Name: retinal pigment epithelium transplantation in a non-human primate model for degenerative retinal diseases
Uploaded: 2021-06-14T13:45:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases at JoVE.com

Это исследование было поддержано IAF-PP (HMBS Domain) (OrBID): OculaR BIomaterials and Device, A*STAR, Сингапур (H17/01/a0/013), грантом NUS Start-up NUHSRO/2016/100/SU/01, грантом NUHS Clinical Scientist Program (NCSP) и Программой конкурентных исследований Национального исследовательского фонда, Сингапур (NRF-CRP21-2018-0008) для X.S., Hong Leong Endowed Professorship funds to G.E.H. и B.V.S. Мы хотели бы поблагодарить ветеринарную команду Трансляционной доклинической модельной платформы (Сингапурский научно-исследовательский институт глаз, Сингапур) за оказание поддержки в подготовке к хирургии NHP и наблюдении за животными. Мы хотели бы выразить нашу признательность Джилл Тео и коллегам из C. Zeiss Meditec Singapore за техническую поддержку OPMI-Lumera 700 со встроенным интраоперационным устройством OCT.

Борис Станцель имеет патент США 9980851 на инструмент (скребок RPE), используемый в этом исследовании. Гонорар спикера от C. Zeiss Meditec и Geuder Борису Станцелю. У других авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62638">Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8 
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 
4Singapore Eye Research Institute (SERI), 
5UCL Institute of Ophthalmology, 
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 
8Department of Ophthalmology, University of Bonn 
* These authors contributed equally
to:
Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8 
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore 
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) 
4Singapore Eye Research Institute (SERI), 
5UCL Institute of Ophthalmology, 
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 
8Department of Ophthalmology, University of Bonn 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62638">Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Трансплантация РПЭ имеет большие перспективы для лечения наследственных и приобретенных дегенеративных заболеваний сетчатки. Эти состояния включают пигментный ретинит (RP, палочкоконусная дистрофия) и продвинутые формы ВМД, такие как GA. В совокупности эти расстройства представляют собой значительную долю неизлечимой в настоящее время слепоты во всем мире1,2. Продвинутые стадии ВМД подразделяются на неоваскулярные ВМД (nAMD) и GA. Хотя существуют эффективные варианты лечения nAMD, такие как инъекции антисосудистого эндотелиального фактора роста (anti-VEGF), пациенты с ГА имеют ограниченные варианты лечения. РП представляет собой высоко гетерогенную группу наследственных нарушений сетчатки, характеризующихся прогрессирующей дегенерацией фоторецепторов сетчатки. У некоторых пациентов причинный генетический дефект расположен внутри RPE, а не фоторецепторов; следовательно, заместительная терапия RPE может быть альтернативной стратегией, если генная терапия неосуществима.
Существует значительный интерес к разработке эффективных методов лечения этих состояний. В частности, трансплантация RPE набирает обороты в качестве потенциального терапевтического подхода3,4,5,6,7,8. С тех пор, как в 1980-х годах появились первые сообщения о трансплантации RPE, область расширилась, включив в себя различные источники клеток RPE, стратегии доставки и экспериментальные модели заболеваний и трансплантации10,11,12,13,14. Среди различных животных моделей только NHP имеет «macula lutea» с «fovea centralis», анатомическую специализацию на заднем полюсе сетчатки, общую с людьми. Ямка содержит очень высокую плотность конусных фоторецепторов, обеспечивающих центральное зрение высокого разрешения15. NHP также имеет аналогичный геномный и протеомный состав16 по сравнению с людьми. Эти сходства делают его важной и подходящей животной моделью для изучения глазных заболеваний, которые влияют на сетчатку человека17,18.
В этой рукописи описывается метод субмакулярной трансплантации ксенотрансплантата RPE, поддерживаемого носителем ПЭТ-клеток, в иммуносупрессированных NHP. Трансвитреальный метод субретинальной трансплантации RPE у кроликов был описан в предыдущей рукописи19. Однако при НХП наличие ямки требует особой осторожности при интраоперационных манипуляциях20. В частности, существует высокий риск разрыва фовеальной артерии, если методы инъекции субретинальной жидкости генерируют чрезмерную силу на сетчатку20. Таким образом, основное внимание в этой рукописи уделяется стратегиям снижения риска непреднамеренной травмы фовеального нерва при NHP.
К ним относятся использование предоперационной интравитреальной инъекции плазминогена для высвобождения парафовеальных спаек и хирургической микроскоп-интегрированной оптической когерентной томографии (miOCT) интраоперационно для визуализации анатомии фовеала в режиме реального времени. Предлагается изготовленная на заказ субретинальная канюля 25/41 G с двойным отверстием с внутриглазной тампонадой PFCL при низких настройках ВГД, чтобы обеспечить более контролируемый процесс отслоения фовеала. Кроме того, перед имплантацией рекомендуется хирургическое удаление нативного RPE, чтобы обеспечить лучшую интеграцию между трансплантированными клетками RPE и фоторецепторами хозяина. Наконец, описан пери- и послеоперационный протокол системной иммуносупрессии для моделей NHP для улучшения выживаемости ксенотрансплантата RPE после трансплантации11,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Mydriacyl (Tropicamide 1.0%) Sterile Ophthalmic preparation</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>SIN 4715P</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800598</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Mydfrin (Phenylephrine hydrochloride) Ophthalmic solution</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>No. 01785</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G AWH Vivid Chandelier</td>
			<td>Synergetics</td>
			<td>56.54.25P</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Ga Bi-Blade Vitreous Cutter Combined Wide-Field Stellaris Elite Pack</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>SE5525WVB</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMO ENDOSOL Balanced Salt Solution for ophthalmic irrigation</td>
			<td>Abbott Medical Optics</td>
			<td>15020</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-minocycline</td>
			<td>Apotex Inc</td>
			<td>2084104</td>
