Name: retinal pigment epithelium transplantation in a non-human primate model for degenerative retinal diseases
Uploaded: 2021-06-14T13:45:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי IAF-PP (HMBS Domain) (OrBID): OculaR BIomaterials and Device, A*STAR, סינגפור (H17/01/a0/013), מענק הסטארט-אפ NUHSRO/2016/100/SU/01, מענק NUHS Clinical Scientist Program (NCSP) ותוכנית המחקר התחרותית של קרן המחקר הלאומית, סינגפור (NRF-CRP21-2018-20008) ל- X.S., הונג לאונג העניקה קרנות פרופסור ל- G.E.H ו- B.V.S. ברצוננו להכיר לצוות הווטרינרי בפלטפורמת המודל הטרום-קליני התרגומי (מכון סינגפור לחקר העיניים, סינגפור) על מתן תמיכה בהכנת ניתוח NHP ומעקב אחר בעלי חיים. ברצוננו להרחיב את הערכתנו לג'יל טאו ועמיתיו מ- C. Zeiss Meditec Singapore לתמיכה טכנית עבור OPMI-Lumera 700 עם התקן OCT תוך ניתוחי משולב.

בוריס סטנזל מחזיק 9980851 פטנטים בארה"ב על מכשיר (מגרד RPE) המשמש במחקר זה. יו"ר כבוד מסי. זייס מדיטק וגודר לבוריס סטנזל. למחברים האחרים אין ניגוד אינטרסים להצהיר.

