Name: single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Dr. Benjamin Chen ile yaptığımız bilimsel tartışmalar için minnettarız. Bu çalışma K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS ve KB) ve R21AI152833 (THS ve KB) tarafından finanse edildi.

1. Hücrelerin görüntüleme için hazırlanması
<ol><li>Taze Fluo-4 yükleme solüsyonu hazırlayın: 25 μL 100x konsantre deterjan çözücü ekleyin, ardından 1,5 mL'lik bir tüpe 2,5 μL Fluo-4 1000x ekleyin. Karıştırmak için girdap.</li>
	<li>Pipet 2.5 mL kültür ortamı yükleme çözeltisine ve karıştırmak için ters çevirin. Işıktan kork.</li>
	<li>Santrifüj 2 x 106 MT-4 hücre 500 x g'da 3 dakika boyunca.</li>
	<li>Ortamı çıkarın ve peletin hazırlanan Fluo-4 yükleme ç...

<ol>
	<li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+inflammation,+and+HIV+infection.">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li><li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection.">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li><li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors:+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation.">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).</li><li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions.">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li><li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages.">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors.">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+(IL-10)+and+IL-1&#946;+in+a+human+tonsil+explant+model.">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1&#946; in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).</li><li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures.">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases.">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li><li>Chen, P., H&#252;bner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses.">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li><li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca(2+)-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomi&#263;, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels.">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li><li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs.">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).</li><li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity.">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010 (2018).</li><li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform.">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).</li><li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+cell+identification+and+sorting+(LACIS)+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device.">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41 (2018).</li><li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light.">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li><li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator.">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion.">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).</li><li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion.">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).</li></ol>

Tek hücrelerde kalsiyum akını ve HIV-1 üretken enfeksiyonu arasındaki ilişkiyi incelemek için tanımlanan metodoloji, diğer agonistlere veya ilgi çekici antagonistlere yanıt olarak hücre içi kalsiyum kinetiğini incelemek için uyarlanabilir. Hücrelerin görüntüleme için hazırlanması basittir, minimum zaman yoğundur ve reaktifler yaygın olarak kullanılan üreticilerin uygun kitlerinde mevcuttur. Fluo-4 bazlı kalsiyum ölçümü literatürde iyi tanımlanmıştır ve HIV-1 bu platformda çalışmak i...

