Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منحة مشروع اكتشاف مجلس البحوث الأسترالي (DP180100111 إلى T.P. و N.E.S) ، ومنحة محقق مجلس الصحة والبحوث الطبية الوطني (GNT1175388 إلى N.E.S. ) وزمالة الأبحاث (APP1135928 إلى T.P.). ويعترف المؤلفان بمرافق المجهر الأسترالي في مركز المجهر المتقدم، الجامعة الوطنية الأسترالية، وهو مرفق تموله الجامعة والحكومة الاتحادية.

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

تثبيت الفورمالديهايد هو وسيلة مريحة وشعبية لتحقيق السريع في التشابك في الجسم الحي من الجزيئات الحيوية10،36،45،46،47،48. بالمقارنة مع أهداف الجزيئات الحيوية المحتملة الأخرى ، يتطلب الالتقاط الناجح للمجمعات التحويلية تثبيتا فوريا أثناء تقشعر لها الأبدان للخلايا أو غيرها من المواد. وبدون الاستقرار غير المحدد، هناك إمكانية لاستمرار العمليات المختلفة المتعلقة بالترجمة، وتحويل التوزيع المعقد بعيدا عن حالة الجسم الحي 49غير المضطربة. بالمقارنة مع الطرق الأخرى للاعتقال الترجمي والاستقرار المعقد الريبوسومي ، فإن سرعة عمل الفورمالديهايد عبر أغشية الخلايا والطبيعة العشوائية للروابط المتقاطعة تعد بالحفاظ على التنوع الأقصى للوسطاء مجمع الترجمة أقرب إلى دولهم الموزعة أصلا50.
وقد تم إنشاء النهج المعروض هنا وتحسينه في كل من خلايا الخميرة والثدييات ، وقد تم الآن اشتقاق الأساليب من قبل مجموعات أخرى لاستخدامها عبر مواد بيولوجية أكثر تنوعا ، كما هو الحال في الفقاريات الكاملة (على سبيل المثال ، أجنة حمار وحشي)10،38،39،49،51،52 . وعلى الرغم من أن هذه الأعمال تطمئن مجتمعة إلى تعدد استخدام النهج وقابليته للتطبيق على نطاق واسع، فإن الربط المتبادل السريع بين الفورمالديهايد للمجمعات التحويلية يمكن اعتباره صعبا إلى حد ما في نقلها إلى أنواع جديدة من المواد البيولوجية بسبب الحاجة إلى التحسين والتعديلات.
شرط قبل كل شيء لنجاح هذه الطريقة هو إعادة الأمثل لتركيز الفورمالديهايد وجمع الخلية وتقنية تعطيل. أقل نفاذية، خلايا الخميرة الصغيرة والجولة تتطلب أعلى من ذلك بكثير (على الأقل، 10 أضعاف) تركيز الفورمالديهايد والاضطراب البدني للخلايا الثابتة. وعلى النقيض من ذلك، يمكن بسهولة الإفراط في إصلاح خلايا الثدييات الكبيرة والمسطحة في الثقافة وتتطلب التعامل اللطيف عند التثبيت، في حين يمكن إجراء استخراج المجمعات الثابتة كيميائيا مع تعطيل الأغشية باستخدام المنظفات. قد يسمح الارتباط الناقص للوسطاء الأقل استقرارا أو الأكثر قصرا بالانفصاع أو التسرب إلى حالة لاحقة. قد يؤثر الإفراط في الربط المتبادل سلبا على القدرة على عزل ودراسة الكسور الريبوسومية ويمكن أن يخلق تحيزات انتقائية مثل استنفاد أعمق للمجمعات الثقيلة. في ملاحظتنا، حتى التعديلات الطفيفة، مثل نوع الخلايا البشرية الملتصقة المستخدمة، يمكن أن تؤثر على غلة المجمعات المترابطة المستردة وقد تتطلب إعادة تحسين نظام الربط المتبادل. يمكننا أيضا أن نتوقع أن الخلايا ذات خصائص نفاذية مختلفة إلى حد كبير ، مثل الخلايا النباتية ، سوف تتطلب تحسينا إضافيا واسع النطاق لظروف التثبيت52. ومع ذلك، من الصعب تصور نوع من المواد البيولوجية التي من شأنها أن تتعارض تماما مع النهج.
أحد الاعتبارات ذات الصلة ببروتوكول تثبيت الثدييات هو كثافة وكمية مواد الخلية المستخدمة كمدخلات. من المستحسن أن يكون الخلايا تنمو باستمرار دون إعادة البذر أو غيرها من الاضطرابات لمدة يومين على الأقل لتجنب التأثيرات الخارجية على ديناميات الترجمة الخلوية. ينطبق على معظم أنواع الخلايا، ولكن بالنسبة لغالبية الخلايا الملتصقة حققت باستمرار مستويات التقاء لا تزيد عن 70٪ سيضمن عدم وجود آثار تثبيط الاتصال الرئيسية التي يمكن أن تؤثر سلبا ولا يمكن التنبؤ بها معدلات الترجمة.