ישנן שתי גישות עיקריות להיות מוערך להשתלת RPE תת-עינית - הזרקת השעיית RPE והשתלת שתל RPE monolayer. השוואה מפורטת בין שתי השיטות היא מעבר להיקף כתב היד הזה. עם זאת, ההשתלה של שתל RPE monolayer עשוי להיות יתרון כמו תאי RPE מאורגנים יותר monolayer מאשר בהשעיה. תאי RPE בשתל מאורגנים במונוליינר משולב, הדומה לארגון שכבת תאי ה- RPE הפיזיולוגית ומאפשר לתאי RPE המושתלים לבצע את תפקידיהם הפיזיולוגיים. זה מאפשר פרמטרי מינון מדויקים יותר בהשוואה למתלי תאים, שרלוונטיים מאוד לעבודה רגולטורית ולהרחבה תעשייתית.
מסירת שתל תיקון RPE לחלל התת-יבשתי דורשת מניפולציה זהירה של המקולה והכנסה מדויקת של השתל בחלל התת-יבשתי. ההתקדמות הטכנולוגית במיקרו-כירורגיה, כגון miOCT, והבנה טובה יותר של דינמיקת רקמת הרשתית התוך ניתוחית הפחיתו את עקומת הלמידה של הליך זה. בדיון זה, את הרציונלים של ההיבטים הבאים יוסבר: i) הזרקת פלסמינוגן טרום ניתוחי; ii) השימוש ב- miOCT תוך ניתוחי; iii) השימוש בצינורית דו-מושבית מותאמת אישית של 41 G, הגדרות IOP נמוכות ו-PFCL ליצירת bleb תת-יבשתי; iv) גירוד של שכבת התא RPE המקומי לפני ההשתלה; v) השימוש בסירולימוס, טרימצינולון, דוקסיציקלין ומינוציקלין כדי להפחית את דחיית השתל האימונוגני.
זריקות פלסמינוגן טרום ניתוחיות משחררות הידבקויות ברשתית parafoveal בניסויים הראשונים, זה היה מאתגר לנתק את הגומה עם גל נוזל אחד. בהערכה עם miOCT, התמונות חשפו את הנוכחות של הידבקויות ברשתית החיצונית parafoveal ל- RPE המקומי יחד עם ראיות של טראומה תוך יבשתית20. הידבקויות אלה אולי הובילו להתרחבות אנכית של הבלם ולא לגל הנוזלים התת-יבשתי שהתפשט לאורך קווי המתאר של הרשתית, וכתוצאה מכך נגרם טראומה מגחמת. פלסמינוגן הוא הקדמה לא פעילה של פלסמין, פרוטאז מיקוד פיברונקטין ולמנין. Ocriplasmin הוא גרסה מהונדסת ביולוגית של פלסמין אנושי, שאושרה על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) וסוכנות התרופות האירופית (EMA) לטיפול במתיחה vitreomacular סימפטומטי עם או בלי חור מקולרי בו זמנית. עם זאת, דיווחים לאחר אישור של התפתחות בצקת ציסטואיד מקולה לאחר הזרקת ocriplasmin הציעו השפעה נרחבת יותר של האנזים על הרשתית23.
למרות המנגנונים המדויקים לא זוהו, הוצע כי פלסמין יכול להחליש הידבקות ברשתית באמצעות השפלה של אלמנטים מטריצה interphotoreceptor אחראי על הידבקות photoreceptor-RPE24. בפרוטוקול זה, עיני NHP טופלו עם פלסמינוגן intravitreal 1 שבוע לפני הניתוח כדי לשחרר את הידבקויות הרשתית החיצונית parafoveal. תחת ההנחה כי הידבקות photoreceptor-RPE נחלש, כוח נמוך יותר נדרש לנתק את הרשתית הנוירו-חושית, כולל טבעת parafoveal דיסטלי, אשר בדרך כלל מתנגד גל נוזל subretinal20. לפיכך, הכוח המנוהל במהלך ניתוק bleb רשתית תוצאות התרחבות של bleb על פני קווי המתאר של הרשתית במקום למתוח את הרשתית משיק. זה מפחית את הסיכון של דמעות גומה. עם זאת, יש לציין כי ההשפעה של פלסמינוגן על הישרדות השתל לטווח ארוך לא נחקר בפרוטוקול זה. מחקרים עתידיים צריכים לנסות לקבוע את האפקט הזה.
miOCT מספק משוב אנטומי כדי להנחות יצירה bleb subretinal, השתלת שתל, ניקוז נוזלים subretinal מניפולציה תוך ניתוחית ואטראומטית של המקולה היא המפתח להשגת תוצאות השתלה טובות. עם זאת, שינויים מיקרו-מבניים של המקולה הקשורים למניפולציה לא תמיד ניכרים במיקרוסקופ ההפעלה. בהליכים כאלה, miOCT הוא כלי חשוב המספק משוב בזמן אמת, תלת מימדי, תוך ניתוחי של המבנה המקולרי. miOCT שימושי במיוחד במהלך השלבים של ניתוק הגומלין, השתלת שתל, ניקוז של נוזל תת-רשתי באמצעות חילופי נוזלים-אוויר. במהלך ניתוק הגומלין, miOCT יכול לקבוע את הממדים האנכיים והאופקיים של ה- bleb. מיקרוטארים של הגבעול, שייתכן שלא ניתן לדמיין בבירור במיקרוסקופ הכירורגי, יכולים להיות מאושרים על ידי miOCT (איור 3). במהלך השתלת השתל, תמונות miOCT מנחות על ידי הצגת מיקום השתל או קרבתו לגומה, דרך הרשתית המנותקת והשקופה לעתים קרובות פחות. miOCT יכול גם להדגיש אזורים אפשריים של הידבקות ברשתית במהלך תהליך השתלה קשה25. לבסוף, בתהליך ניקוז נוזלים subretinal, miOCT יכול להנחות באופן אמין ניקוז נוזלים subretinal עד מגע מלא רשתית-RPE שתל מושגת.
