Name: retinal pigment epithelium transplantation in a non-human primate model for degenerative retinal diseases
Uploaded: 2021-06-14T13:45:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases at JoVE.com

Diese Studie wurde unterstützt von IAF-PP (HMBS Domain) (OrBID): OculaR BIomaterials and Device, A*STAR, Singapur (H17/01/a0/013), dem NUS Start-up Grant NUHSRO/2016/100/SU/01, NUHS Clinical Scientist Program (NCSP) Grant und National Research Foundation Competitive Research Programme, Singapur (NRF-CRP21-2018-0008) an X.S., Hong Leong Endowed Professorship Funds an G.E.H. und B.V.S. Wir möchten dem Veterinärteam der Translational Pre-Clinical Model Platform (Singapore Eye Research Institute, Singapur) für die Unterstützung bei der Vorbereitung von NHP-Operationen und der Tiernachsorge danken. Wir danken Jill Teo und den Kollegen von C. Zeiss Meditec Singapore für die technische Unterstützung des OPMI-Lumera 700 mit integriertem intraoperativem OCT-Gerät.

Boris Stanzel besitzt ein US-Patent 9980851 auf einem Instrument (RPE-Abstreifer), das in dieser Studie verwendet wird. Ehrenredner von C. Zeiss Meditec und Geuder bis Boris Stanzel. Die anderen Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Es gibt zwei Hauptansätze, die für die submakuläre RPE-Transplantation evaluiert werden - die Injektion einer RPE-Suspension und die Transplantation eines monoschichtigen RPE-Transplantats. Ein detaillierter Vergleich zwischen den beiden Methoden würde den Rahmen dieses Manuskripts sprengen. Die Transplantation eines monoschichtigen RPE-Transplantats kann jedoch vorteilhaft sein, da die RPE-Zellen in einer Monoschicht besser organisiert sind als in einer Suspension. RPE-Zellen im Transplantat sind in einer konfluenten Monoschicht organisiert, die der Organisation der physiologischen RPE-Zellschicht ähnelt und es den transplantierten RPE-Zellen ermöglicht, ihre physiologischen Funktionen auszuführen. Dies ermöglicht präzisere Dosierparameter im Vergleich zu Zellsuspensionen, was für regulatorische Arbeiten und industrielles Scale-up von hoher Relevanz ist.
Die Abgabe des RPE-Pflastertransplantats in den subretinalen Raum erfordert eine sorgfältige Manipulation der Makula und eine genaue Einführung des Transplantats in den subretinalen Raum. Technologische Fortschritte in der Mikrochirurgie, wie miOCT, und ein besseres Verständnis der intraoperativen retinalen Gewebedynamik haben die Lernkurve dieses Verfahrens verkürzt. In dieser Diskussion werden die Gründe für die folgenden Aspekte erläutert: i) präoperative Plasminogeninjektion; ii) die Verwendung von intraoperativem miOCT; iii) die Verwendung einer kundenspezifischen 41 G Doppelrohrkanüle, niedrige IOD-Einstellungen und PFCL für die subretinale Bleb-Erstellung; iv) Abkratzen der nativen RPE-Zellschicht vor der Transplantation; v) die Verwendung von Sirolimus, Triamcinolon, Doxycyclin und Minocyclin zur Verringerung der immunogenen Transplantatabstoßung.
Präoperative Plasminogen-Injektionen setzen parafoveale retinale Adhäsionen frei In den ersten Experimenten war es eine Herausforderung, die Fovea mit einer einzigen Flüssigkeitswelle zu lösen. Bei der Beurteilung mit miOCT zeigten die Bilder das Vorhandensein von parafovealen äußeren netztinalen Adhäsionen an der nativen RPE zusammen mit Hinweisen auf ein intraretinales Trauma20. Diese Adhäsionen könnten zu einer vertikalen Ausdehnung des Bleb geführt haben, anstatt dass sich die subretinale Flüssigkeitswelle über die Netzhautkontur ausbreitet, was zu einem Fovealtrauma führte. Plasminogen ist die inaktive Vorstufe von Plasmin, einer Protease, die auf Fibronektin und Laminin abzielt. Ocriplasmin ist eine biotechnologisch hergestellte Variante des menschlichen Plasmins, die von der Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittel-Agentur (EMA) für die Behandlung der symptomatischen vitreomakulären Traktion mit oder ohne begleitendes Makulaloch zugelassen ist. Berichte nach der Zulassung über die Entwicklung eines zystoten Makulaödems nach der Injektion von Ocriplasmin deuten jedoch auf eine umfassendere Wirkung des Enzyms auf die Netzhaut hin23.
Obwohl die genauen Mechanismen nicht identifiziert wurden, wurde vermutet, dass Plasmin die retinale Adhäsion durch den Abbau der Interphotorezeptormatrixelemente, die für die Photorezeptor-RPE-Adhäsion verantwortlich sind, schwächen könnte24. In diesem Protokoll wurden NHP-Augen 1 Woche vor der Operation mit intravitrealem Plasminogen behandelt, um die parafovealen äußeren netztinalen Adhäsionen freizusetzen. Unter der Annahme, dass die Photorezeptor-RPE-Adhäsion geschwächt ist, ist eine geringere Kraft erforderlich, um die neurosensorische Netzhaut zu lösen, einschließlich des distalen parafovealen Rings, der typischerweise der subretinalen Flüssigkeitswelle widersteht20. Daher führt die Kraft, die während der Retinalablösung verabreicht wird, zur Ausdehnung der Blase über die Netzhautkontur, anstatt die Netzhaut tangential zu dehnen. Dies reduziert das Risiko von Fovealrissen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Wirkung von Plasminogen auf das langfristige Überleben von Transplantaten in diesem Protokoll nicht untersucht wurde. Zukünftige Studien sollten versuchen, diesen Effekt zu bestimmen.
miOCT bietet anatomisches Feedback zur Steuerung der subretinalen Blebbildung, der Transplantatimplantation und der subretinalen Flüssigkeitsdrainage Die intraoperative, atraumatische Manipulation der Makula ist der Schlüssel zu guten Transplantationsergebnissen. Mikrostrukturelle Veränderungen der Makula im Zusammenhang mit der Manipulation sind jedoch auf dem Operationsmikroskop möglicherweise nicht immer offensichtlich. Bei solchen Verfahren ist die miOCT ein wichtiges Werkzeug, das eine dreidimensionale, intraoperative Rückmeldung der Makulastruktur in Echtzeit liefert. miOCT ist besonders nützlich bei den Schritten fovealer Ablösung, Transplantatimplantation und Drainage der subretinalen Flüssigkeit unter Verwendung eines Flüssigkeits-Luft-Austauschs. Während der Fovealablösung kann miOCT die vertikalen und horizontalen Abmessungen des Bleb bestimmen. Foveale Mikroteare, die auf dem Operationsmikroskop möglicherweise nicht eindeutig sichtbar sind, können durch miOCT bestätigt werden (Abbildung 3). Während der Implantation des Transplantats zeigen miOCT-Bilder die Lage des Transplantats oder die Nähe zur Fovea durch die oft weniger transparente, abgelöste Netzhaut. miOCT kann auch mögliche Bereiche der retinalen Adhäsion während eines schwierigen Transplantationsprozesses hervorheben25. Schließlich kann miOCT im subretinalen Flüssigkeitsdrainageprozess die subretinale Flüssigkeitsdrainage zuverlässig steuern, bis ein vollständiger Retina-RPE-Transplantatkontakt erreicht ist.