			<td>Immunosuppression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUROVISC - Hypromellose Ophthalmic Solution USP 2% w/v</td>
			<td>Aurolab</td>
			<td>TN 00002387</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave MELAG, Vacuklav</td>
			<td>MELAG</td>
			<td>1131-B2300</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autostainer XL (ST5010)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>2433</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced Saline Solution</td>
			<td>Beaver Visitec</td>
			<td>581732</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Bud</td>
			<td>WINNER MEDICAL</td>
			<td>1NA6-100</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnosys Espion E3 Console</td>
			<td>Diagnosys</td>
			<td>272</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Yung Shin</td>
			<td>MAL 19950403AEZ</td>
			<td>Immunosuppression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.15935.0100</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERG-Jet contact lens electrodes</td>
			<td>Fabrinal</td>
			<td>F-06</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extendable PolyTip Cannula 25 G/38 G</td>
			<td>MedOne</td>
			<td>3247</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexTip Brush (25 g) 1.5 mm</td>
			<td>MedOne</td>
			<td>3222</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceine 10% Faure</td>
			<td>Curatis AG</td>
			<td>5030376</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Swab</td>
			<td>WINNER MEDICAL</td>
			<td>1NP3275</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton gas tight syringe 250 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81101</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg Spectralis HRA + OCT Computer System</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Gill II</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>3801520</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope eclipse Ti-E main body (100-240V)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>33131</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin injection</td>
			<td>Ceva</td>
			<td>37711/58317</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium carbonate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.05680.0250</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monkey plasminogen</td>
			<td>Molecular Innovations</td>
			<td>SKU-CYPLG</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-contact wide angled 128 degree fundus lens</td>
			<td>C. Zeiss Medtech</td>
			<td>Resight 700</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven Ophthalmic Drape</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>8065103120</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Corneal/Scleral V-Lance Knife 20 G</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>8065912001</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Embedding Station</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150 H</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast High Melt Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601095</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxin B</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.15935.0025</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepowdered Surgical Gloves</td>
			<td>MAXITEX</td>
			<td>85-173-2/85-173-3/85-173-4</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRODINE Povidone-Iodine Solution BP</td>
			<td>ICM PHARMA</td>
			<td>PMLBLP20-01</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Righton Slit Lamp Model MW50D (RAA133CB)</td>
			<td>Righton-Oph</td>
			<td>5200162</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td>Histology procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safil Polyglycolic acid, braided, coated, absorbable surgical suture 7/0</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>G1048711</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHINCORT I.M. INJ. Triamcinolone Acetonide 40 mg/mL</td>
			<td>Yung Shin</td>
			<td>SHI40 SGP-2610015-001</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-Use Hypodermic Needle 21 G</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4657527</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-Use Hypodermic Needle 23 G</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4657667</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sirolimus</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>SIN12034P</td>
			<td>Immunosuppression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel subdermal needle electrode</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>F-E2</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellaris Elite vision enhancement system</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>BL15455</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 27 G 12 mm</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4665406</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 30 G 12 mm</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4656300</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gown + 2 Hand Towels</td>
			<td>STERIL</td>
			<td>APP10 00 01</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm Film</td>
			<td>3M</td>
			<td>1626W</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TERUMO Syringe 1 cc/mL Luer SlipTip with needle 26 G</td>
			<td>Teruma</td>
			<td>SS-01S</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TERUMO Syringe 3 cc/mL Luer LockTip</td>
			<td>Teruma</td>
			<td>SS-03L</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TERUMO Syringe 5 cc/mL Luer LockTip</td>
			<td>Teruma</td>
			<td>SS-05L</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TobraDex (Tobramycin, Dexamethasone) Sterile Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>No. 01577</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topcon Retinal Camera TRC-50DX</td>
			<td>Topcon</td>
			<td>948605</td>
			<td>Ophthamic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>GB41789155517</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazil-20</td>
			<td>Ilium</td>
			<td>38653/50276</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Opmi Rescan 700</td>
			<td>Carl Zeiss Meditec AG</td>
			<td>7210</td>
			<td>Surgical procedure</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pigment epithelium transplantation in a non-human primate model for degenerative retinal diseases