השילוב של צינורית דו-עמומה, הגדרות IOP נמוכות וטמפונדה זגוגית PFCL מפחיתה באופן סינרגטי טראומה מקולרית במהלך יצירת bleb תת-יבשתי מתיחה משיקה ברשתית ומערבולת נוזלים יכולות להתרחש במהלך הזרקת BSS תת-רשתית לניתוק גפן המוביל לדמעות גומה לא רצויות. כדי לנטרל תופעות אלה, גורמים, כגון המיקום היחסי והמרחק ממרכז הגומה שבו הזריקה מופעלת, נפח הזרקה ומהירות, טמפונדה זגוגית, בחירה של מכשור תת-רשתי, ו- IOP הוכחו כולם כרלוונטיים20,26,27. bleb subretinal עבור ניתוק הגומה צריך להיות ממוקם במיקום רחוק מספיק מן הגומה, כמו מתיחה ברשתית עשוי להיות הגבוה ביותר באתר החניכה bleb27. IOP צריך גם להישמר נמוך לאורך כל היצירה של bleb subretinal. כאשר IOP של העין הוא גבוה, עלייה אנכית גבוהה יותר בגודל bleb במקום הרחבה לאורך קווי המתאר של הרשתית הוא ציין, ואילו blebs הם רדודים יותר בלחצים נמוכים יותר20. יתר על כן, למרות הזרקה תוך-תכליתית של 50 μL יהיה למעשה להכפיל את IOP בבני אדם28, בהתחשב באורך העיניים הקצר יותר ב- NHPs, עליית IOP במהלך הזרקת subretinal יהיה כנראה גבוה ומהיר יותר מאשר בבני אדם. בעוד שרוב מכונות הגיטרקטומיה מתאימות את עצמן לתנודות IOP, ההתאמה אינה בו זמנית אלא תהליך תגובתי המתרחש עם המשך הזרקת הרשתית. לפיכך, ככל שה- IOP גבוה יותר, כך גדל הסיכון של משיכת יתר ברשתית וטראומה גחמת הנובעת מכך. לכן, זה חיוני כדי לשמור על IOP נמוך יציב במהלך הזרקת subretinal.
צינורית תת-יבשתית מסחרית 20/41 G (DORC) או צינורית תת-יבשתית דו-מושבית 25/41 G בהתאמה אישית מומלצת להזרקה תת-יבשתית. הצינורית מאפשרת לנוזל לצאת מחלל הזגוגית בתמורה ל- BSS המוזרק לחלל התת-יבשתי. זה מבטיח את הרגולציה 'סימולטנית' של IOP במהלך הזרקת subretinal. באיור 2 ניתן לראות שרטוט של הצינורית הדו-מושבית. לבסוף, PFCL מנוצל כדי להפחית את הסיכון של דמעות גבעול20,26,27. כמו PFCLs, כגון אוקטלין, יש כבידה ספציפית גבוהה יותר, הם מפעילים כוח כלפי מטה על הרשתית במהלך ניתוק הגומה29. זה מייצב עוד יותר את תהליך יצירת bleb ניתוק הגומה ומשפר את התרחבות הבלם לאורך קווי המתאר של הרשתית. טכניקה זו שימשה בהצלחה עבור הזרקה תת-רשתית של rtPA בהגדרה של דימום תת-עיני מסיבי עקב nAMD30.
הסרת קדם-שתלה של RPE מקורי מאפשרת שחזור של קומפלקס RPE-קולטן פוטורצפטור יש להסיר את RPE המארח לפני השתלת השתלה. הסיבה לכך היא ששחזור של קומפלקס RPE-photoreceptor נדרש כדי לאפשר להשתלת RPE לבצע את הפונקציות הפיזיולוגיות שלה של תמיכה photoreceptors21. RPE המארח, אם לא הוסר, עשוי להוות מחסום מכני, אשר מונע את השחזור של קומפלקס זה. זה יכול להיות מוסר או באמצעות הממשל של כימיקלים רעילים RPE או באמצעות אמצעים פיזיים של הסרה. שיטות הסרה כימית כוללות ניהול מערכתי או תת-רשתי של נתרן יוד31,32. כמו נתרן יוד גורם ניוון נרחב של קולטני אור, תאי RPE, Choriocapillaris כאשר מנוהל, הרעילות הרשתית והמערכתית שלה מונעת את השימוש בו לניסויים בבני אדם32,33. לפיכך, טכניקות תוך ניתוחיות פיזיות עדיפות. שיטות פיזיות שונות הומשו. כאשר נעשה שימוש בשיטות פיזיות, חיוני שהממברנה של הברוך תישאר ללא פגע. מחקרים רבים במבחנה הוכיחו את התלות של הישרדות שתל RPE על ממברנה של ברוך שלם34,35,36.
ניסיונות לפירוק הידראולי קושרו עם הפסקות בממברנה של ברוך, שיעור מוגבר של התפתחות ממברנה אפירטינלית, ו vitreoretinopathy שגשוג, וכתוצאה מכך ניתוק רשתית המתיחה37. מרית מאובקת יהלומים שהוצעה לפסולת RPE הובילה גם היא לשברים בממברנה של הברוך, וכתוצאה מכך התפשטות תאית מהכורואיד לחלל התת-יבשתי38. מעניין, מכשיר לולאה מותאם אישית יכול להסיר את RPE overlying עם שימור של הממברנה של ברוך בעיני ארנבות וחזירים11,39. הסרת RPE הבסיסי הוא גם שימושי להקמת מודלים בעלי חיים עם RPE ניוון רשתית חיצונית, בדומה לצורה האטרופית המתקדמת של AMD. כאשר אזור מוקד של RPE מוסר מהמקולה, פצע RPE נסגר באמצעות היפרטרופיה של תאי RPE הנותרים. עם זאת, תגובת ריפוי הפצעים הזו קשורה לניוון של השכבה הגרעינית החיצונית40. בעוד יצירת מודל בעלי חיים היא מעבר להיקף של כתב יד זה, הליך דומה יכול ליצור מודל בעלי חיים של פנוטיפ AMD אטרופי מתקדם לבדיקת טיפולי תאים שמקורם RPE.