وثمة سمة أخرى مثيرة للاهتمام، وربما مريحة بشكل فريد، من تثبيت الفورمالديهايد الناجمة عن التفاعل العشوائي هو تأثير الاستقرار على المجمعات التحويلية في أنظمة التصنيف المختلط. البكتيرية ، وحتى أكثر من ذلك المجمعات المترجمة من الميتوكوندريا ، الكلوروبلاستات والطفيليات داخل الخلايا المختلفة ، كان من الصعب استهدافها بمثبطات ترجمة محددة. في المقابل ، في بيانات TCP-seq ، يمكن ملاحظة رسم خرائط آثار الأقدام إلى mitotranscriptome بسهولة في البيانات38و39و50. ومن التطورات اللاحقة المثيرة للاهتمام استخدام النهج للتحقيق في الترجمة في اتصالات دقيقة كاملة، كما هو الحال في عينات التربة أو المياه أو الأمعاء، حيث يكون الاعتقال السريع الموثوق به وتثبيت الاستقرار المعقد بأي وسيلة أخرى أمرا إشكاليا.
وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه بالنسبة للمواد الأكثر تعقيدا (مثل الأنسجة الصلبة و / أو الضخمة) ، لا شيء يمنع استخدام تثبيت الفورمالديهايد فور انقطاع الخلية وتجانس المواد. هذا النهج يستخدم بالفعل في كثير من الأحيان لإزالة تأخير دخول الخلية عند استقرار المجمعات الترجمية مع مثبطات جزيء صغير محدد33،53،54،55. وبالنظر إلى أن تثبيت الفورمالديهايد قد استخدمت تقليديا مع نتائج ممتازة لتثبيت العينة في الجسم الحي / في المختبر السابق في تطبيقات مثل المجهر الإلكتروني45،56،57،58، يمكننا أن نتوقع تأثيرات سلبية أقل في هذه الحالة ، لا سيما تلك المرتبطة باستخراج الفقراء من المجمعات التحويلية من الخلايا الثابتة تماما.
تؤكد النتائج التي توصلنا إليها قابلية تثبيت الفورمالديهايد السريع لتحقيق الاستقرار في المجمعات العابرة للغاية ، مثل تلك التي تشمل eIF4A. ومن الجدير بالذكر أنه على النقيض من الثدييات، ترتبط الخميرة eIF4A بشكل أضعف بكثير مع eIF4F المعقد الملزم للغطاء، ونتيجة لذلك، المجمعات التحويلية بشكل عام. عادة ما يتم فقدان eIF4A خلال أي تنقية واسعة النطاق للمادة ريبوسومات في الخميرة29،59،60،61،62،63. ومع ذلك ، في المواد الخميرة في الجسم الحيالثابت ، فمن الممكن تحقيق إثراء موثوق بها من eIF4A في جميع أجزاء المجمعات التحويلية حيث سيكون من المتوقع وجودها. وقد أظهرت البيانات المنشورة سابقا Sel-TCP-seq إثراء eIF2 و eIF3 التي ترتبط بقوة أكبر مع الريبوسومات (ولكن كشفت أيضا عن حدوث عابر مجمع البروتين المشترك الترجمي التجميع)39. وهكذا، فإن الطريقة مناسبة للكشف عن كل من المكونات المرفقة أقوى وأضعف من المجمعات الترجمية.
باختصار، قدمنا نهجا مفيدا للحصول على رؤى في المقام الأول حول التغيرات التي تحدث في مرحلة بدء الترجمة وعندما يكون التوزيع الريبوسومي المضطرب على الحمض النووي الريبي مطلوبا. والأهم من ذلك، أن هذا النهج مناسب لتثبيت المكونات الشفهية والدينامية نسبيا للمجمعات التحويلية، مثل eIF4A، ويمكن استخدامه على نطاق واسع رهنا بالتحسينات اللازمة. كما قدمنا أدلة على فائدة تثبيت الفورمالديهايد في سيناريوهات التغير الديناميكي السريع للترجمة، وفتح مجالات التحقيق مثل الاستجابات الخلوية سريعة الخطى للتغيرات البيئية أو ظروف الإجهاد.