Трансплантация пигментного эпителия сетчатки (RPE) имеет большие перспективы для лечения наследственных и приобретенных дегенеративных заболеваний сетчатки. Эти состояния включают пигментный ретинит (RP) и запущенные формы возрастной макулярной дегенерации (AMD), такие как географическая атрофия (GA). Вместе эти расстройства составляют значительную долю неизлечимой в настоящее время слепоты во всем мире. Эти неудовлетворенные медицинские потребности вызвали повышенный академический интерес к разработке методов замены RPE. Среди животных моделей, обычно используемых для доклинических испытаний терапевтических средств, нечеловеческий примат (NHP) является единственной животной моделью, которая имеет макулу. Поскольку он разделяет это анатомическое сходство с человеческим глазом, глаз NHP является важной и подходящей доклинической животной моделью для разработки лекарственных средств передовой терапии (ATMP), таких как клеточная терапия RPE.
В этой рукописи описывается способ субмакулярной трансплантации монослоя RPE, культивируемого на носителе клеток полиэтилентерефталата (ПЭТ), под макулой на хирургически созданную рану RPE в иммуносупрессированных NHP. Ямка — центральная аваскулярная часть макулы — является местом наибольшей механической слабости во время трансплантации. Травма фовеальной артерии произойдет, если начальная инъекция субретинальной жидкости генерирует чрезмерную силу на сетчатку. Следовательно, медленная инъекция под перфторуглеродной жидкостью (PFCL) стекловидного тампонады рекомендуется с двухканальной субретинальной инъекционной канюлей при низком внутриглазном давлении (ВГД) для создания сетчатки. 
Также рекомендуется предварительная обработка интравитреальной инъекцией плазминогена для высвобождения парафовеальных RPE-фоторецепторных спаек. Эти комбинированные стратегии могут снизить вероятность разрывов фовеального нерва по сравнению с обычными методами. NHP является ключевой животной моделью в доклинической фазе развития клеточной терапии RPE. Этот протокол решает технические проблемы, связанные с доставкой клеточной терапии RPE в глаз NHP.