השימוש בסירולימוס, טרימצינולון, דוקסיציקלין ומינוציקלין להפחתת דחיית שתל אימונוגני המרחב התת-רשתי נחשב לאתר בעל זכויות חיסוניות, המתוחזק על ידי מחסום רשתית דם שלם וגורמים אחרים41. במחקרים רבים הקשורים להשתלה תת-רשתית של נגזרות תאי גזע עם מחסום רשתית דם שלם, תרופות מדכאות חיסון ממלאות תפקיד זניח בהישרדות השתל42. מחסום רשתית הדם החיצונית הוא חשב להיות נוצר על ידי שכבת RPE המקומית ואת הצמתים ההדוקים בין תאי RPE. בעוד הסרת RPE המקומי מאפשר שילוב טוב יותר של RPE מושתל קולטני אור מארח, מחסום רשתית הדם הוא שיבש בתהליך, להגדיל את הסבירות של דחייה חיסונית. באופן קלאסי, תאי T הם מרכזיים בתהליך של דחיית ההשתלה של איברים אחרים כגון הכליה והכבד43. לפיכך, משטרי דיכוי חיסוני ראשוניים להשתלת רקמת רשתית היו ממוקדים להפחתת תגובות חיסוניות מסתגלות אלה.
סירולימוס, מטרה מכאניסטית של מעכבי ראפאמיצין, וטקרולימוס, מעכב קלסינורין, הם דוגמאות לתרופות מדכאות חיסון המתמקדות בתגובות חיסוניות אדפטיביות. עם זאת, למרות דיכוי נאות של תאי T, שיעורי ההישרדות של השתל נשארים נמוכים. בנוסף, תאי RPE ידועים לדכא את הפעלת תאי T באמצעות שחרור של גורמים מעכבים ולקדם את הדור של תאי T רגולטוריים44. לפיכך, זה הפך יותר ויותר ברור כי חסינות אדפטיבית לא יכול להיות התורם היחיד לדחיית השתל42. השתלה תת-רשתית של מוצרים תאיים יכולה לגרום להצטברות והפעלה של microglia45.
מיקרוגליה הם המקרופאגים של הרשתית. הם מורכבים משתי אוכלוסיות עיקריות: 1) מיקרוגליה פרי וסקולרית של כלי הדם ברשתית הפנימית ו -2) המיקרוגליה בתוך הפרנצ'ימה של רקמת הרשתית. כמו microglia הם חלק מהתגובה החיסונית המולדת, glucocorticoids intravitreal, כגון triamcinolone, יכול לדכא התפשטות בתיווך ציטוקינים46. דוקסיציקלין ומינוציקלין יכולים גם לדכא הפעלה מיקרוגליאלית ויש לשקול אותם 47,48. לבסוף, ההבדלים בדחייה החיסונית של אלוגרפטים RPE לעומת קסנוגרפטים אינם מובנים באופן חלקי 49. לדוגמה, אלואנטיבודיות נגד תאי RPE פלואוריפוטנטיים המושרים בתאי גזע דווחו בסרום של מודלים לדחייה חיסונית in vivo. עם זאת, תפקידם של נוגדנים אלה ואת החשיבות של דחייה בתיווך נוגדנים בהישרדות השתל עדיין לא ידוע50. לפיכך, משטר multidrug ניצול sirolimus לדיכוי של חסינות אדפטיבית ושילוב של triamcinolone, דוקסיציקלין, מינוציקלין עבור דיכוי חסינות מולדת מוצע. משטר זה שימש בהצלחה ארנבות עם תוצאות הישרדות השתל טוב ואפקטים מערכתיים מינימליים11.
מגבלות של טכניקה כירורגית זו מאמר זה מתאר שיטה כירורגית אפשרית כדי לספק גיליון שתל RPE לתוך החלל התת-יבשתי של NHP; עם זאת, אין זה אומר שזו הדרך הממוטבת היחידה. מנתחי רשתית שונים עשויים להיות העדפות אחרות עבור מכשור וטכניקה. לדוגמה, עיצוב התקן השתלה זה יכול לספק רק שתלים שטוחים הנתמכים עם נושא תא נוקשה יותר ולכן לא יכול להיות מתאים לשתלים גמישים יחסית (או מגולגלים). השתלות השעיית RPE יכולות להשמיט חלק גדול מהטכניקה הזו. בהתאם לכך, פרטים כירורגיים ידרשו שינוי בהתבסס על כל אסטרטגיית לידה.
ככל שהעניין בטיפולים תאיים לטיפול במחלות רשתית ניוונית ממשיך לגדול, מודל בעלי החיים של NHP יהיה חיוני במחקרים פרה-קליניים לחקר הגורמים המשפיעים על הישרדות שתל RPE. בכתב יד זה, מוצעות אסטרטגיות כדי לאפשר את המסירה החלקה יותר של שתל RPE חד-שכבתי תת-עיני בעין NHP. שיטות להדמיה טובה יותר של סיבוכים תוך ניתוחיים מומלצות גם כן. צפוי כי שיטות אלה ימשיכו להשתפר ככל שהשימוש בטיפולים תאיים יתרחב. ניירות שיטה עתידיים צריכים גם לשקול להציע רשימה מקיפה של חקירות כדי להעריך היבטים מבניים ותפקודיים שונים של השתל.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62638">Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8 
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 
4Singapore Eye Research Institute (SERI), 
5UCL Institute of Ophthalmology, 
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 
8Department of Ophthalmology, University of Bonn 
* These authors contributed equally
to:
Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8 
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore 
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) 
4Singapore Eye Research Institute (SERI), 
5UCL Institute of Ophthalmology, 
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 
8Department of Ophthalmology, University of Bonn 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62638">Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