Die Kombination aus einer Dual-Bore-Kanüle, niedrigen IOD-Einstellungen und PFCL-Glaskörpertamponade reduziert synergistisch das Makulatrauma während der subretinalen Blebbildung Tangentiale Netzhautdehnung und Flüssigkeitsturbulenzen können während der subretinalen BSS-Injektion zur Fovealablösung auftreten, die zu unerwünschten Fovealrissen führt. Um diesen Phänomenen entgegenzuwirken, haben sich Faktoren wie die relative Position und der Abstand vom Fovealzentrum, in dem die Injektion eingeleitet wird, Das Injektionsvolumen und die Injektionsgeschwindigkeit, die Glaskörpertamponade, die Wahl der subretinalen Instrumentierung und der IOD als relevant erwiesen20,26,27. Der subretinale Bleb für die Fovealablösung sollte sich an einem Ort befinden, der ausreichend von der Fovea entfernt ist, da die Netzhautdehnung an der Injektionsstelle der Bleb am höchsten sein kann27. Der IOD sollte auch während der gesamten Entstehung des subretinalen Bleb niedrig gehalten werden. Wenn der IOD des Auges hoch ist, wird eine höhere vertikale Zunahme der Bleb-Größe beobachtet als eine Ausdehnung entlang der Kontur der Netzhaut, während blebs bei niedrigeren Drücken flacher sind20. Obwohl eine intravitreale Injektion von 50 μL den IOD beim Menschen effektiv verdoppeln wird28, wird der IOD-Anstieg während der subretinalen Injektion angesichts der kürzeren Augenlänge bei NHPs wahrscheinlich höher und schneller sein als beim Menschen. Während sich die meisten Vitrektomiegeräte an die IOD-Fluktuation anpassen, ist die Anpassung kein gleichzeitiger, sondern ein reaktiver Prozess, der auftritt, wenn die subretinale Injektion fortschreitet. Je höher also der IOD, desto höher ist das Risiko einer Netzhautüberdehnung und eines daraus resultierenden Fovealtraumas. Daher ist es wichtig, während der subretinalen Injektion einen stabil niedrigen IOD aufrechtzuerhalten.
Für die subretinale Injektion wird eine handelsübliche 20/41 G (DORC) oder eine maßgefertigte 25/41 G Dual-Bore Subretinalkanüle empfohlen. Die Kanüle ermöglicht es Flüssigkeit, die Glaskörperhöhle im Austausch für BSS zu verlassen, das in den subretinalen Raum injiziert wird. Dies gewährleistet die "gleichzeitige" Regulierung des IOD während der subretinalen Injektion. Ein Schema der Doppelrohrkanüle ist in Abbildung 2 zu sehen. Schließlich wird PFCL verwendet, um das Risiko von Fovealrissen zu reduzieren20,26,27. Da PFCLs, wie Octalin, ein höheres spezifisches Gewicht haben, üben sie während der Fovealablösung eine Abwärtskraft auf die Netzhaut aus29. Dies stabilisiert den Fovealabsorptions-Bleb-Erstellungsprozess weiter und verbessert die Ausdehnung der Bleb entlang der Netzhautkontur. Diese Technik wurde erfolgreich für die subretinale Injektion von rtPA bei massiven submakulären Blutungen aufgrund von nAMD30 eingesetzt.
Die Entfernung von nativem RPE vor der Transplantation ermöglicht die Wiederherstellung des RPE-Photorezeptorkomplexes Wirts-RPE sollte vor der Transplantattransplantation entfernt werden. Dies liegt daran, dass die Wiederherstellung des RPE-Photorezeptorkomplexes erforderlich ist, damit das RPE-Transplantat seine physiologischen Funktionen zur Unterstützung der Photorezeptoren erfüllen kann21. Die Host-RPE kann, wenn sie nicht entfernt wird, als mechanische Barriere fungieren, die die Wiederherstellung dieses Komplexes verhindert. Es kann entweder durch die Verabreichung von RPE-toxischen Chemikalien oder durch physikalische Entfernungsmittel entfernt werden. Chemische Entfernungsmethoden umfassen die systemische oder subretinale Verabreichung von Natriumjodat31,32. Da Natriumjodat bei Verabreichung eine weit verbreitete Degeneration von Photorezeptoren, RPE-Zellen und Choriocapillaris verursacht, schließt seine netztinale und systemische Toxizität seine Verwendung für Studien am Menschen aus32,33. Daher werden physikalische intraoperative Techniken bevorzugt. Verschiedene physikalische Methoden wurden konzeptualisiert. Bei physikalischen Methoden ist es entscheidend, dass die Bruch-Membran unbeschädigt bleibt. Viele In-vitro-Studien haben die Abhängigkeit des RPE-Transplantatüberlebens von einer intakten Bruch-Membran gezeigt34,35,36.
Versuche eines hydraulischen Debridements waren mit Brüchen in der Bruch-Membran, einer erhöhten Rate der epiretinalen Membranentwicklung und einer proliferativen Vitreoretinopathie verbunden, was zu einer traktionalen Netzhautablösung führte37. Ein diamantbestaubter Spatel, der für das RPE-Debridement vorgeschlagen wurde, führte ebenfalls zu Brüchen in der Bruch-Membran, was zu einer zellulären Proliferation von der Aderhaut in den subretinalen Raum führte38. Interessanterweise könnte ein speziell angefertigtes ausziehbares Loop-Instrument die darüber liegende RPE unter Beibehaltung der Bruch-Membran in den Augen von Kaninchen und Schweinen entfernen11,39. Die Entfernung der zugrunde liegenden RPE ist auch nützlich, um Tiermodelle mit RPE und äußerer Netzhautatrophie zu etablieren, ähnlich der fortgeschrittenen atrophischen Form der AMD. Wenn ein fokaler Bereich von RPE aus der Makula entfernt wird, schließt sich die RPE-Wunde über die Hypertrophie der verbleibenden RPE-Zellen. Diese Wundheilungsreaktion ist jedoch mit einer Atrophie der äußeren Kernschicht verbunden40. Während die Erstellung eines Tiermodells den Rahmen dieses Manuskripts sprengen würde, kann ein ähnliches Verfahren ein Tiermodell eines fortgeschrittenen atrophischen AMD-Phänotyps für die Prüfung von RPE-abgeleiteten Zelltherapeutika erstellen.
Die Verwendung von Sirolimus, Triamcinolon, Doxycyclin und Minocyclin zur Verringerung der immunogenen Transplantatabstoßung Es wird angenommen, dass der subretinale Raum eine immunprivilegierte Stelle ist, die durch eine intakte Blut-Netzhaut-Barriere und andere Faktoren aufrechterhalten wird41. In vielen Studien zur subretinalen Transplantation von Stammzellderivaten mit einer intakten Blut-Netzhaut-Schranke spielen Immunsuppressiva eine vernachlässigbare Rolle beim Überleben des Transplantats42. Es wird angenommen, dass die äußere Blut-Netzhaut-Barriere durch die native RPE-Schicht und die Tight Junctions zwischen den RPE-Zellen gebildet wird. Während die native RPE-Entfernung eine bessere Integration der transplantierten RPE- und Wirtsphotorezeptoren ermöglicht, wird die Blut-Netzhaut-Barriere dabei gestört, was die Wahrscheinlichkeit einer Immunabstoßung erhöht. Klassischerweise sind T-Zellen von zentraler Bedeutung für den Prozess der Transplantatabstoßung anderer Organe wie Niere und Leber43. Daher zielten die anfänglichen immunsuppressiven Therapien für die Transplantation von Netzhautgewebe darauf ab, diese adaptiven Immunantworten zu reduzieren.
Sirolimus, ein mechanistisches Ziel des Rapamycin-Inhibitors, und Tacrolimus, ein Calcineurin-Inhibitor, sind Beispiele für immunsuppressive Medikamente, die auf adaptive Immunantworten abzielen. Trotz ausreichender T-Zell-Suppression bleiben die Überlebensraten der Transplantate jedoch niedrig. Darüber hinaus ist bekannt, dass RPE-Zellen die T-Zell-Aktivierung durch die Freisetzung hemmender Faktoren unterdrücken und die Bildung von regulatorischen T-Zellen fördern44. Daher wird immer deutlicher, dass die adaptive Immunität möglicherweise nicht der einzige Beitrag zur Transplantatabstoßung ist42. Die subretinale Transplantation zellulärer Produkte kann zur Akkumulation und Aktivierung von Mikroglia führen45.
