Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
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这项工作得到了澳大利亚研究委员会发现项目赠款（DP180100111至T.P.和N.E.S.），国家卫生和医学研究委员会研究员资助（GNT1175388至N.E.S.）和研究奖学金（APP1135928至T.P.）的支持。作者承认澳大利亚国立大学高级显微镜中心的澳大利亚显微镜设施，该设施由大学和联邦政府资助。

作者声明没有利益冲突。

甲醛固定是实现生物分子10、36、45、46、47、48体内快速交联的一种方便而流行的方法。与其他潜在的生物分子靶标相比，成功捕获转化复合物需要在细胞或其他材料的快速冷却期间立即固定。如果没有未完成的稳定性，则有可能继续进行与翻译相关的不同过程，从而将复杂分布从未扰动的体内状态49转移开来。与其他转化停滞和核糖体复合物稳定化方法相比，甲醛作用在细胞膜上的迅速性和交联的不加区分性保证了翻译复合物中间体的最大多样性，更接近其天然分布状态50。
这里介绍的方法已经在酵母和哺乳动物细胞中建立和优化，并且现在已经被其他组衍生出来用于更多样化的生物材料，例如在整个脊椎动物（例如，斑马鱼胚胎）10，38，39，49，51，52.虽然这些工作共同保证了该方法的多功能性和广泛适用性，但由于需要优化和调整，翻译复合物的快速甲醛交联可以被认为是难以转置到新型生物材料上的。
该方法成功的首要要求是重新优化甲醛浓度以及细胞收集和破坏技术。渗透性较差，小而圆的酵母细胞需要更高（至少10倍）甲醛浓度和固定细胞的物理破坏。相比之下，培养物中大型和扁平的贴壁哺乳动物细胞很容易过度固定，并且在固定时需要轻柔处理，而固定复合物的提取可以使用洗涤剂通过膜破坏进行化学操作。交联不足可能允许不太稳定或寿命较短的中间体解离或泄漏到较晚的状态。过度交联可能会对分离和研究核糖体组分的能力产生负面影响，并可能产生选择性偏倚，例如重质复合物的更深层消耗。在我们的观察中，即使是微小的改变，例如所使用的贴壁人细胞的类型，也会影响回收的交联复合物的产量，并且可能需要重新优化交联方案。我们还可以预测具有实质上不同渗透性性质的细胞，例如植物细胞，将需要对固定条件进行额外的广泛优化52。然而，很难想象一种生物材料会与这种方法完全不相容。
与哺乳动物固定方案相关的一个考虑因素是用作输入的细胞材料的密度和数量。建议让细胞连续生长，无需重新接种或其他干扰至少2天，以避免对细胞翻译动力学的外部影响。适用于大多数细胞类型，但对于大多数贴壁细胞，始终如一地达到不超过70%的汇合水平将确保没有主要的接触抑制作用，这些效应会对翻译速率产生负面影响和不可预测的影响。
甲醛固定的另一个有趣且可能特别方便的特征源于其不分青红皂白的反应性，即混合分类学系统中对转化复合物的稳定作用。细菌，尤其是线粒体、叶绿体和不同细胞内寄生虫的转化复合物，一直难以用特定的翻译抑制剂靶向。相反，在TCP-seq数据中，映射到线切割转录组的足迹在数据38，39，50中很容易观察到。一个有趣的后续发展可能是使用这种方法来研究整个微群落中的翻译，例如在土壤，水或肠道样本中，可靠的快速翻译停滞和使用任何其他手段的复杂稳定将是有问题的。
还应该提到的是，对于最复杂的材料（例如坚硬和/或笨重的组织），没有什么可以阻止在细胞破碎和材料均质化后立即使用甲醛稳定。这种方法已经经常用于消除用特定的小分子抑制剂33，53，54，55稳定翻译复合物时的细胞进入延迟。鉴于甲醛固定传统上在电子显微镜45，56，57，58等应用中用于体外/体外样品稳定具有出色的效果，在这种情况下，我们可以预期更少的负面影响，特别是那些与从完全固定的细胞中提取转化复合物的不良相关的负面影响。
我们的发现证实了快速甲醛固定的可用性，以稳定高度瞬态的复合物，例如那些含有eIF4A的复合物。值得注意的是，与哺乳动物相比，酵母eIF4A与盖结合复合物eIF4F的相关性要弱得多，因此通常与转化复合物相关。eIF4A通常在酵母29，59，60，61，62，63中的核糖体材料的任何广泛纯化过程中丢失。然而，在体内固定酵母材料中，可以在预期其存在的所有转化配合物中实现eIF4A的可靠富集。先前发表的Sel-TCP-seq数据已经证明了eIF2和eIF3的富集，它们与核糖体更强地结合（但也揭示了短暂发生的共翻译蛋白复合物组装）39。因此，该方法适用于检测两者，更强和较弱的附着成分的平移配合物。