השתלת RPE טומנת בחובה הבטחה גדולה לטיפול במחלות ניווניות רשתית תורשתיות ונרכשות. תנאים אלה כוללים רטיניטיס פיגמנטוזה (RP, ניוון רוד-חרוט) וצורות מתקדמות של AMD כגון GA. באופן קולקטיבי, הפרעות אלה מייצגות חלק משמעותי של עיוורון שאינו ניתן לטיפול כיום ברחבי העולם 1,2. השלבים המתקדמים של AMD מסווגים ל- AMD ניאו-וסקולרי (nAMD) ו- GA. אמנם יש אפשרויות טיפול יעיל עבור nAMD, כגון זריקות גורם גדילה אנדותל אנטי וסקולרי (אנטי VEGF), חולים עם GA יש אפשרויות טיפול מוגבלות. RP היא קבוצה הטרוגנית מאוד של הפרעות רשתית תורשתית המאופיינת על ידי ניוון קולטני אור רשתית מתקדמת. בחלק מהחולים, הפגם הגנטי הסיבתי ממוקם בתוך RPE ולא קולטני האור; לפיכך, טיפול בתחליפי RPE עשוי להיות אסטרטגיה חלופית אם טיפול גנטי אינו אפשרי.
יש עניין משמעותי בפיתוח טיפולים יעילים עבור תנאים אלה. בפרט, השתלת RPE כבר צובר תאוצה כגישה טיפולית פוטנציאלית3,4,5,6,7,8. מאז הדיווחים הראשונים על השתלת RPE הופיעו בשנות השמונים, התחום התרחב לכלול מקורות תאי RPE שונים, אסטרטגיות משלוח, ומודלים ניסיוניים של מחלות והשתלות10,11,12,13,14. בין המודלים השונים של בעלי חיים, רק ל- NHP יש 'מקולה לוטאה' עם 'מרכז גומה', התמחות אנטומית בקוטב האחורי של הרשתית המשותפת לבני אדם. הגומה מכילה צפיפות גבוהה מאוד של קולטני אור חרוט המאפשרים ראייה מרכזית ברזולוציה גבוהה15. ל- NHP יש גם איפור גנומי ופרוטאומי דומה16 בהשוואה לבני אדם. קווי דמיון אלה הופכים אותו למודל בעלי חיים חשוב ומתאים לחקר מחלות עיניים המשפיעות על הרשתית האנושית17,18.
כתב יד זה מתאר שיטה להשתלה תת-עינית של קסנוגרפט RPE, הנתמך על ידי נושא תא PET, ב- NHPs מדוכאים. טכניקה טרנס-ויראלית להשתלת RPE תת-רשתית בארנבות תוארה בכתב יד קודם19. עם זאת, ב- NHPs, נוכחות הגומה דורשת טיפול מסוים במהלך מניפולציה תוך ניתוחית20. בפרט, קיים סיכון גבוה של קרע גבעול אם שיטות הזרקת נוזלים subretinal ליצור כוח מוגזם על הרשתית20. המוקד של כתב יד זה הוא, אם כן, על אסטרטגיות כדי להפחית את הסיכון לטראומה גחמת בשוגג ב- NHP.
אלה כוללים את השימוש של הזרקת פלסמינוגן תוך ניתוחית לשחרור הידבקויות parafoveal וטומוגרפיה קוהרנטיות אופטית משולבת מיקרוסקופ כירורגית (miOCT) תוך ניתוחי להדמיה בזמן אמת של האנטומיה של הגומה. צינורית תת-יבשתית דו-מושבית 25/41 G בהתאמה אישית עם טמפונדה תוך עינית של PFCL תחת הגדרות IOP נמוכות מוצעת כדי לאפשר תהליך מבוקר יותר של ניתוק הגומלין. יתר על כן, הסרה כירורגית של RPE מקומי מומלץ לפני ההשתלה כדי לאפשר שילוב טוב יותר בין תאי RPE מושתלים קולטני אור מארח. לבסוף, פרוטוקול דיכוי חיסוני מערכתי פרי ולאחר הניתוח עבור מודלים של NHP מתואר כדי לשפר את ההישרדות של קסנוגרפט RPE לאחר ההשתלה11,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Mydriacyl (Tropicamide 1.0%) Sterile Ophthalmic preparation</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>SIN 4715P</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800598</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Mydfrin (Phenylephrine hydrochloride) Ophthalmic solution</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>No. 01785</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G AWH Vivid Chandelier</td>
			<td>Synergetics</td>
			<td>56.54.25P</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Ga Bi-Blade Vitreous Cutter Combined Wide-Field Stellaris Elite Pack</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>SE5525WVB</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMO ENDOSOL Balanced Salt Solution for ophthalmic irrigation</td>
			<td>Abbott Medical Optics</td>
			<td>15020</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-minocycline</td>
			<td>Apotex Inc</td>
			<td>2084104</td>
			<td>Immunosuppression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUROVISC - Hypromellose Ophthalmic Solution USP 2% w/v</td>
			<td>Aurolab</td>
			<td>TN 00002387</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave MELAG, Vacuklav</td>
			<td>MELAG</td>
			<td>1131-B2300</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autostainer XL (ST5010)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>2433</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced Saline Solution</td>
			<td>Beaver Visitec</td>
			<td>581732</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Bud</td>
			<td>WINNER MEDICAL</td>
			<td>1NA6-100</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnosys Espion E3 Console</td>
			<td>Diagnosys</td>
			<td>272</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Yung Shin</td>
			<td>MAL 19950403AEZ</td>
			<td>Immunosuppression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.15935.0100</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERG-Jet contact lens electrodes</td>
			<td>Fabrinal</td>
			<td>F-06</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extendable PolyTip Cannula 25 G/38 G</td>
			<td>MedOne</td>
			<td>3247</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexTip Brush (25 g) 1.5 mm</td>
			<td>MedOne</td>
			<td>3222</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceine 10% Faure</td>
			<td>Curatis AG</td>
			<td>5030376</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Swab</td>
			<td>WINNER MEDICAL</td>
			<td>1NP3275</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton gas tight syringe 250 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81101</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg Spectralis HRA + OCT Computer System</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Gill II</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>3801520</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope eclipse Ti-E main body (100-240V)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>33131</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin injection</td>
			<td>Ceva</td>
			<td>37711/58317</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium carbonate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.05680.0250</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monkey plasminogen</td>
			<td>Molecular Innovations</td>
			<td>SKU-CYPLG</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-contact wide angled 128 degree fundus lens</td>
			<td>C. Zeiss Medtech</td>
			<td>Resight 700</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven Ophthalmic Drape</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>8065103120</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Corneal/Scleral V-Lance Knife 20 G</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>8065912001</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Embedding Station</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150 H</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast High Melt Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601095</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxin B</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.15935.0025</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepowdered Surgical Gloves</td>
			<td>MAXITEX</td>
			<td>85-173-2/85-173-3/85-173-4</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRODINE Povidone-Iodine Solution BP</td>
			<td>ICM PHARMA</td>
			<td>PMLBLP20-01</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Righton Slit Lamp Model MW50D (RAA133CB)</td>
			<td>Righton-Oph</td>
			<td>5200162</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safil Polyglycolic acid, braided, coated, absorbable surgical suture 7/0</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>G1048711</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHINCORT I.M. INJ. Triamcinolone Acetonide 40 mg/mL</td>
			<td>Yung Shin</td>
			<td>SHI40 SGP-2610015-001</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-Use Hypodermic Needle 21 G</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4657527</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-Use Hypodermic Needle 23 G</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4657667</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sirolimus</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>SIN12034P</td>
			<td>Immunosuppression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel subdermal needle electrode</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>F-E2</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellaris Elite vision enhancement system</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>BL15455</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 27 G 12 mm</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4665406</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 30 G 12 mm</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4656300</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gown + 2 Hand Towels</td>
			<td>STERIL</td>
			<td>APP10 00 01</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm Film</td>
			<td>3M</td>
			<td>1626W</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TERUMO Syringe 1 cc/mL Luer SlipTip with needle 26 G</td>
			<td>Teruma</td>
			<td>SS-01S</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TERUMO Syringe 3 cc/mL Luer LockTip</td>
			<td>Teruma</td>
			<td>SS-03L</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TERUMO Syringe 5 cc/mL Luer LockTip</td>
			<td>Teruma</td>
			<td>SS-05L</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TobraDex (Tobramycin, Dexamethasone) Sterile Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>No. 01577</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topcon Retinal Camera TRC-50DX</td>
			<td>Topcon</td>
			<td>948605</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>GB41789155517</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazil-20</td>
			<td>Ilium</td>
			<td>38653/50276</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Opmi Rescan 700</td>
			<td>Carl Zeiss Meditec AG</td>
			<td>7210</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pigment epithelium transplantation in a non-human primate model for degenerative retinal diseases