تخضع الكائنات الحية لتغيرات ديناميكية داخل وخارج الخلية عبر عمرها ، والتي تتطلب استجابات سريعة للحفاظ على التوازن وضمان البقاء على قيد الحياة. للسماح للتكيف البيئي، تضبط الخلايا النواة عملية التمثيل الغذائي الخاصة بها عن طريق التحكم في التعبير الجيني. يمكن ممارسة التحكم في التعبير الجيني أثناء النسخ و / أو الترجمة؛ مع ردود الترجمة تحدث عموما بسرعة أكبر1،2،3،4. على سبيل المثال، عادة ما تنشأ التغيرات التحويلية في غضون 1-30 دقيقة من بداية الإجهاد، في حين أن التعديلات على مستوى النسخ تتبع ساعات بعد التعرض للإجهاد3و4و5. يتم تحقيق التعديلات على إخراج الترجمة بسرعة أكبر بسبب التوافر المستمر لجزيئات الحمض النووي الريبي messenger (m) في السيتوبلازم. على العكس من ذلك ، على مستوى النسخ ، يجب توليف جزيئات مرنا جديدة ، وفي eukaryotes ، معالجتها وتصديرها من النواة ، مما يؤدي إلى تأخيرات واسعة في وقت الاستجابة2،4،6،7،8.
تتميز الاستجابة الترجمية الحادة للإجهاد بشكل عام بانخفاض إجمالي في ناتج الترجمة ، مع التنظيم الانتقائي للبروتينات اللازمة لبقاء الخلية1,3,4,9. ويعتقد أن خفض إنتاج البروتين الإنتاج أن تكون حاسمة بسبب ارتفاع نفقات الطاقة لعملية3,7. ولتيسير التثبيط والتنظيم الانتقائيين، تخدم الاستجابات التحويلية مجموعة من الآليات التنظيمية المعقدة. يمكن ممارسة التنظيم عبر جميع مراحل الترجمة: بدء، استطالة، إنهاء التمثيل الحيوي متعدد الببتيد وإعادة التدوير الريبوسومي10,11,12,13، ولكن يتم عرضها بقوة في مرحلة البدء5,7,9,10,13. أثناء البدء ، يرتبط الوحدة الفرعية الريبوسومية الصغيرة (SSU) ، بمساعدة عوامل البدء eukaryotic (eIFs) ، بالمنطقة غير المترجمة 5 (UTR) من الحمض النووي الريبي (MRNA) حتى يتم التعرف على كودون البداية2,5,6,8,11,12,13. غالبا ما تستهدف الآليات التنظيمية صناديق الاستثمار الإلكترونية التي تؤثر على المرفقات والمسح الضوئي وبدء التعرف على كودون. على سبيل المثال، عامل البدء eIF2، عامل ترجمة أساسي يساعد في توظيف البادئ Met-tRNAiMet إلى SSU، وغالبا ما تستهدف في eukaryotes تحت ظروف الإجهاد4,6,11. في الخميرة ، يمكن أن يسبب الفوسفور من هذا العامل تحت الحرمان من المغذيات والإجهاد التناضحي1,4,11,14,15، وفي خلايا الثدييات، قد تؤدي مجاعة الأحماض الأمينية، والإجهاد الشبكي الإنوبلازمي (ER)، والإجهاد فوق البنفسجي، والعدوى الفيروسية، ومستويات الأكسجين المتغيرة إلى هذه الاستجابة8,9,11. ويتجلى التنظيم السريع لترجمة محددة من الحمض النووي الريبي في استجابة خلايا الثدييات لنقص الأكسيجة، الذي يظهر تثبيطا عالميا للترجمة السريعة وأعلى تنظيما انتقائيا لعوامل نقص الأكxia-inducible (HIFs) التركيب الحيوي. HIFs هي عوامل النسخ ، والتي تثير بعد ذلك إعادة برمجة خلوية على المدى الطويل على مستوى نسخ الحمض النووي8,9,16. وقد لوحظت استجابات مماثلة في الخميرة تحت الضغط الحراري، مع التعبير السريع عن بروتينات الصدمة الحرارية (HSPs) تليها استجابات متأخرة على مستوى النسخ17,18. بالإضافة إلى الحرمان من المغذيات والصدمة الحرارية، تمت دراسة الاستجابات التحويلية في الخميرة تحت الأكسجين متفاوتة8,19ملوحة5، الفوسفات، الكبريت20,21 والنيتروجين22,23 المستويات. هذا البحث له آثار واسعة النطاق على الاستخدامات الصناعية للخميرة، مثل الخبز والتخمير24,25. قد تكون الاستجابات الترجمية مفيدة أيضا في تعزيز فهم أمراض مثل الاضطرابات العصبية وأمراض القلب ، والتي تتميز بضغوط داخل الخلايا مثل الإجهاد التأكسدي. وعموما، فإن الاستجابات التحويلية جزء لا يتجزأ من التحكم في التعبير الجيني وتيسر التكيف السريع مع مجموعة واسعة من ظروف الإجهاد في الكائنات الحية النواة.