Мультимодальные методы визуализации (фотосъемка глазного дна, автофлуоресцентная визуализация глазного дна (FAF), флуоресцеиновая ангиография глазного дна (FFA) - ранняя фаза и поздняя фаза, а также оптическая когерентная томография (OCT)) подчеркивают особенности успешной субмакулярной трансплантации трансплантата RPE (рисунок 1). Фотография глазного дна показывает позиционирование трансплантата RPE в ямке без миграции с течением времени. Визуализация FAF показывает минимальные изменения гиперавтофлуоресценции (продемонстрированные белыми областями высокой интенсивности), перекрывающими трансплантат RPE. Ранняя и поздняя фазы FFA не показывают какой-либо очевидной утечки (о чем свидетельствуют белые, высокоинтенсивные области, которые увеличиваются со временем), окружающие трансплантат RPE. Первоначальные изображения на 3-й день показывают дефект окна из-за удаления нативного RPE перед имплантацией трансплантата. Макулярные изображения OCT показывают сохранение внешних слоев сетчатки (в частности, слоя фоторецепторов) над трансплантатом RPE с течением времени. Окрашивание гематоксилином и эозином показывает неповрежденные слои сетчатки без признаков микросоединений. Сохранение внешнего ядерного слоя над периферией трансплантата говорит о том, что клетки RPE выполняют свои физиологические функции поддержания здоровья фоторецепторов.
Внутриглазный и внешний вид двухствольной канюли 25/41 G подчеркивает механизм, с помощью которого ВГД контролируется во время субретинальной инъекции (рисунок 2). BSS попадает в субретинальное пространство во время инъекции субретинальной жидкости через центральную более длинную канюлю. Значительное увеличение внутриглазного давления приводит к тому, что BSS в стекловидной полости выходит из глаза через более крупное металлическое отверстие канюли. Затем BSS перемещается вдоль канюли и в конечном итоге выбрасывается из выходного порта рядом с ступицей канюли. Чтобы оценить, работает ли канюля так, как ожидалось, убедитесь, что жидкость течет из выходного порта вблизи ступицы канюли.
MiOCT позволяет визуализировать размеры bleb и потенциальный интраоперационный разрыв ямки во время отслоения ямки (рисунок 3). На рисунке 3А1-А3 выделен корпус блеба с разрывом ямки. На рисунке 3A1, в то время как нижняя блеб видна под хирургическим микроскопом, визуализация разрыва затруднена. На рисунке 3А2 показано продольное сечение блеба без каких-либо разрывов. На рисунке 3A3 показан разрыв фовеального отверстия при оценке вертикального сечения блеба. На рисунке 3В1-В3 показан успешно созданный блеб без присутствия каких-либо разрывов.
Отсутствие значительного ухудшения осциллограмм ERG говорит о том, что глобальная функция как палочковых, так и конусных фоторецепторов поддерживается субретинальными ксенотрансплантатами RPE (рисунок 4). Формы сигналов ERG показывают общую функцию сетчатки. В частности, следует обратить внимание на А-волны для определения любой потери функции фоторецептора.