总而言之，我们提出了一种方法，主要用于深入了解翻译起始阶段发生的变化，以及何时需要在mRNA上进行最小扰动的核糖体分布。重要的是，该方法适用于平移复合物（如eIF4A）中相对不稳定和动态的组分的稳定，并且可以广泛用于必要的优化。我们还提供了甲醛固定在翻译快速动态变化的情况下的有用性的证据，开辟了研究领域，例如快节奏的细胞对环境变化或应激条件的反应。

生物体在其生命周期中受到细胞内和细胞外动态变化的影响，这需要快速反应以维持体内平衡并确保生存。为了适应环境，真核细胞通过基因表达控制来调整其新陈代谢。基因表达控制可以在转录和/或翻译过程中进行;翻译反应通常发生得更快1，2，3，4.例如，翻译变化通常在压力发作后1-30分钟内出现，而转录水平的改变在压力暴露后数小时后出现3，4，5。由于细胞质中信使（m）RNA分子的持续可用性，翻译输出的改变可以更快地实现。相反，在转录水平上，必须合成新的mRNA分子，并且在真核生物中，从细胞核中处理和输出，在响应时间2，4，6，7，8中产生广泛的延迟。
对应激的急性转化反应通常表现为翻译输出总体下降，细胞存活所必需的蛋白质有选择性上调1,3,4,9.由于该过程的高能量消耗，降低蛋白质产量被认为是至关重要的3,7.为了促进选择性抑制和上调，一系列复杂的调节机制为转化反应服务。可以在翻译的所有阶段进行调节：多肽生物合成的启动，伸长，终止和核糖体回收10,11,12,13，但在初始阶段表现最强烈5,7,9,10,13.在起始过程中，小核糖体亚基（SSU）在真核起始因子（eIFs）的辅助下，与mRNA的5'未翻译区域（UTR）结合并扫描，直到识别起始密码子2,5,6,8,11,12,13.监管机制通常针对影响附着、扫描和开始密码子识别的 eIF。例如，起始因子eIF2，一种有助于招募引发剂Met-tRNA的基本翻译因子。iMet 到SSU，通常在压力条件下的真核生物中靶向4,6,11.在酵母中，该因子的磷酸化可以在营养剥夺和渗透应激下诱导1,4,11,14,15，在哺乳动物细胞中，氨基酸饥饿、内质网 （ER） 应激、紫外线应激、病毒感染和氧水平改变可能引发这种反应8,9,11.特异性mRNA翻译的快速上调在哺乳动物细胞对缺氧的反应中是显而易见的，其表现出缺氧诱导因子（HIFs）生物合成的全局快速翻译抑制和选择性上调。HIF是转录因子，然后在DNA转录水平上引发长期的细胞重编程8,9,16.在热应激下，在酵母中观察到类似的反应，热休克蛋白（HSP）的快速翻译表达，随后是延迟的转录水平反应17,18.除了营养剥夺和热休克外，还研究了酵母在不同氧气下转化反应8,19盐度5，磷酸盐，硫磺20,21 和氮气22,23 水平。这项研究对酵母的工业用途具有广泛的意义，例如烘焙和发酵24,25.转化反应也可能有助于进一步了解神经退行性疾病和心脏病等疾病，这些疾病的特征是细胞内应激，如氧化应激。总体而言，转化反应是基因表达控制不可或缺的一部分，有助于快速适应真核生物体中广泛的应激条件。
为了研究翻译响应，需要提供翻译环境最小扭曲快照的方法。多体分析是用于研究跨mRNA翻译的经典方法，涉及通过蔗糖梯度26，27通过超速离心分离mRNA的多（核）体质组分。该方法可用于探索单个mRNA的翻译水平（使用逆转录和聚合酶链反应等检测方法，RT-PCR26），或在全球范围内与高通量技术（微阵列或RNA-seq28，29）结合使用。一种更进化的方法是核糖体分析，它允许在全基因组尺度上研究沿着mRNA分子的细长核糖体的位置，以及推断跨转录组的翻译效率和利用主要和替代起始位点30，31。核糖体分析涉及由核糖体存在的mRNA片段的分离和测序。核糖体分析为许多条件下的翻译动力学提供了相当多的见解，包括缺氧应激，热休克和氧化应激31，32。该技术已适用于多种源材料类型，包括酵母和哺乳动物细胞。
虽然多体和核糖体分析是扩展翻译研究能力的基础，但翻译过程包括各种翻译中间体和复合物，这些方法难以捕获11，13。另一个局限性源于缺乏研究快速反应类型的能力，因为转化复合物要么通过添加特异性翻译抑制剂（抗生素）在体内稳定，导致某些核糖体分布伪影，要么在细胞特异性裂解时离体（抗生素）或非特异性（高盐或镁离子），导致短寿命或不太稳定的中间体的剥夺33， 34，35.