Mikroglia sind die Makrophagen der Netzhaut. Sie bestehen aus zwei Hauptpopulationen: 1) den perivaskulären Mikroglia des inneren retinalen Gefäßsystems und 2) den Mikroglia innerhalb des retinalen Gewebeparenchyms. Da Mikroglia Teil der angeborenen Immunantwort sind, können intravitreale Glukokortikoide wie Triamcinolon die zytokinvermittelte Proliferation unterdrücken46. Doxycyclin und Minocyclin können auch die Mikroglia-Aktivierung unterdrücken und sollten in Betracht gezogen werden47,48. Schließlich sind die Unterschiede in der Immunabstoßung von RPE-Allotransplantaten im Vergleich zu Xenotransplantaten unvollständig verstanden49. Zum Beispiel wurden Alloantikörper gegen induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete RPE-Zellen im Serum von In-vivo-Immunabstoßungsmodellen berichtet. Die Rolle dieser Antikörper und die Bedeutung der Antikörper-vermittelten Abstoßung für das Überleben des Transplantats bleibt jedoch unbekannt50. Daher wird ein Multidrug-Regime unter Verwendung von Sirolimus zur Unterdrückung der adaptiven Immunität und einer Kombination aus Triamcinolon, Doxycyclin und Minocyclin zur unterdrückung der angeborenen Immunität vorgeschlagen. Dieses Regime wurde erfolgreich bei Kaninchen mit guten Überlebensergebnissen bei Transplantaten und minimalen systemischen Wirkungen angewendet11.
Einschränkungen dieser Operationstechnik Dieses Papier beschreibt eine mögliche chirurgische Methode, um ein RPE-Transplantatblatt in den subretinalen Raum von NHP zu liefern; Dies bedeutet jedoch nicht, dass dies der einzige optimierte Weg ist. Verschiedene Vitreo-Netzhautchirurgen können andere Präferenzen für Instrumentierung und Technik haben. Zum Beispiel kann dieses Implantationsgerätdesign nur flache Implantate liefern, die mit einem steiferen Zellträger unterstützt werden, und ist daher möglicherweise nicht für relativ flexible (oder gerollte) Implantate geeignet. RPE-Suspensionstransplantationen können einen Großteil dieser Technik weglassen. Dementsprechend müssen chirurgische Details basierend auf jeder Verabreichungsstrategie geändert werden.
Da das Interesse an zellulären Therapeutika zur Behandlung degenerativer Netzhauterkrankungen weiter zunimmt, wird das NHP-Tiermodell in präklinischen Studien für die Untersuchung der Faktoren, die das Überleben von RPE-Transplantaten beeinflussen, von entscheidender Bedeutung sein. In diesem Manuskript werden Strategien vorgeschlagen, um die reibungslosere Abgabe eines submakulären Monolayer-RPE-Transplantats im NHP-Auge zu ermöglichen. Methoden zur besseren Visualisierung intraoperativer Komplikationen werden ebenfalls empfohlen. Es wird erwartet, dass sich diese Methoden weiter verbessern werden, wenn der Einsatz von Zelltherapeutika zunimmt. Zukünftige Methodenpapiere sollten auch in Betracht ziehen, eine umfassende Liste von Untersuchungen vorzuschlagen, um verschiedene strukturelle und funktionelle Aspekte des Transplantats zu bewerten.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62638">Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8 
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 
4Singapore Eye Research Institute (SERI), 
5UCL Institute of Ophthalmology, 
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 
8Department of Ophthalmology, University of Bonn 
* These authors contributed equally
to:
Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8 
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore 
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) 
4Singapore Eye Research Institute (SERI), 
5UCL Institute of Ophthalmology, 
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 
8Department of Ophthalmology, University of Bonn 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62638">Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Die RPE-Transplantation ist vielversprechend für die Behandlung von erblichen und erworbenen degenerativen Netzhauterkrankungen. Zu diesen Erkrankungen gehören Retinitis pigmentosa (RP, Stäbchen-Zapfen-Dystrophie) und fortgeschrittene Formen der AMD wie GA. Insgesamt stellen diese Erkrankungen einen signifikanten Anteil der derzeit nicht behandelbaren Blindheit weltweit dar1,2. Die fortgeschrittenen Stadien der AMD werden in neovaskuläre AMD (nAMD) und GA eingeteilt. Während es wirksame Behandlungsmöglichkeiten für nAMD gibt, wie z.B. Anti-Vaskuläre Endothel-Wachstumsfaktor-Injektionen (Anti-VEGF), haben Patienten mit GA nur begrenzte Behandlungsmöglichkeiten. RP ist eine sehr heterogene Gruppe von vererbten Netzhauterkrankungen, die durch eine fortschreitende retinale Photorezeptordegeneration gekennzeichnet sind. Bei einigen Patienten befindet sich der ursächliche genetische Defekt innerhalb der RPE und nicht in den Photorezeptoren; Daher kann die RPE-Ersatztherapie eine alternative Strategie sein, wenn eine Gentherapie nicht durchführbar ist.
Es besteht ein erhebliches Interesse an der Entwicklung wirksamer Behandlungen für diese Erkrankungen. Insbesondere die RPE-Transplantation hat als potenzieller therapeutischer Ansatz an Zugkraft gewonnen3,4,5,6,7,8. Seit den ersten Berichten über RPE-Transplantationen in den 1980er Jahren9 hat sich das Feld um verschiedene RPE-Zellquellen, Lieferstrategien und experimentelle Modelle von Krankheit und Transplantation erweitert10,11,12,13,14. Unter den verschiedenen Tiermodellen hat nur das NHP eine "Makula lutea" mit einer "Fovea centralis", einer anatomischen Spezialisierung am hinteren Pol der Netzhaut, die mit dem Menschen geteilt wird. Die Fovea enthält eine sehr hohe Dichte an Kegel-Photorezeptoren, die ein hochauflösendes zentrales Sehen ermöglichen15. Das NHP hat auch eine ähnliche genomische und proteomische Zusammensetzung16 im Vergleich zum Menschen. Diese Ähnlichkeiten machen es zu einem wichtigen und geeigneten Tiermodell für die Untersuchung von Augenerkrankungen, die die menschliche Netzhaut betreffen17,18.
Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur submakulären Transplantation eines RPE-Xenotransplantats, unterstützt durch einen PET-Zellträger, in immunsupprimierte NHPs. Eine transvitreale Technik zur subretinalen RPE-Transplantation bei Kaninchen wurde in einem früheren Manuskript beschrieben19. Bei NHPs erfordert das Vorhandensein der Fovea jedoch während der intraoperativen Manipulation besondere Vorsicht20. Insbesondere besteht ein hohes Risiko für einen Fovealriss, wenn subretinale Flüssigkeitsinjektionsmethoden eine übermäßige Kraft auf die Netzhaut erzeugen20. Der Schwerpunkt dieses Manuskripts liegt daher auf Strategien zur Verringerung des Risikos eines unbeabsichtigten Fovealtraumas bei NHP.
Dazu gehören der Einsatz der präoperativen intravitrealen Plasminogeninjektion zur Freisetzung parafovealer Adhäsionen und die intraoperative chirurgische mikroskopintegrierte optische Kohärenztomographie (miOCT) zur Echtzeit-Visualisierung der fovealen Anatomie. Eine maßgeschneiderte 25/41 G Dual-Bore Subretinalkanüle mit intraokularer PFCL-Tamponade unter niedrigen IOD-Einstellungen wird vorgeschlagen, um einen kontrollierteren Prozess der Fovealablösung zu ermöglichen. Darüber hinaus wird vor der Implantation eine chirurgische Entfernung der nativen RPE empfohlen, um eine bessere Integration zwischen den transplantierten RPE-Zellen und den Wirtsphotorezeptoren zu ermöglichen. Schließlich wird ein peri- und postoperatives systemisches Immunsuppressionsprotokoll für NHP-Modelle beschrieben, um das Überleben des RPE-Xenotransplantats nach der Transplantation zu verbessern11,21.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Mydriacyl (Tropicamide 1.0%) Sterile Ophthalmic preparation</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>SIN 4715P</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800598</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Mydfrin (Phenylephrine hydrochloride) Ophthalmic solution</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>No. 01785</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G AWH Vivid Chandelier</td>