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) טומנת בחובה הבטחה גדולה לטיפול במחלות ניווניות רשתית תורשתית ונרכשות. תנאים אלה כוללים רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) וצורות מתקדמות של ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD), כגון ניוון גיאוגרפי (GA). יחד, הפרעות אלה מייצגות חלק משמעותי של עיוורון שאינו ניתן לטיפול כיום ברחבי העולם. צרכים רפואיים אלה ללא מענה יצרו עניין אקדמי מוגבר בפיתוח שיטות להחלפת RPE. בין המודלים החייתיים המשמשים בדרך כלל לבדיקות פרה-קליניות של טיפולים, הפרימט הלא אנושי (NHP) הוא המודל החייתי היחיד שיש לו מקולה. כפי שהוא חולק דמיון אנטומי זה עם העין האנושית, עין NHP היא מודל בעלי חיים פרה קליני חשוב ומתאים לפיתוח של מוצרים רפואיים טיפול מתקדם (כספומטים) כגון טיפול בתא RPE.
כתב יד זה מתאר שיטה להשתלה תת-עינית של מונולייר RPE, בתרבית על נושאת תאים פוליאתילן טרפתלט (PET), מתחת למקולה על פצע RPE שנוצר בניתוח ב- NHPs מדוכא חיסוני. הגומה - החלק המרכזי של כלי הדם של המקולה - הוא האתר של החולשה המכנית הגדולה ביותר במהלך ההשתלה. טראומת גבעול תתרחש אם הזרקת הנוזל התת-רשתית הראשונית תיצור כוח מוגזם על הרשתית. לפיכך, הזרקה איטית תחת טמפונדה נוזלית perfluorocarbon (PFCL) מומלץ עם צינורית הזרקה תת-יבשתית כפולה בלחץ תוך עיני נמוך (IOP) הגדרות כדי ליצור bleb רשתית. 
טיפול מקדים עם הזרקת פלסמינוגן intravitreal כדי לשחרר הידבקויות RPE-photoreceptor parafoveal מומלץ גם. אסטרטגיות משולבות אלה יכולות להפחית את הסבירות לדמעות גומה בהשוואה לטכניקות קונבנציונליות. ה- NHP הוא מודל בעלי חיים מרכזי בשלב הפרה-קליני של פיתוח טיפול בתאי RPE. פרוטוקול זה מטפל באתגרים הטכניים הקשורים לאספקת טיפול תאי RPE בעין NHP.