甲醛广泛用于交联核酸和蛋白质，例如染色质免疫沉淀（ChIP）和交联免疫沉淀（CLIP）研究。其小尺寸和优异的细胞通透性允许在36中快速的体内作用。基于甲醛的快速交联，核糖体分析方法已经扩展为翻译复合物谱测序（TCP-seq）10，36，37，38，39，40。TCP-seq，首先在酵母中开发，允许捕获所有翻译中间体，包括扫描或终止后SSU复合物和多个核糖体构型37，38，41，42。该方法已在若干研究10、38、39、41、42中使用，其中一些使用翻译抑制剂和甲醛交联的组合方法来促进翻译的停滞。该技术的进一步修改版本，选择性TCP-seq39，最近已被用于包括交联复合物的免疫纯化，扩大了TCP-seq应用的范围。甲醛交联的快速、高效和可逆特性使这些方法适用于研究瞬态mRNA：翻译复合相互作用，特别是在高度动态的翻译水平响应途径的背景下。
在这里，我们详细介绍了 体内 甲醛交联的过程，以达到综合转化复合物稳定和分离的目的。我们为酵母细胞和哺乳动物细胞提供了细微差别的单独方案（图1）。我们进一步概述了随后使用交联稳定材料的示例（图1），例如使用免疫印迹（免疫印迹）进行共纯化的蛋白质因子检测，免疫辅助纯化（或"免疫沉淀";IP）和富集含有特定目标因子的翻译复合物，电子显微镜和RNA测序。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> 图1：典型实验设置概述的示意图。 转化复合物 体内 甲醛稳定化的主要步骤被描述为流程图，并辅以有关关键必要仪器的信息。本文概述了交联材料的潜在下游应用，包括已成功使用但未在本方案中直接涵盖的示例，例如RNA的SPRI珠纯化，RNA测序和质谱分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

涉及信使（m）RNA的快速再分配和mRNA翻译的改变的快速反应与细胞的持续稳态调整有关。这些调整对于真核细胞的生存能力和"损伤控制"在营养和盐度水平，温度以及各种化学和辐射应激的波动期间至关重要。由于RNA水平反应的高度动态性，以及许多RNA：RNA和RNA：蛋白质中间体的不稳定性，因此只有使用有限数量的方法才能获得细胞质RNA状态的有意义的快照。转录组范围的、基于RNA-seq的核糖体分析型实验是控制翻译的最翔实的数据来源之一。然而，缺乏均匀的RNA和RNA：蛋白质中间体稳定会导致不同的偏差，特别是在快节奏的细胞反应途径中。在本文中，我们提供了适用于不同通透性的真核细胞的快速固定的详细方案，以帮助RNA和RNA：蛋白中间体的稳定。我们进一步提供了基于稳定RNA：蛋白质复合物与核糖体和多（核糖）体质组分共沉淀的分离示例。分离的稳定材料随后可以用作核糖体分析型实验的一部分，例如在翻译复合物分析测序（TCP-seq）方法及其衍生物中。TCP-seq风格方法的多功能性现在已经通过各种生物体和细胞类型的应用得到了证明。稳定的配合物还可以另外进行亲和纯化并使用电子显微镜成像，分离成不同的聚（核糖）体质组分并进行RNA测序，因为交联逆转很容易。因此，基于速冻和甲醛固定的方法，然后是基于沉降或其他类型的RNA：蛋白质复合物富集的方法，对于研究活细胞中快速RNA：蛋白质复合物动力学的更精细细节特别感兴趣。

转化复合物对缓冲液的离子组成敏感，这在评估沉降特性的超速离心过程中尤为重要。因此，我们使用从研磨的非固定酵母材料中提取的澄清裂解物测试了几种沉淀缓冲液，以选择最适合解析转化复合物的条件，并在梯度上分离核糖体亚基（SSU，LSU），单体（RS）和多体。所有缓冲液均基于含有25 mM HEPES-KOH pH 7.6和2 mM DTT的核心成分。KCl、MgCl2、CaCl2和EDTA的浓度在缓冲液中进一步修饰（图2a），并且这些组分在梯度上样前被添加到裂解物中，并在梯度浇注前被添加到蔗糖梯度缓冲液中。