			<td>Synergetics</td>
			<td>56.54.25P</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Ga Bi-Blade Vitreous Cutter Combined Wide-Field Stellaris Elite Pack</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>SE5525WVB</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMO ENDOSOL Balanced Salt Solution for ophthalmic irrigation</td>
			<td>Abbott Medical Optics</td>
			<td>15020</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-minocycline</td>
			<td>Apotex Inc</td>
			<td>2084104</td>
			<td>Immunosuppression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUROVISC - Hypromellose Ophthalmic Solution USP 2% w/v</td>
			<td>Aurolab</td>
			<td>TN 00002387</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave MELAG, Vacuklav</td>
			<td>MELAG</td>
			<td>1131-B2300</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autostainer XL (ST5010)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>2433</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced Saline Solution</td>
			<td>Beaver Visitec</td>
			<td>581732</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Bud</td>
			<td>WINNER MEDICAL</td>
			<td>1NA6-100</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnosys Espion E3 Console</td>
			<td>Diagnosys</td>
			<td>272</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Yung Shin</td>
			<td>MAL 19950403AEZ</td>
			<td>Immunosuppression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.15935.0100</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERG-Jet contact lens electrodes</td>
			<td>Fabrinal</td>
			<td>F-06</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extendable PolyTip Cannula 25 G/38 G</td>
			<td>MedOne</td>
			<td>3247</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexTip Brush (25 g) 1.5 mm</td>
			<td>MedOne</td>
			<td>3222</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceine 10% Faure</td>
			<td>Curatis AG</td>
			<td>5030376</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Swab</td>
			<td>WINNER MEDICAL</td>
			<td>1NP3275</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton gas tight syringe 250 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81101</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg Spectralis HRA + OCT Computer System</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Gill II</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>3801520</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope eclipse Ti-E main body (100-240V)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>33131</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin injection</td>
			<td>Ceva</td>
			<td>37711/58317</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium carbonate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.05680.0250</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monkey plasminogen</td>
			<td>Molecular Innovations</td>
			<td>SKU-CYPLG</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-contact wide angled 128 degree fundus lens</td>
			<td>C. Zeiss Medtech</td>
			<td>Resight 700</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven Ophthalmic Drape</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>8065103120</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Corneal/Scleral V-Lance Knife 20 G</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>8065912001</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Embedding Station</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150 H</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast High Melt Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601095</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxin B</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.15935.0025</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepowdered Surgical Gloves</td>
			<td>MAXITEX</td>
			<td>85-173-2/85-173-3/85-173-4</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRODINE Povidone-Iodine Solution BP</td>
			<td>ICM PHARMA</td>
			<td>PMLBLP20-01</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Righton Slit Lamp Model MW50D (RAA133CB)</td>
			<td>Righton-Oph</td>
			<td>5200162</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safil Polyglycolic acid, braided, coated, absorbable surgical suture 7/0</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>G1048711</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHINCORT I.M. INJ. Triamcinolone Acetonide 40 mg/mL</td>
			<td>Yung Shin</td>
			<td>SHI40 SGP-2610015-001</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-Use Hypodermic Needle 21 G</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4657527</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-Use Hypodermic Needle 23 G</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4657667</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sirolimus</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>SIN12034P</td>
			<td>Immunosuppression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel subdermal needle electrode</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>F-E2</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellaris Elite vision enhancement system</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>BL15455</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 27 G 12 mm</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4665406</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 30 G 12 mm</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4656300</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gown + 2 Hand Towels</td>
			<td>STERIL</td>
			<td>APP10 00 01</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm Film</td>
			<td>3M</td>
			<td>1626W</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TERUMO Syringe 1 cc/mL Luer SlipTip with needle 26 G</td>
			<td>Teruma</td>
			<td>SS-01S</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TERUMO Syringe 3 cc/mL Luer LockTip</td>
			<td>Teruma</td>
			<td>SS-03L</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TERUMO Syringe 5 cc/mL Luer LockTip</td>
			<td>Teruma</td>
			<td>SS-05L</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TobraDex (Tobramycin, Dexamethasone) Sterile Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>No. 01577</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topcon Retinal Camera TRC-50DX</td>
			<td>Topcon</td>
			<td>948605</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>GB41789155517</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazil-20</td>
			<td>Ilium</td>
			<td>38653/50276</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Opmi Rescan 700</td>
			<td>Carl Zeiss Meditec AG</td>
			<td>7210</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pigment epithelium transplantation in a non-human primate model for degenerative retinal diseases