שיטות ההדמיה המולטימודליות (צילום פונדוס, הדמיית פונדוס אוטופלואורסצנטית (FAF), אנגיוגרפיה פלואורסצ'ין של פונדוס פלואורסצ'ין (FFA) - טומוגרפיה בשלב מוקדם ומאוחר, וטומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית (OCT)) מדגישות את התכונות של השתלת שתל RPE תת-עינית מוצלחת (איור 1). צילום פונדוס מראה את המיקום של השתלת שתל RPE בגומה ללא הגירה לאורך זמן. הדמיית FAF מראה שינויים מינימליים בהיפר-אוטופלואורסצנטיות (המודגמים על-ידי אזורים לבנים בעצימות גבוהה) החופפים לשתל RPE. FFA בשלב מוקדם ומאוחר אינם מראים דליפה ברורה (המודגמת על ידי אזורים לבנים בעצימות גבוהה הגדלים עם הזמן) המקיפים את שתל ה- RPE. תמונות ראשוניות ביום 3 מציגות פגם בחלון עקב הסרת RPE מקורי לפני השתלת השתלה. תמונות מקולרי OCT מראות את השימור של שכבות הרשתית החיצונית (בפרט, שכבת קולטן האור) מעל שתל RPE ככל שהזמן מתקדם. כתמי המטוקסילין והאאוזין מראים שכבות רשתית שלמות ללא ראיות למיקרו-טארים. שימור השכבה הגרעינית החיצונית מעל הפריפריה של השתל מצביע על כך שתאי ה- RPE מבצעים את תפקידיהם הפיזיולוגיים בשמירה על בריאות קולטני האור.
התצוגות התוך עיניות והחיצוניות של הצינורית הדו-דורית 25/41 G מדגישות את המנגנון שבאמצעותו נשלט ה-IOP במהלך הזרקה תת-יבשתית (איור 2). BSS נכנס לחלל התת-יבשתי במהלך הזרקת נוזלים תת-יבשתיים דרך הצינורית המרכזית הארוכה יותר. עלייה משמעותית בלחץ התוך עיני גורמת ל- BSS בתוך חלל הזגוגית לצאת מהעין באמצעות שעמום המתכת הגדול יותר של הצינורית. לאחר מכן BSS נוסע לאורך הצינורית ובסופו של דבר נפלט מיציאת היציאה ליד רכזת הצינורית. כדי להעריך אם הצינורית פועלת כצפוי, ודא שהנוזל זורם מיציאת היציאה ליד רכזת הצינורית.
ה-miOCT מאפשר הדמיה של מידות ה-bleb וקריעה פוטנציאלית של הגומה תוך ניתוחית במהלך ניתוק הגומה (איור 3). איור 3A1.A3 מדגיש מארז של bleb עם קרע בגבעול. באיור 3A1, בעוד הבלימה הנחותה נראית מתחת למיקרוסקופ הניתוחי, קשה לדמיין את הקרע. איור 3A2 מציג את קטע האורך של bleb ללא כל קרעים. איור 3A3 מציג קרע בגבעול בעת הערכת החלק האנכי של הבלימה. איור 3B1.B3 מראה bleb שנוצר בהצלחה ללא נוכחות של דמעות.
היעדר הידרדרות משמעותית בצורת הגל של ERG מצביע על כך שהתפקוד הגלובלי של קולטני האור של מוט וחרוט נשמר עם קסנוגרפטים תת-יבשתיים של RPE (איור 4). צורות הגל של ERG מראות את הפונקציה הכוללת של הרשתית. בפרט, יש לשים לב לגלים A כדי לקבוע כל אובדן של פונקציית קולטן אור.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig01.jpg"> איור 1: ניתוח לאחר הניתוח בניתוח vivo עם הדמיה רב-מודאלית. (A) הדמיית vivo של השתלת שתל RPE תת-עינית של העין השמאלית (צהובה על צילום פאנדוס) על שיטות הדמיה שונות (משמאל לימין עמודות: צילום פונדוס, autofluorescence, אנגיוגרפיה פלואורסצ'ין fundus fluorescein בשלב מוקדם, פונדוס פלואורסצ'ין אנגיוגרפיה מאוחרת, טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית) עבור נקודות זמן עד 3 חודשים (שורות מלמעלה למטה: ימים 3, 14; חודשים 1, 3). הכוכבית על תמונת הפונדוס מציינת את אתר הרטינוטומיה; החץ המקווקו הלבן מציין את כיוון סריקת הקו. הצורה הצהובה המצוירת בהדמיית פונדוס autofluorescence מדגישה את מיקום ההשתלה. המשולשים הלבנים בתמונות OCT מציינים את הקצוות הצדדיים המתאימים של השתל (בהתאם לסריקת הקו בתמונת הפונדוס הצבעונית). (B) הכתמת המטוקסילין ואאוזין של ההשתלה תחת גומה אטרופית (עקב קרע תוך ניתוחי) עם שכבות המסומנות. סרגלי קנה מידה = 1 מ"מ ב - A (תמונות autofluorescence ו- FA), 200 מיקרומטר ב - A (תמונות OCT) ו- 100 מיקרומטר ב - B. קיצורים: FA = אנגיוגרפיה של פונדוס; OCT = טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית; RGC = שכבת תא גנגליון רשתית; INL = שכבה גרעינית פנימית; ONL = שכבה גרעינית חיצונית; RPE = אפיתל פיגמנט רשתית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig02.jpg"> איור 2: תצוגות תוך-עיניות וחיצוניות של הצינורית הדו-עמומה 25/41 G. (A) מבט תוך עיני על הצינורית הדו-מושבית 25/41 G במהלך יצירת bleb תת-יבשתי. החץ הלבן מצביע על הצינורית המרכזית הארוכה יותר להזרקת תת-רשת. החץ המקווקו מצביע על פתיחת צינורית היציאה שדרכה עובר ה- BSS כדי לצאת מהעין. (B) מבט חיצוני על הצינורית הדו-עמומה 25/41 גרם. הכוכבית מסמנת את יציאת היציאה ליד רכזת הצינורית שממנה מנוקז ה- BSS התוך עיני. קיצור: BSS = פתרון מלח מאוזן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig03.jpg"> איור 3: תמונות מיקרוסקופ תוך ניתוחיות ותמונות miOCT של bleb תת-יבשתי המסובך על ידי קרע בגומה. (A1) תמונת מיקרוסקופ תוך ניתוחית המציגה את המיקום של סריקות אורך (כחול) ורוחב (אדום) בלב עם קרע בגבעול עם קרע בגבעול. (A2) סריקת miOCT אורכית המציגה bleb תת-יבשתי באזור הגומה (חץ צהוב). (A3) סריקת miOCT רוחבית הלוכדת קרע גחמני (ראש חץ לבן), יחד עם רטינוטומיה (כוכבית וbleb תת-יבשתי (חץ צהוב). (ב1) תמונה מיקרוסקופית תוך ניתוחית המציגה את המיקום של סריקות אורך (כחול) ורוחב (אדום) בbleb שנוצר בהצלחה. (ב2) סריקת miOCT אורכית המציגה bleb תת-יבשתי באזור הגומה (חץ צהוב). (ב3) סריקת miOCT רוחבית המציגה bleb תת-רשתי שנוצר בהצלחה עם גומה שלמה עדיפה (יהלום לבן). קיצור: miOCT = טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית משולבת מיקרוסקופ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig04.jpg"> איור 4: ERG של עין מושתלת קסנוגרפט RPE. להערכה הפונקציונלית של הרשתית, הערכות ERG שדה מלא של העין RPE-xenografted המבוצעות בקו הבסיס (שורה עליונה) ו 3 חודשים לאחר ההשתלה (שורה תחתונה) לא להראות שום השפעה משמעותית של השתלת קסנוגרפט RPE על כל משרעת תגובה, תזמון, או צורת גל בתנאים מותאמים כהה או אור מותאם. קיצורים: RPE = אפיתל פיגמנט רשתית; ERG = אלקטרורטינוגרמה; DA = מותאם כהה; לוס אנג'לס = מותאם לאור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases at JoVE.com