在缓冲液1和2中，获得解析良好的转化复合物。缓冲液1导致小核糖体亚基（SSU）的分离更好（图2a）。省略MgCl2 和添加EDTA（缓冲液3，4）导致大多数多微体的高沉降性能丧失，并且可能部分分解（图2a）。虽然添加2.5mM CaCl2 导致多杂体峰更加均匀，但与缓冲液1和2相比，在这种情况下，多粒体物质的总量减少（图2a）。因此，我们选择缓冲区 1 作为首选的工作缓冲区。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig02.jpg"> 图2：用于转化复合物提取的缓冲条件和固定稳定性的评估。 所示是在260nm处收集的以10%-40%w / v蔗糖梯度分离的总酵母细胞裂解物的紫外吸光度曲线。（a）单盐和二价盐以及镁离子封存对从非固定酵母细胞中提取的物质沉淀的影响。红线和灰线表示典型的重复。（b，c）比较来自非固定（灰线），2.2%（黑线）和4.4%（黑虚线）的裂解物，w / v的甲醛固定酵母细胞。（d） 与来自相同非固定细胞的材料（灰线）相比，通过优化的 0.2% w/v 的 HEK 293T 细胞甲醛固定（黑色虚线和虚线）来稳定多粒体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
接下来，我们检查了通过用不同甲醛浓度固定来稳定多体的效果。使用其他相同的细胞材料，缓冲液，细胞处理和定时方法，我们比较了从非固定细胞中提取的材料以及用2.2%和4%w / v的甲醛固定的细胞（图2b，c）。我们发现，2.2%w / v的甲醛更适合固定，因为它很好地保留了多体，可以通过多体与单体的比例来判断（图2b），与4%w / v的甲醛相比，它没有降低核糖体材料的总产量，甲醛表现出明显的过度固定迹象（图2c）。
对于来自哺乳动物细胞的材料，由于基于洗涤剂的提取所需的裂解缓冲液与细胞体积比较大，因此使用缓冲液2（图2a）。这在蔗糖梯度沉降时产生了分辨良好的转化复合物（图2d）。值得注意的是，甲醛浓度低得多，为0.2%w / v，因为较高浓度导致大量的多粒体和核糖体物质损失（数据未显示）。与酵母细胞获得的结果相似，交联稳定的材料显示出更好的多微体保存和更高的多体与单体比率（图2d）。
接下来，我们测试了所选的甲醛固定条件是否足够有效，以稳定交联结果导致多体组分内活性翻译的mRNA，并且多粒体产量的提高不仅仅是抑制酶功能和翻译伸长率的进展的结果。我们使用EDTA和高一价盐（KCl）来破坏多微体和核糖体的稳定性。将这些试剂加入到澄清的酵母细胞裂解物中，并分别包含在缓冲液1组合物顶部的所有后续缓冲液和蔗糖梯度中。
事实上，15 mM EDTA对来自固定细胞的多体组分表现出较小的不稳定效应（图3a），证实了交联的复合物更健壮。EDTA的不稳定作用可以通过增加甲醛的浓度来克服，因为来自4%w / v的甲醛固定细胞的材料抵抗展开更好（图3a）。然而，将EDTA浓度增加到50 mM导致大多数平移配合物在固定和非固定条件下的稳定性，这可以从物质沉降较慢和没有形状良好的峰中推断出来（图3b）。这可以通过结构的部分展开和致密性的整体丧失来解释，而不是通过多体组分从mRNA中完全解离来解释。即使在这种情况下，交联材料也显示出更快的沉降速度（图3b）。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig03.jpg"> 图3：体内酵母甲醛固定对多微体稳定性的影响。所有实验都使用了缓冲液1（见文本和图2a）。