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig01.jpg"> Рисунок 1: Послеоперационный анализ in vivo с мультимодальной визуализацией. (A) Визуализация in vivo субмакулярного трансплантата RPE левого глаза (желтый на фотографии глазного дна) на различных методах визуализации (слева направо колонки: фотосъемка глазного дна, автофлуоресценция, флуоресцеиновая ангиография глазного дна - ранняя фаза, флуоресцеиновая ангиография глазного дна - поздняя фаза, оптическая когерентная томография) для временных точек до 3 месяцев (верхние и нижние ряды: дни 3, 14; Месяцы 1, 3). Звездочка на фотографии глазного дна указывает на место ретинотомии; белая пунктирная стрелка указывает направление сканирования линии. Желтая нарисованная форма на автофлуоресцентной визуализации глазного дна подчеркивает местоположение трансплантата. Белые треугольники на изображениях OCT указывают на соответствующие боковые края трансплантата (в соответствии со сканированием линии на цветном изображении глазного дна). (B) Окрашивание трансплантата гематоксилином и эозином под атрофической ямкой (из-за интраоперационного разрыва) с мечеными слоями. Шкала стержней = 1 мм в A (автофлуоресценция и изображения FA), 200 мкм в A (изображения OCT) и 100 мкм в B. Сокращения: FA = ангиография глазного дна; ОКТ = оптическая когерентная томография; RGC = ганглиозный клеточный слой сетчатки; INL = внутренний ядерный слой; ONL = внешний ядерный слой; RPE = пигментный эпителий сетчатки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig02.jpg"> Рисунок 2: Внутриглазный и внешний вид двухствольной канюли 25/41 G. (A) Внутриглазный вид канюли с двойным отверстием 25/41 G во время создания субретинального блеба. Белая стрелка указывает на более длинную центральную канюлю для субретинальной инъекции. Пунктирная стрелка указывает на отверстие выходной канюли, через которое проходит BSS, чтобы выйти из глаза. B) Внешний вид двухствольной канюли 25/41 G. Звездочкой обозначен выходной порт рядом с концентратором канюли, из которого дренируется внутриглазная BSS. Аббревиатура: BSS = сбалансированный раствор соли. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig03.jpg"> Рисунок 3: Изображения интраоперационного микроскопа и miOCT субретинального блеба, осложненного разрывом фовеала. (A1) Изображение интраоперационного микроскопа, показывающее положение продольного (синего) и поперечного (красный) сканирований в блебе с разрывом фовеала. (А2) Продольное сканирование miOCT, показывающее субретинальный блеб в области ямки (желтая стрелка). (А3) Поперечное сканирование miOCT захватывает разрыв фовеальной кости (белый наконечник стрелы), а также ретинотомию (звездочка и субретинальный блеб (желтая стрелка). (В1) Интраоперационное микроскопическое изображение, показывающее положение продольного (синего) и поперечного (красный) сканирований в успешно сформированном блебе. (В2) Продольное сканирование miOCT, показывающее субретинальный блеб в области ямки (желтая стрелка). (В3) Поперечное сканирование miOCT, показывающее успешно созданный субретинальный блеб с неповрежденной ямкой (белый алмаз). Аббревиатура: miOCT = микроскоп-интегрированная оптическая когерентная томография. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig04.jpg"> Рисунок 4: ЭРГ РПЭ ксенотрансплантатно-трансплантированного глаза. Для функциональной оценки сетчатки полнопольные оценки ERG RPE-ксенотрансплантированного глаза, выполненные на исходном уровне (верхний ряд) и через 3 месяца после трансплантации (нижний ряд), не показывают значительного влияния трансплантации ксенотрансплантата RPE на любые амплитуды ответа, время или форму волны в условиях, адаптированных к темноте или свету. Сокращения: RPE = пигментный эпителий сетчатки; ERG = электроретинограмма; DA = адаптированный к темноте; LA = адаптированный к свету. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases at JoVE.com

