från Plasmacytoid dendritiska celler med en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Samodlingssystemet.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Conformational Utvärdering av HIV-1 trimera Envelope Glycoproteins användning av en cellbaserad ELISA-analys

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolering av exosomes från plasma HIV-1 positiva individer

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualisering av HIV-1 Gag Bindning Giant enlamellvesikel (GUV) Membran

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

mätning av<em&gt; In Vitro</em&gt; Integration Aktivitet av HIV-1 Preintegration Anläggningar

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...