من أجل دراسة الاستجابات الترجمية، هناك حاجة إلى أساليب توفر لقطات مشوهة الحد الأدنى من المشهد الترجمة. التنميط المتعدد هو نهج كلاسيكي يستخدم في دراسة الترجمة عبر مرنا ، والتي تنطوي على فصل الكسور السومالية البولي (ريبو) من مرنا عن طريق الطرد المركزي الفائق من خلال تدرجات السكروز26،27. ويمكن استخدام هذا النهج لاستكشاف مستويات الترجمة لmRNAs الفردية (مع أساليب الكشف مثل النسخ العكسي والبوليميراز سلسلة من ردود الفعل، RT-PCR26)،أو على الصعيد العالمي جنبا إلى جنب مع تقنيات عالية الإنتاجية (microarray أو RNA-seq28،29). وهناك نهج أكثر تطورا هو التنميط ريبوسوم، التي تسمح لدراسة مواقف ريبوسومات ممدود على طول جزيء مرنا على نطاق الجينوم على نطاق واسع، فضلا عن استنتاج كفاءة الترجمة عبر النسخ واستخدام مواقع البدء الرئيسية والبديلة30،31. التنميط ريبوسوم ينطوي على عزل وتسلسل شظايا مرنا محمية من قبل وجود ريبوسوم عليها. وقد وفرت التنميط ريبوسوم نظرة ثاقبة كبيرة في ديناميات الترجمة عبر عدد من الشروط، بما في ذلك الإجهاد نقص الأكدمة، صدمة الحرارة والإجهاد التأكسدي31،32. وقد تم تكييف هذه التقنية لأنواع المواد مصدر متعددة، بما في ذلك خلايا الخميرة والثدييات.
في حين أن التنميط المتعدد والريبوسوم كان أساسيا في توسيع قدرات البحث في الترجمة ، فإن عملية الترجمة تشمل مختلف الوسائط والمجمعات المترجمة التي يصعب التقاطها بهذه الأساليب11و13. وهناك قيد إضافي ينبع من عدم القدرة على دراسة أنواع الاستجابة السريعة، حيث تستقر المجمعات التحويلية إما في الجسم الحي بإضافة مثبطات ترجمة محددة (المضادات الحيوية)، مما يؤدي إلى بعض القطع الأثرية لتوزيع الريبوسوم، أو الجسم الحي السابق عند تحلل الخلايا على وجه التحديد (المضادات الحيوية) أو بشكل غير محدد (الملح العالي أو أيونات المغنيسيوم)، مما يؤدي إلى حرمان الوسيطات الأقصر عمرا أو الأقل استقرارا33، 34،35.
يستخدم الفورمالديهايد على نطاق واسع للأحماض النووية والبروتينات المتقاطعة، كما هو الحال في دراسات التكفيرية المناعية الكروماتينية (ChIP) والدراسات المناعية المتقاطعة (CLIP). حجمها الصغير و نفاذية الخلية ممتازة تسمح لسرعة في عمل الجسم الحي 36. استنادا إلى الفورمالديهايد السريع الوصلات المتقاطعة، تم تمديد نهج التنميط ريبوسوم مع تسلسل ملف تعريف مجمع الترجمة (TCP-seq)10،36،37،38،39،40. TCP-seq، وضعت لأول مرة في الخميرة، ويسمح لالتقاط جميع وسيطة الترجمة، بما في ذلك المسح الضوئي أو بعد إنهاء مجمعات SSU وتكوينات ريبوسومات متعددة37،38،41،42. وقد استخدمت هذه الطريقة في العديد من الدراسات10،38،39،41،42، وبعضها يستخدم نهجا الجمع بين كل من مثبطات الترجمة والفورمالديهايد المترابطة لتسهيل القبض على الترجمة. نسخة معدلة أخرى من هذه التقنية ، انتقائية TCP - seq39، وقد استخدمت مؤخرا لتشمل مناعة المجمعات المترابطة ، وتوسيع نطاق التطبيقات TCP - seq. إن الطبيعة السريعة والفعالة والغبيلة للربط بين الفورمالديهايد تجعل هذه النهج مناسبة لدراسة التفاعلات المعقدة العابرة لل ميرنا: الترجمة، لا سيما في سياق مسارات الاستجابة الديناميكية للغاية على مستوى الترجمة.