Kronik inflamasyon HIV ile ilişkili erken morbiditelerin ve mortalitenin önde gelen bir nedenidir1,2,3. HIV'in enflamatuar sinyali aktive edebildiği birden fazla mekanizma vardır ve son kanıtlar, HIV girişinde kalsiyum-gating adenozin trifosfat (ATP) reseptörleri 3 , 4 , 5 , 6,7 ,8,9,10olan P2X reseptörleri için bir rol olduğunu göstermektedir. Pürinerjik reseptörlerin (P2XR) P2X alt tipi bu iltihabın önemli kolaylaştırıcıları olabilir. Bununla birlikte, HIV-P2XR etkileşimlerinin moleküler mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir ve erken ve geç HIV-1 viral yaşam döngüsü adımlarını etkileyebilir. HIV ile ilişkili kronik inflamasyonu yönlendiren yolların ve kinetiklerin tanımlanması, HIV'li insanlar için tedavi seçeneklerinin ilerlemesi için kritik öneme sahiptir.
HIV-1'in P2X reseptörlerini doğrudan acıtırıp acıtmadığını değerlendirmek için P2XR aktivasyonu ve HIV-1 enfeksiyonu paralel olarak ölçülmelidir. P2XR aktivitesi ve HIV-1 enfeksiyonu tahlilleri bağımsız olarak belirlenmiştir: Hücresel kalsiyum akını P2XR aktivasyonunun bir göstergesidir ve HIV-1 üretken enfeksiyonu RNA bolluğu ile ölçülebilir. Fluo-4 kalsiyuma duyarlı boya ile kalsiyum akınının floresan tespiti mümkündür ve HIV-1 enfeksiyonu mCherry floresan muhabir virüsü HIV-NLCI11 , 12,13,14,15ile görselleştirilebilir.
P2X aktivasyonu (akut hücresel kalsiyum akını) ve HIV-1 enfeksiyonu (HIV-1 RNA sentezi) bu göstergeleri farklı zaman ölçeklerinde (dakikalara karşı günler) ortaya çıktığı için, P2XR aktivasyonu ve HIV-1 enfeksiyonunun eşleştirilmiş analizine izin veren yüksek verimli bir yöntem yoktur. Akış sitometrisi gibi standart yüksek verimli deneysel teknikler popülasyon analizine izin verir, ancak tek hücrelerde akut ve boyuna olaylar arasındaki ilişkiyi değerlendiremez. Alternatif olarak, standart floresan mikroskopi ile tek hücreli görüntüleme düşük verimdir. Bu deneysel sınırlamalar, akut ve boyuna hücresel olaylar arasındaki ilişkileri doğrudan ölçmek için yeni, yüksek verimli tekniklere ihtiyaç duymaktadır.
Açıklanan optofluidik sistem, tek hücreli sıralama ve izolasyon, kültleştirme, görüntüleme ve yazılım otomasyonu16 , 17,18,19. Bu sistem, geleneksel görüntüleme yöntemlerinin sınırlamalarına entegre, yüksek verimli bir alternatif sunar. Beacon platformu, bir çipin içerdiği hücreleri destekleyen bir karbondioksit (CO2)ve sıcaklık kontrollü inkübatörden oluşur. Çip, hedeflenen ışığa yanıt olarak elektriksel bir gradyan üreten ışığa duyarlı transistörlere sahiptir. Elde edilen bu dielektrofotik kuvvet, nanoakışkan çip boyunca tek tek hücreleri istenen bölgelere taşımak için kullanılır. Hücreler, tek tek hücreleri fiziksel olarak izole etmek için bir bariyer sağlayan çip üzerindeki kalemlere sıralanır. Çip boyunca sürekli laminer büyüme ortamı akışı, kalemlerden hücre göçlerini önlerken, besin maddelerinin ve deneye özgü reaktiflerin küçük parçacıklı difüzyonunu sağlar. Bir floresan mikroskobu çipin üzerinde bulunur. Yazılım otomasyonu, çipin görüntülerini kullanıcı tarafından belirtilen zaman noktasında yakalamak için kullanılır.
Tüm hücre karakterizasyonu, tek hücreli seçim ve manipülasyon için optofluidik bir sistem kullanılarak gerçekleştirildi. Bu sistem, tek hücreli manipülasyon, tahlil, kültür ve görüntüleme sağlayan entegre mekanik, mikroakışkan ve optik bileşenlerden oluşur. Hücreler, her biri alt nanoliter hacmini tutabilen 3.500 ayrı odadan (kalem) oluşan tek kullanımlık nanoakışkan cihaza yüklenir ve kültürlenir. Hücreler, hafif kaynaklı dielektrofoetik "kafesler" kullanılarak kalemlere yerleştirilecek ve sıcaklık ve CO2kontrollü koşullar altında kültürlenebilir. Mikroakışkanlar, hücre kültürü veya ilaç tedavisi için çip üzerindeki medya veya tamponların perfüzyonunu izin eder. Aktüasyonlu bir iğne, inkübe ve kepenkli kuyu plakalarından hücrelerin ithal ve ihracatına izin verir. Çip alanı, hücresel fenotipleri veya fonksiyonel analizi karakterize etmek için parlak alan ve floresan kanallarda (DAPI, FITC, TRed veya Cy5 dahil) 4x veya 10x büyütmede görüntülenebilir. Tüm sistem, önceden tasarlanmış iş akışları veya özel denemeler için kullanılabilecek yazılım kullanılarak otomatikleştirilmiştir.
HIV-1 enfeksiyonu ve P2XR arasındaki ilişkiler incelenmiştir, ancak bu etkileşimleri paralel olarak doğrudan karakterize etmek için yüksek verimli bir prosedür bildirilmemiştir. Burada yazarlar, akut kalsiyum akınını ve ardından hiv-1 üretken enfeksiyonunu tek hücre düzeyinde izleyerek HIV-P2XR etkileşimlerini incelemek için bir metodolojiyi açıklarlar. Özellikle, bu, tek hücrelerdeki birden fazla hedefin doğrudan, yüksek verimli, uzunlamasına ölçülmesine izin veren yeni bir araç oluşturur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Beacon Optofluidic System</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FIJI</td>
			<td colspan="2">Open-source software</td>
			<td>PMID: 22743772, 22930834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluo-4 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;F10489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;HIV-1 NLCINL4-3</td>
			<td colspan="2">Laboratory of Benjamin Chen</td>
			<td>PMID: 28148796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td colspan="2">GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>&#160;SV30010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MT-4 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent</td>
			<td></td>
			<td>&#160;ARP-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OptoSelect 3500 chip</td>
			<td>Berkeley Lights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Prism 9.0.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell characterization of calcium influx and hiv-1 infection using a multiparameter optofluidic platform