Die retinale Pigmentepitheltransplantation (RPE) ist vielversprechend für die Behandlung von vererbten und erworbenen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut. Zu diesen Erkrankungen gehören Retinitis pigmentosa (RP) und fortgeschrittene Formen der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), wie z. B. geografische Atrophie (GA). Zusammen machen diese Störungen einen signifikanten Anteil der derzeit nicht behandelbaren Blindheit weltweit aus. Diese ungedeckten medizinischen Bedürfnisse haben ein erhöhtes akademisches Interesse an der Entwicklung von Methoden des RPE-Ersatzes geweckt. Unter den Tiermodellen, die üblicherweise für präklinische Tests von Therapeutika verwendet werden, ist der nicht-menschliche Primat (NHP) das einzige Tiermodell, das eine Makula hat. Da es diese anatomische Ähnlichkeit mit dem menschlichen Auge teilt, ist das NHP-Auge ein wichtiges und geeignetes präklinisches Tiermodell für die Entwicklung von Arzneimitteln für neuartige Therapien (ATMPs) wie der RPE-Zelltherapie.
Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur submakulären Transplantation einer RPE-Monoschicht, kultiviert auf einem Polyethylenterephthalat (PET)-Zellträger unterhalb der Makula auf eine chirurgisch erzeugte RPE-Wunde in immunsupprimierten NHPs. Die Fovea - der zentrale avaskuläre Teil der Makula - ist der Ort der größten mechanischen Schwäche während der Transplantation. Foveal trauma tritt auf, wenn die anfängliche subretinale Flüssigkeitsinjektion eine übermäßige Kraft auf die Netzhaut erzeugt. Daher wird eine langsame Injektion unter Perfluorcarbon liquid (PFCL) Glaskörpertamponade mit einer subretinalen Injektionskanüle mit zwei Bohrungen bei niedrigem Augeninnendruck (IOD) empfohlen, um einen netztinalen Bleb zu erzeugen. 
Eine Vorbehandlung mit einer intravitrealen Plasminogen-Injektion zur Freisetzung parafovealer RPE-Photorezeptor-Adhäsionen wird ebenfalls empfohlen. Diese kombinierten Strategien können die Wahrscheinlichkeit von Fovealrissen im Vergleich zu herkömmlichen Techniken verringern. Das NHP ist ein wichtiges Tiermodell in der präklinischen Phase der RPE-Zelltherapieentwicklung. Dieses Protokoll adressiert die technischen Herausforderungen, die mit der Verabreichung der RPE-Zelltherapie im NHP-Auge verbunden sind.