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Нечеловеческий примат (NHP) является идеальной моделью для изучения клеточной терапии сетчатки человека из-за анатомического и генетического сходства. В данной рукописи описан метод субмакулярной трансплантации пигментных эпителиальных клеток сетчатки в глазу NHP и стратегии предотвращения интраоперационных осложнений, связанных с макулярными манипуляциями.

Трансплантация пигментного эпителия сетчатки в модели нечеловеческих приматов для дегенеративных заболеваний сетчатки

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Травма фовеальной артерии во время трансплантации пигментного эпителиального трансплантата сетчатки может привести к плохим визуальным результатам. Этот предложенный метод может снизить вероятность разрывов фовеальной кости по сравнению с обычными методами. Предлагаемый метод учитывает множество факторов, способствующих травме фовея, включая высвобождение субретинальных спаек, лучшую визуализацию слоев сетчатки и тангенциальные силы сдвига во время образования блеба.Этот метод, который включает в себя предварительную обработку интравитреального плазминогена, микроскоп интегрированного формирования сетчатки под управлением OCT и перфторуглеродную жидкую тампонаду стекловидного тела с использованием канюли с двойным отверстием, создает вероятность травмы фовея с более мягкой процедурой. Демонстрировать процедуру будут д-р Цзэнпин Лю, старший научный сотрудник, и г-н Даниэль Со Линь Вонг, научный сотрудник, оба из лаборатории. Профессор Гопал Лингам, старший консультант, также продемонстрирует процедуры операции.Для начала используйте ножницы Vannas для разрезания конъюнктивы возле лимбуса для 360-градусной конъюнктивальной перитомии и выполните тупое рассечение для увеличения перитомии. Используйте микро витреоретинальное лезвие 25 калибра, чтобы сделать трехмиллиметровый разрез в склере в восемь часов в правом глазу или четыре часа в левом глазу. Вставьте 25-калибровочную инфузионную канюлю и шов с помощью шва 7-0 Vicryl.После подтверждения интравитреального расположения начинают сбалансированную инфузию раствора соли и устанавливают систему для поддержания внутриглазного давления 20 миллилитров ртути. Используйте трокар с плоской головкой 25 калибра, чтобы разрезать склеру в два часа в правом глазу или 10 часов в левом глазу. Вставьте светильник люстры 25 калибра в плоскоголовку и закрепите свет липкой лентой.Отрегулируйте источник света примерно до 60% Выполните еще одну склеротомию в положении «10 часов» для правого глаза или в два часа для левого глаза, как показано на рисунке. Поместите U-образный шов Vicryl 7-0 вокруг склеротомии, не связывая узлы. Вводят троакар витрэктомии через склеротомию.Выполните витрэктомию вокруг входного порта, а затем короткую основную витрэктомию с максимальным количеством 5000 разрезов в минуту и максимальной аспирацией при 400 миллиметрах ртутного столба. Введите от 20 до 50 микролитров триамцинолона для лучшей визуализации стекловидного тела. Отделите стекловидное тело от сетчатки, чтобы вызвать заднюю отслойку стекловидного тела.Расположите витректор над диском зрительного нерва, чтобы обеспечить мягкую индукцию заднего стекловидного отслоения. Держите стекловидный столб только на аспирации при максимальном значении 400 миллиметров ртутного столба без каких-либо резания. При необходимости используйте внутриглазные щипцы 25 калибра, чтобы разорвать кору стекловидного тела для облегчения отслоения.Откройте заднюю подъязычную оболочку резаком и снимите отслоившуюся стекловидную юбку до основания стекловидного тела. Аспирируйте любой оставшийся триамцинолон на поверхности сетчатки. Вводят один-два миллилитра перфторуглеродной жидкости, чтобы покрыть задний полюс до передней и средней периферической сетчатки.Вводят в глаз с помощью субретинальной инъекции канюли. Используйте либо индивидуальную канюлю для инъекций с двойным отверстием 25 на 41 калибр, либо канюлю для субретинальной инъекции 25 на 38 калибров, подключенную к шприцу с 250 микролитрам для субретинальной инъекции. Установите внутриглазное давление на ноль-четыре миллиметра ртутного столба.Осторожно выполните субретинальную инъекцию BSS, чтобы индуцировать локализованную отслойку сетчатки. Как только блеб пересечет ямку, прекратите инъекцию BSS. Создайте второй блеб с другого направления.Объедините оба блеба, чтобы полностью отсоединить яму. Включите функцию интраоперационной оптической когерентной томографии для визуализации образования блеба, гарантируя, что линейное и кубовое сканирование находится в режиме высокой четкости для получения изображения на ямке. Увеличьте разрез сетчатки до 1,5 миллиметров с помощью пары вертикальных витреоретинальных ножниц 25 калибра, чтобы обеспечить доступ к субретинальному пространству для трансплантации.Установите внутриглазное давление на 50 миллиметров ртутного столба. Используйте матовую силиконовую канюлю для удаления перфторуглеродной жидкости. Используйте 1,4-миллиметровый нож для разреза, чтобы продлить склеротомию.Введите 20-калибровочный расширяемый инструмент петли и удалите субмакулярный пигментный эпителий сетчатки хозяина путем соскоба. Вставьте наконечник стрелочного устройства через склеротомию и пройдите через стекловидное тело при внутриглазном давлении 20 миллиметров ртутного столба. Введите имплантат в субретинальное пространство через ретинотомический край, созданный из поверхности сетчатки со стороной клеточного носителя, обращенной к мембране Брукса, и ксенотрансплантатом, обращенным к фоторецепторам.