HIV-1, dünya çapında 37 milyondan fazla insanı etkileyen kronik bir enfeksiyona neden olur. İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile yaşayan insanlar antiretroviral tedaviye rağmen kronik inflamasyona bağlı komorbidiite yaşarlar. Bununla birlikte, bu enflamatuar sinyalizasyon tam olarak karakterize edilmiştir. Hücresel sinyal olaylarının aktivasyonu ve aşağı akış gen ekspresyasyonunda erken giriş olaylarının rolü tek hücre düzeyinde yakalanmamıştır. Burada yazarlar, canlı hücre floresan mikroskopisi ilkelerini, hücreleri kullanıcı tarafından özelleştirilmiş zaman kursları üzerinden kültürleyen ve dinamik hücresel süreçlerin yüksek verimli analizine izin veren otomatik bir tek hücreli platforma uygulayan bir yöntemi açıklar. Bu test, HIV-1 enfeksiyonunu hemen takip eden erken olayların tek hücreli canlı floresan mikroskopisini, özellikle virüse maruz kalmaya eşlik eden kalsiyum akınını ve floresan bir muhabir virüsü kullanarak üretken enfeksiyonun gelişmesini izleyebilir. MT-4 hücreleri kalsiyuma duyarlı bir boya ile yüklenir ve nanoakışkan bir cihazda izole kalemlerde kültürlenir. Kültürlü hücrelere HIV-1 muhabir virüsü (HIV-1 NLCI) bulaşır. Nanoakışkan cihazın üzerine yerleştirilmiş bir floresan mikroskobu, akut HIV-1 maruziyetini takiben 8 dakikalık bir zaman diliminde kalsiyum akınını ölçer. HIV-1 üretken enfeksiyonu aynı hücrelerde 4 günlük aralıklarla ölçülür. Bu zaman derslerinden elde edilen görüntüleme verileri, virüs konakçısı reseptör etkileşimlerini ve sinyal yolu dinamiklerini tanımlamak için analiz edilir. Yazarlar, tek hücreli sıralama, kültleştirme, görüntüleme ve yazılım otomasyonu yapabilen yeni bir optofluidik platform kullanarak geleneksel görüntüleme yöntemlerine entegre, ölçeklenebilir bir alternatif sunarlar. Bu tahlil, bir dizi parametreyi ölçerken hücre tipi, agonist veya antagonist etki de dahil olmak üzere çeşitli koşullar altında olayların kinetiğini ölçebilir. Bu, nanoakışkan yüksek verimli boyuna tek hücreli kültür ve görüntüleme için ilk kurulan yöntemdir: Bu teknik, hücresel sinyal kinetiği ve dinamik moleküler etkileşimleri incelemek için geniş ölçüde uyarlanabilir.