هنا نحن بالتفصيل عمليات في فيفو الفورمالديهايد الترابط لغرض تحقيق الاستقرار الشامل المعقدة الترجمة والعزلة. نحن نقدم بروتوكولات منفصلة دقيقة للخميرة وخلايا الثدييات (الشكل 1). كما نوضح أمثلة الاستخدام اللاحق للمواد المثبتة عبر الوصلات(الشكل 1)،مثل الكشف عن عوامل البروتين المنقى باستخدام الانتفاخ المناعي (النشاف الغربي)، أو التنقية بمساعدة المناعة (أو "الانتفاخ المناعي"؛ الملكية الفكرية) وإثراء المجمعات الترجمية التي تحتوي على عوامل محددة ذات أهمية، المجهر الإلكتروني وتسلسل الحمض النووي الريبي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> الشكل 1:تخطيطي يصور نظرة عامة على الإعداد التجريبي النموذجي. الخطوات الرئيسية لتثبيت الفورمالديهايد في الجسم الحي للمجمعات الترجمية يتم تصويرها على أنها مخطط انسيابي ، تكملها معلومات حول الصكوك الضرورية الرئيسية. وترد الخطوط العريضة للتطبيقات المحتملة للمواد المترابطة، بما في ذلك الأمثلة التي استخدمت بنجاح ولكن لم يتم تغطيتها مباشرة في هذا البروتوكول، مثل تنقية حبة SPRI من الحمض النووي الريبي، وتسلسل الحمض النووي الريبي، وقياس الطيف الكتلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

الاستجابات السريعة التي تنطوي على إعادة توزيع سريع من رسول (م) الجيش الملكي النيبالي والتعديلات من ترجمة مرنا هي ذات الصلة إلى التعديلات المنزلية الجارية من الخلايا. هذه التعديلات حاسمة للبقاء على قيد الحياة الخلايا eukaryotic و "السيطرة على الضرر" خلال مستويات المغذيات والملوحة المتقلبة، ودرجة الحرارة، ومختلف الضغوط الكيميائية والإشعاعية. نظرا للطبيعة الديناميكية للغاية للاستجابات على مستوى الحمض النووي الريبي ، وعدم استقرار العديد من الحمض النووي الريبي: الحمض النووي الريبي والجيش الملكي النيبالي: وسيط البروتين ، فإن الحصول على لقطة ذات مغزى لحالة الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي ممكن فقط مع عدد محدود من الطرق. تعد تجارب التنميط الريبوسومية المستندة إلى الحمض النووي الريبي على نطاق النسخ من بين أكثر مصادر البيانات بالمعلومات للتحكم في الترجمة. ومع ذلك، يمكن أن يؤدي غياب الحمض النووي الريبي الموحد ورنا: استقرار البروتين المتوسط إلى تحيزات مختلفة، لا سيما في مسارات الاستجابة الخلوية سريعة الخطى. في هذه المقالة، ونحن نقدم بروتوكول مفصل من التثبيت السريع المطبق على الخلايا eukaryotic نفاذية مختلفة، للمساعدة في الجيش الملكي النيبالي والجيش الملكي النيبالي:استقرار البروتين المتوسط. كما نقدم أمثلة لعزل RNA المستقرة: مجمعات البروتين على أساس الترسيب المشترك مع الكسور الريبوسومية والبولي (ريبو) السخامية. يمكن استخدام المواد المثبتة المنفصلة لاحقا كجزء من تجارب من نوع التنميط الريبوسومي ، كما هو الحال في نهج تسلسل ملف تعريف مجمع الترجمة (TCP-seq) ومشتقاته. وقد تجلى الآن براعة أساليب TCP-seq على غرار التطبيقات في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية وأنواع الخلايا. ويمكن أيضا أن تكون المجمعات استقرت بالإضافة إلى ذلك تقارب تنقية وتصويرها باستخدام المجهر الإلكتروني، وفصلها إلى كسور مختلفة بولي (ريبو) سومال وتعرض لتسلسل الحمض النووي الريبي، وذلك بسبب سهولة انعكاس الربط العرضي. لذلك ، يمكن أن تكون الطرق القائمة على تثبيت snap-chilling والفورمالديهايد ، تليها الترسيب القائم أو أي نوع آخر من الإثراء المعقد للبروتينات : RNA ، ذات أهمية خاصة في التحقيق في التفاصيل الدقيقة لديناميكيات RNA:protein complex في الخلايا الحية.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

نحن نقدم تقنية لتحقيق الاستقرار السريع في المجمعات التحويلية (التمثيل الحيوي البروتيني) مع الفورمالديهايد المترابطة في الخميرة الحية وخلايا الثدييات. النهج يتيح تشريح وسيطة عابرة وديناميكية الحمض النووي الريبي: التفاعلات البروتين. يمكن استخدام المجمعات المترابطة في تطبيقات متعددة في المصب مثل طرق التنميط العميق المستندة إلى التسلسل ، والتنظير الدقيق ، وقياس الطيف الكتلي.