Визуализируйте местоположение имплантата, включив функцию интраоперационной оптической когерентной томографии. Отрегулируйте положение имплантата с помощью субретинальной инъекционной канюли или изогнутых внутриглазных ножниц 25 калибра, чтобы имплантат опирался плоско на мембрану Брукса в субретинальном пространстве с неповрежденной вышележащей сетчаткой, а также располагался удаленно от созданной ретинотомии и не затрагивался в месте ретинотомии. Используйте матовую силиконовую канюлю для обмена жидкости и воздуха и осторожно аспирируйте субретинальную жидкость из отслоения сетчатки и аппозиции края ретинотомии до тех пор, пока сетчатка не будет вновь прикреплена к имплантату.Затем, чтобы закончить операцию, закройте рабочий порт склеротомии с помощью предварительно поставленного шва 7-0 Vicryl. Вводят 0,05 миллилитра на два миллиграмма интравитреального триамцинолона без консервантов в течение восьми часов склеротомии. Снимите люстру и настой канюлю.Закройте эти склеротомии викрильными швами. Пальпируйте глаз, чтобы убедиться, что внутриглазное давление находится в допустимом диапазоне. При необходимости впрыскивайте отфильтрованный воздух или BSS с помощью иглы 30 калибра.Визуализация in vivo субмакулярного пигментного эпителиального трансплантата левого глаза на различных методах визуализации проводилась в течение трех месяцев. Фотография глазного дна показала, что пересаженный трансплантат в ямке не мигрировал с течением времени. Аутофлуоресцентная визуализация глазного дна показала минимальные изменения в гиперавтофлуоресценции, перекрывающей пигментный эпителиальный трансплантат сетчатки.Ранняя и поздняя фаза флуоресцеиновой ангиографии глазного дна не показала какой-либо утечки, окружающей трансплантат. Изображения оптической когерентной томографии макулярной когерентности показали сохранение внешних слоев сетчатки над трансплантатом с течением времени, предполагая функциональность пигментных эпителиальных клеток сетчатки. Окрашивание HE показало неповрежденные слои сетчатки без признаков микроразрывов.Интраоперационная оптическая когерентная томография позволяет визуализировать размеры bleb и потенциальный интраоперационный разрыв ямки во время отслоения фовеала. Наличие разрыва может мешать образованию блеба. Об успешности правильного образования блеба свидетельствовало отсутствие разрыва.Для функциональной оценки сетчатки были выполнены полнопольные электроретинограммные оценки пигментного эпителия сетчатки ксенотрансплантированного глаза. Отсутствие значительного ухудшения форм сигналов электроретинограммы говорит о том, что функция как стержневых, так и конусных фоторецепторов поддерживалась с помощью ксенотрансплантатов. Во время создания локализованной сетчатки делайте это очень осторожно, так как любое внезапное изменение скорости струи может привести к разрывам фовеальной кости.Выполнение этого шага медленно является ключом к уменьшению травмы фовеала. Мультимодальная визуализация, включая автофлуоресценцию глазного дна, флуоресцеиновую ангиографию и оптическую когерентную томографию, наряду с электрофизиологическими исследованиями, может обеспечить более глубокое понимание живучести трансплантата и факторов, которые влияют на него.

Research

JoVE Journal

Medicine

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

Техники обработки глаз имплантировали протез для сетчатки Локализованные Гистопатологический анализ

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Отслойки Модель в Грызуны по субретинальной инжекции гиалуронат натрия

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Выполнение субретинальных инъекции грызунов для доставки пигментного эпителия сетчатки клеток в суспензии

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Методы обработки глаз имплантировали сетчатки протезирования для локализованных гистопатологического анализа: Часть 2 Epiretinal Имплантаты с сетчатки гвозди

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Количественный Fundus автофлюоресценции для оценки заболеваний сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Шаг за шагом для протокола субретинальной хирургии в Кролики

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Мышь Модель Ретинального ишемией реперфузии через Elevation внутриглазного давления

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Острый сетчатке Модель для оценки крови сетчатке Барьерные нарушения и потенциальных лекарственных препаратов для лечения

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus)

A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset Callithrix jacchus

Хирургическая процедура для администрации лекарства для внутреннего уха в Non-Human приматов общие игрунка (Callithrix jacchus)

Hearing research has long been facilitated by rodent models, although in some diseases, human symptoms cannot be recapitulated. The common marmoset ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Кислород-индуцированной ретинопатии Модель ишемической болезни сетчатки у грызунов

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...