Şekil 1, floresan mikroskobu ile elde edilen çip ve ham görüntüleme verilerinin formatını göstermektedir. Enfekte olmayan ve enfekte olmuş hücrelerin mCherry ölçümü ile tanımlanması ve kümelenmesi Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu kümeler, HIV ile enfekte olmuş hücrelerde erken kalsiyum akınını gösteren Şekil 3'tekalsiyum akını kinetiği için analiz edilir. Şekil 4 kalsiyum a...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform at JoVE.com

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

Burada, nanoakışkan bir cihazda akut olaylar ve üretken HIV-1 enfeksiyonu için tek hücrelerin izlendiği bir protokol sunuyoruz. Görüntüleme verileri virüs konakçısı reseptör etkileşimlerini ve sinyal yolu dinamiklerini tanımlar. Bu, nanoakışkan yüksek verimli boyuna tek hücreli kültür ve görüntülemenin sinyal kinetik ve moleküler etkileşimleri incelemek için ilk yöntemidir.

Multiparametre Optofluidik Platform Kullanılarak Kalsiyum Akını ve HIV-1 Enfeksiyonunun Tek Hücreli Karakterizasyonu

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

Bu protokol tek hücreli düzeyde gerçek zamanlı kinetik yakalayabilir. HIV enfeksiyonuna yanıt olarak bireysel hücre parametrelerini ölçebilir ve erken sinyal olaylarını viral yaşam döngüsünün gecikmiş adımlarıyla ilişkilendirebiliriz. Bu, tek hücreli sıralama, kültleştirme, görüntüleme ve yazılım otomasyonu için yeni bir optofluidik platform kullanan geleneksel görüntüleme yöntemlerine entegre ölçeklenebilir bir alternatiftir.Bu nanoakışkan, yüksek verimli, boyuna tek hücreli kültür ve görüntüleme için ilk kurulan yöntemdir. Bu teknik, çeşitli hastalık durumlarında hücresel sinyal kinetiği ve dinamik moleküler etkileşimleri incelemek için yaygın olarak benimsenebilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, deneyin nasıl ayarlandırılacağını, hücrelerin optik olarak kalemlere nasıl sıralandırılacağını ve çip aracılığıyla infüzyonların nasıl kurulacağini iletmek için önemlidir.Başlamak için, 1,5 mililitrelik bir tüpe 25 mikrolitre 100X konsantre deterjan çözücü ve 1.000X Fluo-4 AM'nin 2,5 mikrolitresini ekleyerek taze Fluo-4 yükleme çözeltisi hazırlayın, ardından karıştırmak için girdap ekleyin. Pipet 2,5 mililitre kültür ortamı yükleme çözeltisine ve karıştırmak için ters çevirin. Üç dakika boyunca 500 kez G'de iki milyon MT-4 hücresini santrifüjleyin, ardından medyayı çıkarın ve peletin hazırlanan Fluo-4 yükleme çözeltisinin iki mililitresinde yeniden kullanın.Pipet hücreleri 35 milimetrelik petri kabına yeniden astı. 37 santigrat derecede 15 ila 30 dakika kuluçkaya yatırın, ardından oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika daha kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonu bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri üç dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin, ardından üstnatantı çıkarın.Hücre peletini kültür ortamının bir mililitresinde pipetleme ve üç dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yaparak yeniden ıslatın. En az 50 mikrolitre için mililitre başına iki milyon hücre konsantrasyonunda kültür ortamında pipetleme yaparak hücre peletini yeniden biriktirin. Hücre penelatmasını kolaylaştıran ıslatma solüsyonu ile bir çip hazırlamak için, iki mililitre ıslatma çözeltisi ve 50 mililitre deiyonize su içeren santrifüj tüplerini yeni bir optofluidik çip ile cihaza yükleyin ve çipi ıslatma çözeltisi ile dolduracak ıslak talaş işlevini çalıştırın.