تثبيت سريع في Vivo وعزل المجمعات الترجمية من الخلايا Eukaryotic

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

يتكون سير العمل من خلايا متنامية في ظروف بيئية خاضعة لرقابة صارمة ، وتقشعر لها الأبدان بسرعة باستخدام ذوبان الماء / الجليد وإصلاح مع تركيز الأمثل مسبقا من الفورمالديهايد ووقت الحضانة. ثم يتم إخماد رد فعل التثبيت باستخدام فائض من المركبات الأولية التي تحتوي على مجموعة أمينية، مثل الجليسين أو التريبس. يتم جمع الخلايا وغسلها ويمكن تخزينها مجمدة.يمكن أن يتم الخلايا الثابتة ميكانيكيا أو كيميائيا، ويستخدم ليسات لفصل الكسور الريبوسومية على أساس حجمها الجزيئي، خصائص الترسيب أو علامات تقارب. وينتج عن هذا النهج مواد متعددة الاستخدامات قابلة للاستخدام للتنقية والكشف بمساعدة المناعة، وإثراء المجمعات التي تحتوي على عوامل محددة في المجهر الإلكتروني. عند الحجب العميق المترابط ، يصبح تضخيم الحمض النووي الريبي أو التحليلات القائمة على التهجين ، تسلسل الحمض النووي الريبي وقياس الطيف الكتلي ممكنا.إعداد ثقافة الخميرة لتر واحد في شاكر المدارية مع كثافة بصرية بدءا لا يزيد عن 0.05 وحدات امتصاص في 600 نانومتر واستخدام وسائل الإعلام بيبتون وديكستروز في 30 درجة مئوية. إعداد جهاز طرد مركزي مع الدوار متوافق وزجاجات الطرد المركزي ل بيليه تعليق السائل من خلايا الخميرة في 5000 G في أربع درجات مئوية. الاحتفاظ بسجل للكثافة البصرية للخلايا المتنامية.يجب أن يكون بين 0.6 إلى 0.8 وحدة امتصاص و 600 نانومتر في وقت الجمع إذا كانت مرحلة النمو الأسي ذات أهمية. مرة واحدة في الخلايا جاهزة، وإعداد icebox داخل غطاء محرك السيارة الدخان الكيميائي مع خباز يحتوي على 250 غراما من الجليد المياه المسحوقة نظيفة وتظهر لك أيضا 25 ملليلتر تريبسين والميثانول المشتراة حديثا استقرت 37٪ حل الفورمالديهايد داخل غطاء محرك السيارة. صب ثقافة الخلية الأخيرة في الخباز الذي يحتوي على الجليد.ثم أضف 75 ملليلتر من 37٪ الفورمالديهايد إلى تركيز نهائي من 2.2٪ الوزن على حجم تحريك الخليط بشكل مكثف حتى يذوب الجليد. بمجرد ذوبان الجليد، قم بإعداد جهاز توقيت لمدة 10 دقائق بعد احتضانه لمدة 10 دقائق، ونقل الثقافة إلى زجاجات الطرد المركزي المبردة مسبقا وكريه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أربع درجات مئوية، 5000 غرام لمدة خمس دقائق. في حين أن تدور هو، على ما قبل تبريد أنبوب 50 ملليلتر والحفاظ على العازلة الطازجة A التي تحتوي على الجليسين لتحييد أي الفورمالديهايد المتبقية على الجليد.بعد الطرد المركزي، ضع أنابيب الطرد المركزي على الجليد مع جانب بيليه في اتصال مع الجليد. جلب الأنابيب في غطاء الدخان والتخلص من supernatant في حاوية النفايات الفورمالديهايد. إعادة تعليق بيليه الخلية من الأنابيب القديمة في 20 ملليلتر من العازلة A باستخدام شريط 25 ملليلتر ونقلها إلى أنبوب 50 ملليلتر.تشكل حجم إلى 40 ملليلتر مع العازلة A وجمع خلايا الغسيل عن طريق الطرد المركزي من أربع درجات مئوية، 5000 G لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 40 ملليلتر العازلة واحد، وهو العازلة A لا تحتوي على الجليسين لإزالة التلوث الجليسين. بيليه الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي في أربع درجات مئوية، 5000 G خمس دقائق.كرر يغسل مع العازلة واحد، مرة أخرى. تجاهل supernatant ووضع بيليه الخلية على الجليد. وزن أنبوب مع بيليه، يجب أن تكون كتلة الخلية الرطب غرام واحد تقريبا لكل لتر واحد من ثقافة الخلية.ملء البوليسترين من مربع اصطف مع رقائق الألومنيوم مع النيتروجين السائل إلى عمق ما يقرب من ثلاثة سنتيمترات. ضعه في أنبوب 50 ملليلتر منتصبا في الصندوق. إعادة تعليق بيليه في 550 ميكرولتر من العازلة ألف اثنين عن طريق الأنابيب ودوامة لمدة 10 ثوان.إضافة 10 ميكرولتر من 40 وحدة لكل مثبط RNase ميكروليتر ودوامة مرة أخرى لمدة 10 ثانية. باستخدام ماصة ملليلتر واحد، بالتنقيط تعليق الخلية في 50 ملليلتر اثنين تحتوي على النيتروجين السائل. للتحضير للخطوة التالية، قبل بارد 1.5 ملليلتر نواة أنابيب مجانية على الجليد الجاف و 10 ملليلتر من الفولاذ المقاوم للصدأ طحن الجرار.