Die multimodalen Bildgebungsmodalitäten (Fundusfotografie, Fundus-Autofluoreszenz-Bildgebung (FAF), Fundus-Fluorescein-Angiographie (FFA)-Frühphase und Spätphase sowie optische Kohärenztomographie (OCT)) heben die Merkmale einer erfolgreichen submakularen RPE-Transplantat hervor (Abbildung 1). Fundusfotografie zeigt die Positionierung des RPE-Transplantats an der Fovea ohne Migration im Laufe der Zeit. Die FAF-Bildgebung zeigt minimale Veränderungen in der Hyper-Autofluoreszenz (demonstriert durch weiße, hochintensive Bereiche), die das RPE-Transplantat überlappen. Früh- und Spätphasen-FFA zeigen keine offensichtliche Leckage (nachgewiesen durch weiße, hochintensive Bereiche, die sich mit der Zeit vergrößern) um das RPE-Transplantat herum. Erste Bilder an Tag 3 zeigen einen Fensterdefekt aufgrund der Entfernung von nativem RPE vor der Transplantatimplantation. Makula-OCT-Bilder zeigen die Erhaltung der äußeren Netzhautschichten (insbesondere der Photorezeptorschicht) über dem RPE-Transplantat im Laufe der Zeit. Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung zeigt intakte Netzhautschichten ohne Anzeichen von Mikrotearen. Die Erhaltung der äußeren Kernschicht über den Peripherien des Transplantats deutet darauf hin, dass die RPE-Zellen ihre physiologischen Funktionen zur Aufrechterhaltung der Gesundheit des Photorezeptors erfüllen.
Die intraokularen und externen Ansichten der 25/41 G Dual-Bore-Kanüle zeigen den Mechanismus, durch den der IOD während der subretinalen Injektion gesteuert wird (Abbildung 2). BSS tritt während der subretinalen Flüssigkeitsinjektion über die zentrale längere Kanüle in den subretinalen Raum ein. Signifikante Erhöhungen des Augeninnendrucks führen dazu, dass das BSS in der Glaskörperhöhle das Auge über die größere Metallbohrung der Kanüle verlässt. BSS reist dann entlang der Kanüle und wird schließlich aus dem Ausgangshafen in der Nähe des Kanülenhubs ausgestoßen. Um zu beurteilen, ob die Kanüle wie erwartet funktioniert, stellen Sie sicher, dass Flüssigkeit aus dem Ausgangsanschluss in der Nähe des Kanülenhubs fließt.
Die miOCT ermöglicht die Visualisierung der Bleb-Dimensionen und eines möglichen Fovealrisses intraoperativ während der Fovealablösung (Abbildung 3). Abbildung 3A1-A3 zeigt einen Fall von Bleb mit einem Fovealriss. In Abbildung 3A1 ist die untere Blase zwar unter dem Operationsmikroskop sichtbar, die Visualisierung des Risses jedoch schwierig. Abbildung 3A2 zeigt den Längsschnitt eines Bleb ohne Risse. Abbildung 3A3 zeigt einen Fovealriss bei der Beurteilung des vertikalen Abschnitts der Bleb. Abbildung 3B1-B3 zeigt einen erfolgreich erzeugten Bleb ohne das Vorhandensein von Tränen.
Das Fehlen einer signifikanten Verschlechterung der ERG-Wellenformen deutet darauf hin, dass die globale Funktion sowohl der Stäbchen- als auch der Zapfen-Photorezeptoren mit subretinalen RPE-Xenotransplantaten aufrechterhalten wird (Abbildung 4). Die ERG-Wellenformen zeigen die Gesamtfunktion der Netzhaut. Insbesondere sollte auf die A-Wellen geachtet werden, um einen Verlust der Photorezeptorfunktion zu bestimmen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig01.jpg"> Abbildung 1: Postoperative In-vivo-Analyse mit multimodaler Bildgebung. (A) In-vivo-Bildgebung der submakulären RPE-Transplantattransplantation des linken Auges (gelb auf Fundusfotografie) auf verschiedenen Bildgebungsmodalitäten (von links nach rechts Spalten: Fundusfotografie, Autofluoreszenz, Fundusfluorescein-Angiographie-Frühphase, Fundusfluorescein-Angiographie-Spätphase, optische Kohärenztomographie) für Zeiträume bis zu 3 Monaten (obere bis untere Reihen: Tage 3, 14; Monate 1, 3). Das Sternchen auf dem Fundusfoto zeigt den Ort der Retinotomie an; der weiß gestrichelte Pfeil zeigt die Richtung des Zeilenscans an. Die gelb gezeichnete Form auf der Fundus-Autofluoreszenz-Bildgebung hebt den Ort des Transplantats hervor. Die weißen Dreiecke auf den OCT-Bildern zeigen die jeweiligen seitlichen Ränder des Transplantats an (gemäß dem Zeilenscan auf dem Farbfundusbild). (B) Hämatoxylin- und Eosinfärbung des Transplantats unter atrophischer Fovea (aufgrund eines intraoperativen Risses) mit markierten Schichten. Maßstabsbalken = 1 mm in A (Autofluoreszenz- und FA-Bilder), 200 μm in A (OCT-Bilder) und 100 μm in B. Abkürzungen: FA = Fundusangiographie; OCT = optische Kohärenztomographie; RGC = retinale Ganglienzellschicht; INL = innere Kernschicht; ONL = äußere Kernschicht; RPE = retinales Pigmentepithel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig02.jpg"> Abbildung 2: Intraokulare und externe Ansichten der 25/41 G Doppelrohrkanüle. (A) Intraokulare Ansicht der 25/41 G Doppelrohrkanüle während der subretinalen Blebbildung. Der weiße Pfeil zeigt auf die längere zentrale Kanüle zur subretinalen Injektion. Der gestrichelte Pfeil zeigt auf die Öffnung der Austrittskanüle, durch die das BSS geht, um das Auge zu verlassen. (B) Außenansicht der Doppelrohrkanüle 25/41 G. Das Sternchen markiert den Ausgangsanschluss in der Nähe des Kanülenknotens, aus dem das intraokulare BSS abgelassen wird. Abkürzung: BSS = Balanced Salt Solution. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig03.jpg"> Abbildung 3: Intraoperative Mikroskopbilder und miOCT-Bilder von subretinalen Bleb, die durch einen Fovealriss kompliziert sind. (A1) Ein intraoperatives Mikroskopbild, das die Position von longitudinalen (blau) und transversalen (rot) Scans in einem Bleb mit einem Fovealriss zeigt. (A2) Longitudinaler miOCT-Scan mit einem subretinalen Bleb an der Fovealregion (gelber Pfeil). (A3) Transversaler miOCT-Scan, der einen fovealen Riss (weiße Pfeilspitze) zusammen mit einer Retinotomie (Sternchen und einen subretinalen Bleb (gelber Pfeil) erfasst. (B1) Ein intraoperatives mikroskopisches Bild, das die Position von longitudinalen (blau) und transversalen (rot) Scans in einem erfolgreich gebildeten Bleb zeigt. (B2) Longitudinaler miOCT-Scan mit einem subretinalen Bleb an der Fovealregion (gelber Pfeil). (B3) Transversaler miOCT-Scan, der einen erfolgreich erzeugten subretinalen Bleb mit einem intakten Fovea superior (weißer Diamant) zeigt. Abkürzung: miOCT = mikroskopintegrierte optische Kohärenztomographie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig04.jpg"> Abbildung 4: ERG des RPE-Xenotransplantat-transplantierten Auges. Für die funktionelle Beurteilung der Netzhaut zeigen Vollfeld-ERG-Beurteilungen des RPE-xenografierten Auges, die zu Studienbeginn (obere Reihe) und 3 Monate nach der Transplantation (untere Reihe) durchgeführt werden, keine signifikante Wirkung der RPE-Xenotransplantattransplantation auf Reaktionsamplituden, Timing oder Wellenform unter dunkel angepassten oder lichtangepassten Bedingungen. Abkürzungen: RPE = retinales Pigmentepithel; ERG = Elektroretinogramm; DA = dunkel angepasst; LA = lichtangepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Der nicht-menschliche Primat (NHP) ist aufgrund der anatomischen und genetischen Ähnlichkeiten ein ideales Modell für die Untersuchung der zellulären Therapeutika der menschlichen Netzhaut. Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur submakulären Transplantation von retinalen Pigmentepithelzellen im NHP-Auge und Strategien zur Verhinderung intraoperativer Komplikationen im Zusammenhang mit der Makulamanipulation.