Çipi 50 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve çipi üç kez suyla yıkayın. Su yıkama yapıldıktan sonra, çipi 250 mikrolitrelik üç kültür ortamı döngüsüyle yıkayın. Hücrelerin çip kanallarına yapışma olasılığını azaltmak için yüklemeden önce her 100 parçadan F127 deterjanı ile önceki adımdan hücre süspansiyonu takviyesi.Yük işlemi ile 1,5 mililitre santrifüj tüpünden hücre ithal etmek ve beş mikrolitre hücre paketi hacmi için küçük hacimli içe aktarmak için cihaz dışa aktarma iğnesini kullanın. Tek hücreleri otomatik olarak algılayacak, bir OEP kafesi ile çevreleyecek ve yakındaki bir kaleme taşıyacak otomatik kalem işlevini kullanarak optimize edilmiş bir optoelektronik konumlandırma veya saniyede beş mikrometre kafes hızına sahip bir optoelektronik konumlandırma veya OEP voltajı kullanan kalem hücreleri. İlgi çekici hücreler otomatik kaleme almanın ardından kalırsa, hedef hücreleri ve hedef kalemi seçmek için el ile kalem işlevini kullanın.Peneleme tamamlandıktan sonra, kalan unpenned hücreleri çipten temizlemek için çipi 250 mikrolitrelik üç kültür ortamı döngüsüyle yıkayın. Hücreleri kaleme aldıktan sonra, temel Fluo-4, mCherry ve otofluoresansı ölçmek için FITC, Texas Red ve DAPI kanallarındaki hücrelerin floresan görüntülerini elde edin. Hiv-1'i mikroçip içine iki milyon hücre başına 13 nanogram HIV-1 NLCI konsantrasyonunda, süspansiyonu ihracat iğnesi aracılığıyla yavaşça çipe pipetleterek demleyin.HIV-1 ilavesinin hemen ardından FITC ve DAPI kanallarında 10 dakikalık bir zaman diliminde tekrar tekrar görüntü elde edin. Texas Red ve DAPI kanallarında enfeksiyon sonrası bir, iki, üç ve dört günlük görüntüler elde edin. Bu metodoloji, mCherry ölçümü ile HIV ile enfekte ve enfekte olmayan hücrelerin tanımlanması ve kümelenmesi için kullanılmıştır.mCherry sinyalinde 40.000 ortalama floresan yoğunluğundan daha büyük veya daha düşük bir değişime sahip hücreler sırasıyla mCherry yüksek veya mCherry düşük popülasyonunda kümelenmiştir. Bu kümeler, HIV ile enfekte olmuş hücrelerde erken kalsiyum akını gösteren dokuz dakikalık bir zaman kursunda Fluo-4 floresan kullanılarak hücre içi kalsiyum ölçümü yapılarak kalsiyum akını kinetiği açısından analiz edildi. Kalsiyum akını ile mCherry florescence arasında anlamlı pozitif korelasyon gözlendi.Bu prosedürü denerken, hem virüs üretimi hem de enfeksiyon için üstel büyüme aralığındaki hücrelerle başlamayı hatırlamak önemlidir, çünkü aşırı büyümüş hücreler bu testten gelen sinyalde önemli bir azalmaya neden olacaktır. HIV-1 ile çalışmak tehlikeli olabilir. Bu nedenle, bu işlem yapılırken OSHA Kan Bazlı Patojen Standardında belirtilen BSL-2 uygulamaları her zaman alınmalıdır.Bu teknik heyecan vericidir, çünkü kontrollü koşullar altında tek hücreli fenotipik veya transkripsiyonik değişiklikleri incelememize izin verecektir. Bu, uyaranların birçok hücre tipinde moleküler yollar üzerindeki etkisini ilişkilendiren geniş bir potansiyele sahiptir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Yeşil Floresan Protein ifade Rev-bağımlı lentiviral Vector kullanarak HIV-1 Olumlu Hücreler Özgül İşareti

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Bir Genotipik Yöntemi&#39;ne Dizi Analizi ile HIV-1 coreceptor Kullanımı (tropizm) Tahmin

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Ölçümü<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...