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

הפרימט הלא אנושי (NHP) הוא מודל אידיאלי לחקר טיפולי תאי רשתית אנושית בשל הדמיון האנטומי והגנטי. כתב יד זה מתאר שיטה להשתלה תת-עינית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית בעין NHP ואסטרטגיות למניעת סיבוכים תוך ניתוחיים הקשורים למניפולציה מקולרית.

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית במודל פרימטים לא אנושי למחלות רשתית ניוונית

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

טראומת עובר במהלך השתלת שתל אפיתל פיגמנט רשתית יכול לגרום לתוצאות חזותיות גרועות. שיטה מוצעת זו יכולה להפחית את הסבירות של קרעי גבעול בהשוואה לטכניקות קונבנציונליות. השיטה המוצעת מטפלת בגורמים רבים התורמים לטראומה גחמת, כולל שחרור הידבקויות תת-רשתיות, הדמיה טובה יותר של שכבות רשתית וכוחות גזירה משיקים במהלך היווצרות bleb.טכניקה זו, הכוללת טיפול מקדים פלסמינוגן תוך-ויטמין, מיקרוסקופ משולב היווצרות bleb רשתית מונחית OCT, וטמפונדה נוזלית perfluorocarbon נוזלית באמצעות צינורית נשא כפול מייצר את הסבירות של טראומה גחמת עם הליך עדין יותר. מי שידגימו את ההליך יהיו ד"ר זנפינג ליו, עמית מחקר בכיר, ומר דניאל סו לין וונג, עוזר מחקר, שניהם ממעבדה. פרופ' גופאל לינגאם, יועץ בכיר, ידגים גם הוא את נהלי הניתוח.כדי להתחיל, להשתמש במספריים Vannas לחיתוך הלחמית ליד הלימבוס עבור peritomy הלחמית 360 מעלות ולבצע ניתוח קהה כדי להגדיל את peritomy. השתמש בלהב מיקרו vitreoretinal 25 מד לעשות חתך שלושה מילימטר בסקלרה בשעה שמונה בשעה בעין ימין או ארבע בערב בעין שמאל. הכנס צינורית עירוי יציאה בצד מותאם אישית 25 מד ותפר באמצעות תפר ויקריל 7-0.לאחר אישור המיקום התוך-תכליתי, התחל את עירוי תמיסת המלח המאוזנת והגדר את המערכת כדי לשמור על הלחץ התוך עיני של 20 מיליליטר של כספית. השתמש trocar שטוח ראש שטוח 25 מד כדי לחרוט את הסקלרה בשעה שתיים בעין ימין או 10 בערב בעין שמאל. הכנס אור נברשת 25 מד לתוך trocar שטוח הראש ולאבטח את האור עם סרט דביק.כוונן את מקור האור לכ- 60% בצע סקלרוטומיה נוספת בשעה 10 עבור עין ימין או שתיים עבור העין השמאלית כפי שהוכח. מניחים תפר בצורת U Vicryl 7-0 סביב sclerotomy מבלי לקשור את הקשרים. הכנס את trocar vitrectomy דרך sclerotomy.בצע את vitrectomy סביב נמל הכניסה, ואחריו vitrectomy הליבה קצרה עם מקסימום של 5, 000 חתכים לדקה ושאיפה מקסימלית ב 400 מילימטרים של כספית. הזריקו 20 עד 50 מיקרוליטרים של טרימצינולון להדמיה טובה יותר של הזגוגית. הפרד את הגוף הזגוגי מהרשתית כדי לגרום לניתוק זגוגי אחורי.מקם את הגפנים מעל הדיסק האופטי כדי לאפשר אינדוקציה עדינה של הניתוק הזגוגי האחורי. שמור על vitrector רק על שאיפה לכל היותר 400 מילימטרים של כספית מבלי לערב כל חיתוך. במידת הצורך, השתמש במלקחיים התוך עיניים של 25 מד כדי לקרוע את קליפת המוח הזגוגית להקלה על הניתוק.פתח את קרום היאלויד האחורי עם החותך ולהסיר את החצאית הזגוגית המנותקת עד לבסיס הזגוגית. שאפו כל טרימצינולון שנותר על פני הרשתית. הזריקו מיליליטר אחד עד שני מיליליטר של נוזל perfluorocarbon כדי לכסות את הקוטב האחורי עד לרשתית הקדמית והמרכזית ההיקפית.הזן את העין עם צינורית הזרקה תת יבשתית. השתמש או 25 על 41 מד מותאם אישית כפול נשא הזרקת צינורית או 25 על 38 מד הזרקת צינורית הזרקה תת-יבשתית מחובר מזרק 250 מיקרוליטר להזרקה תת-רשתית. הגדר את הלחץ התוך עיני לאפס עד ארבעה מילימטרים של כספית.בצע בעדינות הזרקה תת-רשתית של BSS כדי לגרום לניתוק רשתית מקומי. ברגע שהבלבן חוצה את הגומה, תפסיק להזריק שטויות. צור bleb שני מכיוון נפרד.למזג את שני blebs לנתק לחלוטין את הגומה. אפשר את פונקציית הטומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית תוך ניתוחית כדי לדמיין היווצרות bleb, להבטיח כי סריקות הקו והקוביות נמצאות במצב בחדות גבוהה כדי לרכוש תמונה בגומה. הגדל את החתך של הרשתית ל 1.5 מילימטרים עם זוג מספריים vitreoretinal 25 מד אנכי כדי לאפשר גישה למרחב subretinal להשתלה.הגדר את הלחץ התוך עיני ל 50 מילימטרים של כספית. השתמש צינורית קצה סיליקון מוברש כדי להסיר את נוזל perfluorocarbon. השתמש בסכין חתך 1.4 מילימטר כדי להאריך את sclerotomy.הזן מכשיר לולאה 20 מד הרחבה ולהסיר את אפיתליה פיגמנט רשתית מארחת תת עינית על ידי גירוד. הכנס את קצה מכשיר היורה דרך sclerotomy ולעבור דרך חלל הזגוגית בלחץ תוך עיני של 20 מילימטרים של כספית. הזריקו את השתל לכיוון החלל התת-יבשתי דרך קצה הרטינוטומיה שנוצרה ממשטח הרשתית כאשר צד נושא התא פונה לקרום ברוקס והקסנוגרפט הפונה לצולי האור.דמיינו את מיקום השתל על ידי הפעלת פונקציית טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית תוך ניתוחית. התאם את מיקום השתל עם צינורית הזרקת תת-רשתית או מספריים תוך עיניים מעוקלות 25 מד כדי להבטיח שהשתל מונח שטוח על קרום ברוקס בחלל התת-יבשתי עם רשתית מעל רשתית שלמה, כמו גם ממוקם רחוק מהרטינוטומיה שנוצרה ולא פוגע באתר רטינוטומיה. השתמשו בצינורית קצה סיליקון מוברש לחילופי נוזלים-אוויר ושאפו בעדינות את הנוזל התת-רשתי מהניתוק הרשתית המלבין וקצה הרטינוטומיה עד שהרשתית מחוברת מחדש מעל השתל.לאחר מכן כדי לסיים את הניתוח, סגור את sclerotomy יציאת העבודה באמצעות תפר ויקריל ממוקם מראש 7-0. ניהול 0.05 מיליליטר לשני מיליגרם של טרימצינולון ללא חומרים משמרים תוך-ויטמין בשעה שמונה. הסר את הנברשת ואת צינורית עירוי.תסגור את הסקלרוטומיות האלה עם תפרי ויקריל. למשש את העין כדי להבטיח כי הלחץ התוך עיני הוא בטווח המקובל. הזרקו אוויר מסונן או BSS באמצעות מחט 30 מד במידת הצורך.הדמיה in vivo של העין השמאלית תת-עינית פיגמנט פיגמנט אפיתל השתלת שתל אפיתל על שיטות הדמיה שונות נערכה עד שלושה חודשים. צילום הפונדוס הצביע על כך שהשתל המושתל בגומה לא היגר עם הזמן. הדמיית הפלואורסצנטיות האוטומטית של פונדוס הראתה שינויים מינימליים בהיפר-פלואורסצנטיות אוטומטית החופפת לשתל האפיתל של הפיגמנט הרשתית.אנגיוגרפיה פלואורסצ'ין בשלב מוקדם ומאוחר לא הראתה שום דליפה סביב השתל. תמונות טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית מקולרית הראו שימור של שכבות הרשתית החיצונית על השתל ככל שהזמן התקדם, מה שמרמז על הפונקציונליות של תאי האפיתל פיגמנט הרשתית. הכתמת HE הראתה שכבות רשתית שלמות ללא ראיות לדמעות מיקרו.טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית תוך ניתוחית מאפשרת הדמיה של מידות bleb ואת קרע הגומה הפוטנציאלית תוך ניתוחית במהלך ניתוק הגומה. נוכחות של קרע יכול להפריע היווצרות bleb. ההצלחה של היווצרות bleb נכונה צוין על ידי היעדר קרע.להערכה פונקציונלית של הרשתית, הערכות אלקטרורטינוגרמה שדה מלא של העין אפיתל אפיתל הפיגמנט הרשתית קסנוגרפט בוצעו. היעדר הידרדרות משמעותית בצורת הגל האלקטרו-ארטינוגרמית מצביע על כך שתפקודם של קולטני האור של מוט וחרוט נשמר עם הקסנוגרפטים. במהלך היצירה של bleb רשתית מקומית, לעשות את זה בעדינות רבה כמו כל שינוי פתאומי במהירות סילון יכול להוביל קרעים גומה.ביצוע צעד זה לאט הוא המפתח להפחתת פגיעה בגומה. הדמיה מולטימודלית כולל פלואורסצנטיות אוטומטית של פונדוס, אנגיוגרפיה פלואורסצ'ין וטומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית יחד עם מחקרים אלקטרופיזיולוגיים יכולים לספק תובנה גדולה יותר על שרידות השתל וגורמים המשפיעים עליו.

Research

JoVE Journal

Medicine

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

טכניקות לעיני עיבוד השתלה תותבת רשתית לניתוח Histopathological מרוכזות

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

רשתית דגם ניתוק במכרסמים על ידי הזרקת subretinal של נתרן Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

טכניקות לעיני עיבוד מושתלים בתותב רשתית למותאם למקום Histopathological ניתוח: חלק 2 Epiretinal שתלים עם נעצי רשתית

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

כמותי הפונדוס autofluorescence עבור הערכת מחלות רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

צעד אחר פרוטוקול שלב לכירורגיה subretinal בארנבונים

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

במודל עכבר של רשתית איסכמיה reperfusion נזק ע&quot;י העלאת רמת הלחץ התוך עיני

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus)

A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset Callithrix jacchus

הליך כירורגי עבור ניהול של הסמים לאוזן הפנימית, לא אנושית הפרימטים נפוצות קוף (ההצטרפות נקראו Callithrix)

Hearing research has long been facilitated by rodent models, although in some diseases, human symptoms cannot be recapitulated. The common marmoset ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן למחלות רשתית איסכמיות במכרסמים

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...