Retinale Pigmentepitheltransplantation in einem nicht-menschlichen Primatenmodell für degenerative Netzhauterkrankungen

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Foveal trauma during retinal pigment epithelial graft transplantation kann zu schlechten visuellen Ergebnissen führen. Diese vorgeschlagene Methode kann die Wahrscheinlichkeit von Fovealrissen im Vergleich zu herkömmlichen Techniken verringern. Die vorgeschlagene Methode befasst sich mit mehreren Faktoren, die zum fovealen Trauma beitragen, einschließlich der Freisetzung subretinaler Adhäsionen, einer besseren Visualisierung von Netzhautschichten und tangentialer Scherkräfte während der Blasbildung.Diese Technik, die eine intravitreale Plasminogen-Vorbehandlung, eine mikroskopisch integrierte OCT-gesteuerte retinale Blebbildung und die Perfluorcarbon-Flüssigglastamponade unter Verwendung einer Doppelbohrkanüle beinhaltet, erzeugt die Wahrscheinlichkeit eines Fovealtraumas mit einem schonenderen Verfahren. Das Verfahren wird von Dr. Zenping Liu, einem Senior Research Fellow, und Herrn Daniel Soo Lin Wong, einem Forschungsassistenten, beide aus einem Labor, demonstriert. Professor Gopal Lingam, ein leitender Berater, wird auch die Operationsverfahren demonstrieren.Verwenden Sie zunächst die Vannas-Schere zum Einschneiden der Bindehaut in der Nähe des Limbus für eine 360-Grad-Bindehautperitomie und führen Sie eine stumpfe Dissektion durch, um die Peritomie zu vergrößern. Verwenden Sie eine 25-Gauge-Mikrovitreoretinalklinge, um einen drei Millimeter langen Schnitt in die Sklera bei acht Uhr im rechten Auge oder vier Uhr im linken Auge zu machen. Führen Sie eine 25 Gauge benutzerdefinierte Seitenport-Infusionskanüle ein und nähen Sie mit einer 7-0 Vicryl-Naht.Nachdem Sie die intravitreale Lage bestätigt haben, starten Sie die balancierte Salzlösungsinfusion und stellen Sie das System so ein, dass der Augeninnendruck von 20 Milliliter Quecksilber aufrechterhalten wird. Verwenden Sie einen 25-Gauge-Flathead-Trokar, um die Sklera bei zwei Uhr im rechten Auge oder 10 Uhr im linken Auge einzuschneiden. Stecken Sie eine 25 Gauge Kronleuchterleuchte in den Flathead Trocar und sichern Sie die Leuchte mit Klebeband.Stellen Sie die Lichtquelle auf ca. 60% ein Führen Sie eine weitere Sklerotomie bei 10 Uhr für das rechte Auge oder zwei Uhr für das linke Auge durch, wie gezeigt. Legen Sie eine U-förmige Vicryl 7-0 Naht um die Sklerotomie, ohne die Knoten zu binden. Führen Sie den Vitrektomie-Trokar durch die Sklerotomie ein.Führen Sie die Vitrektomie um den Eingangsanschluss herum durch, gefolgt von einer kurzen Kernvitrektomie mit maximal 5.000 Schnitten pro Minute und maximaler Aspiration bei 400 Millimeter Quecksilbersäule. Injizieren Sie 20 bis 50 Mikroliter Triamcinolon für eine bessere Glaskörpervisualisierung. Trennen Sie den Glaskörper von der Netzhaut, um eine hintere Glaskörperablösung zu induzieren.Positionieren Sie den Vitrektor über der optischen Bandscheibe, um eine sanfte Induktion der hinteren Glaskörperablösung zu ermöglichen. Halten Sie den Vitrektor nur auf Aspiration bei maximal 400 Millimeter Quecksilbersäule ohne Schneiden. Verwenden Sie bei Bedarf die 25 Gauge Intraokularzange, um den Glaskörperkortex zu zerreißen, um die Ablösung zu erleichtern.Öffnen Sie die hintere Zungenbeinmembran mit dem Cutter und entfernen Sie den abgelösten Glasschürzen bis zur Glaskörperbasis. Aspiraten Sie jedes verbleibende Triamcinolon auf der Netzhautoberfläche. Injizieren Sie ein bis zwei Milliliter Perfluorcarbonflüssigkeit, um den hinteren Pol bis zur vorderen und mittleren peripheren Netzhaut zu bedecken.Betreten Sie das Auge mit einer subretinalen Injektionskanüle. Verwenden Sie entweder die 25 x 41 Gauge große subretinale Injektionskanüle mit zwei Bohrungen oder die subretinale Injektionskanüle mit 25 x 38 x 25 x 38, die mit einer 250-Mikroliter-Spritze für die subretinale Injektion verbunden ist. Stellen Sie den Augeninnendruck auf null bis vier Millimeter Quecksilbersäule ein.Führen Sie vorsichtig eine subretinale Injektion von BSS durch, um eine lokalisierte Netzhautablösung zu induzieren. Sobald der Bleb die Fovea überquert hat, hören Sie auf, BSS zu injizieren. Erstelle ein zweites Bleb aus einer anderen Richtung.Verschmelzen Sie beide Blebs, um die Fovea vollständig zu lösen. Aktivieren Sie die intraoperative optische Kohärenztomographie-Funktion, um die Blebbildung zu visualisieren, und stellen Sie sicher, dass sich die Linien- und Würfelscans im High-Definition-Modus befinden, um ein Bild an der Fovea aufzunehmen. Vergrößern Sie den Schnitt der Netzhaut auf 1,5 Millimeter mit einer vertikalen 25-Gauge-Vitreoretinalschere, um den Zugang zum subretinalen Raum für die Transplantation zu ermöglichen.Stellen Sie den Augeninnendruck auf 50 Millimeter Quecksilbersäule ein. Verwenden Sie eine gebürstete Silikonspitzenkanüle, um die Perfluorcarbonflüssigkeit zu entfernen. Verwenden Sie ein 1,4-Millimeter-Schnittmesser, um die Sklerotomie zu verlängern.Geben Sie ein 20-Gauge-Extensible-Loop-Instrument ein und entfernen Sie die retinalen Pigmentepithelien des submakulären Wirts durch Abkratzen. Führen Sie die Spitze des Shooter-Geräts durch die Sklerotomie ein und