نقل قطرات تعليق الخلية المجمدة في الجرار باستخدام ملعقة معقمة نظيفة. غمر الجرار طحن في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة، وضمان المرحلة السائلة لا يزال فوق تقاطع. إعداد مطحنة خلط كريو في 27 هيرتز للهياج لمدة دقيقة واحدة.هياج الجرار طحن مختومة في 27 هيرتز لمدة دقيقة واحدة في طاحونة خلاط. إعادة تبريد الجرار في النيتروجين السائل كما كان من قبل ويهز لمدة دقيقة واحدة أخرى. نقل الجرار إلى مربع الجليد التي تحتوي على الجليد الجاف جنبا إلى جنب مع أنابيب نواة خالية 1.5 ملليلتر.باستخدام ملعقة الصلب الصغيرة نقل النتائج في تاريخ طحن مبطن في الأنابيب. ثم تخزين الأنابيب في ناقص 80 درجة مئوية. في اثنين من قوارير T175 تنمو HEK 293 خلايا إلى 60 إلى 70٪ التقاء وDalbeko المعدلة النسر المتوسطة و 10٪ مصل البقر الجنين في 37 درجة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.قبل ثلاث ساعات على الأقل من وقت التثبيت المطلوب، استبدل وسائط قارورة T175 ب 30 ملليلتر من الوسائط الكاملة التي تم تسخينها مسبقا. إعداد صندوق الثلج إلى حافة مع الجليد المياه سحقت والحفاظ على غطاء محرك السيارة الدخان جنبا إلى جنب مع المخازن المؤقتة المطلوبة، وأيضا الجليد. لالتقاط البرد الخلايا، وإزالة قارورة T175 من الحاضنة واضغط رسميا ضد الجليد ضمان أقصى قدر من الاتصال السطحي.داخل غطاء الدخان الكيميائي، إمالة القارورة على جانبها بحيث تجمع وسائل الإعلام على الجانب المقابل للخلايا. ماصة 168 ميكرولتر من 37٪ وزنها من قبل حجم الفورمالديهايد مباشرة في وسائل الإعلام المجمعة. إعطاء تركيز نهائي من 0.2٪ الفورمالديهايد.اخلط على الفور. احتضان القوارير على الجليد لمدة 10 دقائق أخرى. صب قبالة وسائل الإعلام في حاوية النفايات المناسبة من خلال الجانب قارورة مقابل الخلايا.باستخدام strippete، ماصة في 30 ملليلتر من فوسفات دالبيكو عازلة المالحة دون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم وبالإضافة إلى ذلك تحتوي على 50 ملليمولار الجليسين بلطف على الجانب المقابل للخلايا. تخلط عن طريق هزاز القارورة، والعودة فلاش إلى الوضع الأفقي واحتضان لمدة 10 دقائق أكثر على الجليد. صب قبالة الحل من خلال الجانب قارورة مقابل الخلية وإضافة بلطف سبعة ملليلتر من معيار 0.25٪ trypsin EDTA حل لفصل وإعادة تعليق الخلايا.احتضان القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، إلى أقصى حد 10 دقائق. حدد موقع القارورة عموديا واستخدام strippete، وجمع الخلايا المنفصلة عن طريق غسل بلطف أي المتبقية من جدران القارورة ونقل التعليق إلى أنبوب 50 ملليلتر تعيين على الجليد. تكملة فورا حل تعليق جمعها مع 20 ملليلتر من وسائل الإعلام كاملة ومزيج عن طريق التقليب بلطف الأنبوب.بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أنبوب 100 غرام لمدة خمس دقائق وأربع درجات مئوية. يجب أن تكون بيليه الخلية واضحة للعيان. صب قبالة وسائل الإعلام وإعادة تعليق بلطف بيليه في 10 ملليلتر من الفوسفات دالبيكو المخزنة المالحة مع عدم وجود الجليسين.الطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى في 100 G لمدة خمس دقائق وعلى أربع درجات مئوية صب قبالة العازلة غسل وإعادة تعليق بيليه في 800 ميكرولتر من الجليد الباردة فوسفات دالبيكو عازلة المالحة مع عدم وجود الجليسين، ولكن تحتوي على المغنيسيوم أيونات الكالسيوم. نقل الخلايا إعادة تعليقها في بروتين منخفض جديد ملزمة 1.5 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي الدقيق. طرد أنبوب في 100 G لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية.تجاهل بعناية supernatant باستخدام ماصة ملليلتر واحد. في هذه المرحلة، يمكن تجميد بيليه الخلية في ناقص 80 درجة مئوية أو المضي قدما إلى خطوة تحلل الخلية. في خزانة السلامة الحيوية إضافة 300 ميكرولتر من العازلة تحلل على أساس المنظفات غير الأيونية، غير denaturing، وسبعة ميكرولترات من مثبط أرجيناسي وتخلط بشكل جيد عن طريق الأنابيب باستخدام طرف واحد ملليلتر.