passieren Sie die Glaskörperhöhle mit einem Augeninnendruck von 20 Millimeter Quecksilbersäule. Injizieren Sie das Implantat in Richtung des subretinalen Raums über die Retintomiekante, die von der Netzhautoberfläche aus erzeugt wird, wobei die Zellträgerseite der Brooks-Membran und das Xenotransplantat den Photorezeptoren zugewandt ist.Visualisieren Sie die Implantatposition, indem Sie die intraoperative optische Kohärenztomographie-Funktion aktivieren. Passen Sie die Implantatposition mit der subretinalen Injektionskanüle oder einer 25 Gauge gekrümmten intraokularen Schere an, um sicherzustellen, dass das Implantat flach auf der Brooks-Membran im subretinalen Raum mit einer intakten darüber liegenden Netzhaut ruht und sich entfernt von der erzeugten Retinotomie befindet und nicht auf die Retinotomiestelle trifft. Verwenden Sie eine gebürstete Silikonspitzenkanüle für den Flüssigkeits-Luft-Austausch und aspirieren Sie die subretinale Flüssigkeit sanft aus der Bandhautablösung und retinotomie-Kantenapposition, bis die Netzhaut wieder über dem Implantat befestigt ist.Dann, um die Operation zu beenden, schließen Sie die funktionierende Port-Sklerotomie mit der vorplatzierten 7-0 Vicryl Naht. Verabreichen Sie 0,05 Milliliter pro zwei Milligramm intravitreales konservierungsmittelfreies Triamcinolon bei der Acht-Uhr-Sklerotomie. Entfernen Sie den Kronleuchter und die Infusionskanüle.Schließen Sie diese Sklerotomien mit Vicryl-Nähten. Tasten Sie das Auge ab, um sicherzustellen, dass der Augeninnendruck im akzeptablen Bereich liegt. Injizieren Sie bei Bedarf gefilterte Luft oder BSS über eine 30-Gauge-Nadel.Eine In-vivo-Bildgebung der submakulären retinalen Pigmentepitheltransplantation des linken Auges auf verschiedenen Bildgebungsmodalitäten wurde bis zu drei Monate lang durchgeführt. Die Fundusfotografie zeigte, dass das transplantierte Transplantat an der Fovea im Laufe der Zeit nicht wanderte. Die Fundus-Autofluoreszenz-Bildgebung zeigte minimale Veränderungen in der Hyper-Autofluoreszenz, die das retinale Pigmentepitheltransplantat überlappt.Die Fundus-Fluorescein-Angiographie in der Früh- und Spätphase zeigte keine Leckage um das Transplantat herum. Die makulären optischen Kohärenztomographie-Bilder zeigten die Erhaltung der äußeren Netzhautschichten über dem Transplantat im Laufe der Zeit, was auf die Funktionalität der retinalen Pigmentepithelzellen hindeutet. Die HE-Färbung zeigte intakte Netzhautschichten ohne Anzeichen von Mikrorissen.Die intraoperative optische Kohärenztomographie ermöglicht die Visualisierung der Bleb-Dimensionen und des potentiellen Fovealrisses intraoperativ während der Fovealablösung. Das Vorhandensein von Tränen kann die Blebbildung beeinträchtigen. Der Erfolg der korrekten Blebbildung wurde durch das Fehlen von Tränen angezeigt.Zur funktionellen Beurteilung der Netzhaut wurden Vollfeld-Elektroretinogramm-Bewertungen des retinalen Pigmentepithel-Xenograft-Auges durchgeführt. Das Fehlen einer signifikanten Verschlechterung der Elektroretinogramm-Wellenformen deutet darauf hin, dass die Funktion sowohl der Stäbchen- als auch der Zapfen-Photorezeptoren mit den Xenotransplantaten erhalten blieb. Tun Sie dies während der Bildung des lokalisierten Netzhautlibes sehr sanft, da jede plötzliche Änderung der Strahlgeschwindigkeit zu Fovealrissen führen kann.Diesen Schritt langsam durchzuführen, ist der Schlüssel zur Reduzierung von Fovealverletzungen. Multimodale Bildgebung einschließlich Fundus-Autofluoreszenz, Fluorescein-Angiographie und optische Kohärenztomographie zusammen mit elektrophysiologischen Studien kann einen besseren Einblick in die Überlebensfähigkeit des Transplantats und faktoren, die es beeinflussen, liefern.

Research

JoVE Journal

Medicine

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

Techniken für die Verarbeitung Augen mit einem Netzhautprothese für lokalisierte Histopathologische Analyse Implantierte

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Forschung

Medizin

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Modell Netzhautablösung in Nagetiere durch subretinale Injektion von Natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Techniken für die Verarbeitung Augen mit einer Netzhautprothese für Implantierte Lokalisierte histopathologische Analyse: Teil 2 Epiretinale Implantate mit Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Quantitative Fundus-Autofluoreszenz für die Beurteilung von Netzhauterkrankungen

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Ein Maus-Modell der Netzhautischämie-Reperfusionsschaden Durch Erhöhung des intraokularen Druck

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus)

A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset Callithrix jacchus

Ein chirurgischer Eingriff für die Verwaltung der Medikamente an das Innenohr in eine nicht-menschliche Primaten Weißbüschelaffe (Callithrix Jacchus)

Hearing research has long been facilitated by rodent models, although in some diseases, human symptoms cannot be recapitulated. The common marmoset ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell für ischämische Netzhauterkrankungen bei Nagetieren

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...