إرفاق بعناية إبرة قياس 25 إلى حقنة 1-3 ملليلتر وماصة بقوة الخليط باستخدام ما لا يقل عن سبعة كمية بطيئة صعودا والسكتات الدماغية العادم سريع إلى أسفل. تجاهل الحقنة والإبرة في سلة المهملات الحادة وكرر الإجراء بإبرة قياس 31 وحقنة 0.3 ملليلتر. تجاهل الحقنة والإبرة في سلة المهملات الحادة.طرد أنبوب في 12, 000 G لمدة خمس دقائق في أربع درجات لإزالة حطام الخلية. نقل supernatant إلى بروتين منخفض جديد ملزمة 1.5 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي الدقيق. تخزين كل من حطام الخلية وlysate في ناقص 80 درجة مئوية.المجمعات الترجمية حساسة للتكوين الأيوني للمخازن المؤقتة. حذف كلوريد المغنيسيوم وإضافة خصائص الترسيب العالية التي ألغيت EDTA ، وبينما أدى كلوريد الكالسيوم إلى قمم نتائج أفضل ، كان التحسن هامشيا. وهكذا اخترنا العازلة واحدة.2.2٪ الوزن من حيث الحجم الفورمالديهايد الحفاظ بشكل ممتاز على البوليسومات ولم يقلل من العائد العام مقارنة مع 4٪ الوزن من حيث الحجم الفورمالديهايد. في خلايا الثدييات، تم استخدام تركيز أقل بكثير من الفورمالديهايد من 0.2٪ الوزن من حيث الحجم. كما أدى ارتفاع تركيزات في فقدان المواد المتعددة الريبوسومات كبيرة.15 ملليمولار EDTA إضافة إلى lysate وجميع المخازن المؤقتة اللاحقة أظهرت تأثير زعزعة استقرار أقل بشكل مميز على كسور متعددة الخلايا، المستمدة من الخلايا الثابتة. وقد تكرر هذا التأثير جزئيا مع EDTA 50 ملليمولار مع مواد من 4٪ خلايا ثابتة، ومقاومة، تتكشف بشكل أفضل. استنفاد الجلوكوز يثير واحدة من الآثار المثبطة الأكثر دراماتيكية وسريعة على الخميرة.وأضاف كل من العصب وتسبب محليا الظروف الناجمة عن تفكيك متعدد الأضلاع كان قليلا، ولكن من الواضح أن أكثر البوليسومات الاحتفاظ بها في انخفاض الجلوكوز المضافة. الأهم من ذلك، المواد متعددة الخلايا من الخلايا الثابتة يدل على وجود تمييز كبير بين الخلايا المتعطشة وغير المتعطشة مما يدل على مدى ملاءمة تثبيت الفورمالديهايد للحفاظ على الاختلافات في العمليات التحويلية الديناميكية. في نهج مثل بايساكي تاي، قد يكون بالإضافة إلى الثاقبة لإزالة الوحدات الفرعية الريبوسومية الصغيرة التي لا تشارك في تسوية بشكل جيد مع رهيزوميس كاملة التي استخدمناها جهاز طرد فائق على مرحلتين، مما يسمح لعزل SSU، LSU، RS، RNase الديازيوم المقاوم، DS، والبوليسومات عالية الترتيب التي أكدها المجهر الإلكتروني من الكسور الثابتة.وبالمقارنة مع الخلايا غير الثابتة، أظهرت المواد المأخوذة من الخلايا الثابتة وجودا مرتفعا للفصيل eIF4A في أسرع كسور ريبوسومية مترسبة. باستخدام مواد ثابتة من سلالة تابي eIF4A لالتقاط وإثراء eIF4A تحتوي على مجمعات مع حبات IDG المغناطيسية ، تمكنا من مراقبة الإثراء الانتقائي للeIF4A مقارنة بيتا أكتين في SSU و RS ، ولكن ليس كسور LSU من التدرج الثاني على RNase واحد تفكيك. بالمقارنة مع غيرها من أساليب الراحة النقلية ، فإن سرعة عمل الفورمالديهايد عبر أغشية الخلايا والطبيعة العشوائية للروابط المتقاطعة تبشر بالحفاظ على أقصى قدر من التنوع في وسيطات الترجمة المعقدة.النتائج التي توصلنا إليها تتوافق مع قابلية استخدام تثبيت الفورمالديهايد السريع لتحقيق الاستقرار في المجمعات العابرة للغاية وفائدة الأدلة في سيناريوهات الاستجابات الخلوية السريعة للتغيرات البيئية أو ظروف الإجهاد.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

إنشاء الميكروبية إثراء الثقافات حقيقية النواة من بحيرة القطب الجنوبي الطبقية كيميائيا وتقييم القدرة على تثبيت الكربون

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من<em&gt; thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; بذور

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

تنقية الجينوم على نطاق خارج الصبغي التعميم الحمض النووي من خلايا حقيقية النواة

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...