数据类型和绘图如图2图例中所述。（a） 比较向细胞裂解物和后续缓冲液中加入15 mM EDTA对非固定（灰线）、2.2%（黑线）和4%（黑虚线）的多微体的稳定性，w/v与甲醛固定细胞。（b） 与 （a） 相同，但用于添加 50 mM EDTA，不包括 4% w/v 的甲醛固定细胞。（c）与（a）相同，但用于添加500 mM KCl，不包括2.2%w / v的甲醛固定细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
与EDTA效应类似，在500 mM KCl下，我们发现4%w / v的甲醛固定显着改善了稳定性（图3c）。在这种情况下，致密性的明显丧失也可以解释为核糖体复合物成分的部分脱离，而不是它们与RNA完全解离。总体而言，来自甲醛固定细胞的多体表现出对展开和结构不稳定的更高抵抗力，这与在这些复合物中形成额外的共价键一致。
在刺激生长条件下，mRNA可以迅速启动，导致多个核糖体在相同的mRNA分子上积累，形成称为多核糖体或多体的结构。多粒体可以通过蔗糖梯度的超速离心分离，在那里它们根据其顺序（mRNA上同时附着的核糖体的数量）沉积。当翻译被抑制时，核糖体无法很快进行另一轮翻译，导致多体的（部分）"反汇编"，这表现为向低阶多体的模态转移和单体4，26的积累。
葡萄糖匮乏可以提供可以在多体顺序分布水平上可视化的转化反应模型。葡萄糖消耗引起对酵母1，3，40的最显着和最快速的翻译抑制作用之一。先前的研究证明，在葡萄糖消耗1分钟内，多小体的丢失，单体的积累和翻译起始的抑制可能发生4。在葡萄糖重新补充的5分钟内，翻译迅速恢复，多体3，4明显增加。还观察到，当细胞暴露于含有0.5%（w / v）或更低葡萄糖的培养基时，翻译受到抑制，并且在0.6%（w / v）或更高的葡萄糖水平中看不到效果。
因此，我们希望确定我们的固定条件是否适合于保存葡萄糖应激反应动力学内的翻译差异，这可以通过多体与单体比率来评估。我们将来自在高葡萄糖（2.00%w / v添加）上以中等指数阶段生长的细胞的材料与那些转移到未添加或低添加（分别为0.00%或0.25%w / v）葡萄糖的培养基中10分钟的材料进行了比较。在对照组（非饥饿;用含有2%w/v添加葡萄糖的相同标准培养基快速置换，然后孵育10分钟并固定）和饥饿10分钟（用相同培养基快速置换0.25 w/v或未添加葡萄糖， 然后孵育10分钟并固定）细胞。
与早期的发现一致，我们观察到酵母细胞在葡萄糖饥饿应激时严重抑制翻译（图4a）。无论是无添加的还是低葡萄糖的条件都诱导了多微体的分解，在低添加葡萄糖的情况下，略微但明显地保留了更多的多聚体。因此，酵母葡萄糖去除反应可能不是全开或全关型，而是逐渐调整。肯定了对甲醛交联的稳定作用的期望，来自固定细胞的多体材料已经证明了饥饿细胞和非饥饿细胞之间的更高区别，可以说保留了更高的响应动态范围（图4b）。有趣的是，在来自固定细胞的材料的情况下，与非固定细胞相比，低添加的葡萄糖浓度导致特定的多粒体丰度与未添加的葡萄糖条件相比，其与未添加的葡萄糖条件的区别要好得多（图4a）。这有力地表明了甲醛固定方法在保存和捕获高度动态过程平衡中相对微小和瞬态差异方面的适用性，例如在转化反应期间。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig04.jpg"> 图4：捕获葡萄糖饥饿时酵母翻译的快速变化。 所有实验都使用了缓冲液1（见文本和 图2a）。数据类型和绘图如图 2 图例中所述。（a）从非饥饿（灰线），限制性葡萄糖饥饿（0.25%w / v加入葡萄糖10分钟;棕色线）和葡萄糖消耗（不添加葡萄糖10分钟;红线）非固定酵母细胞获得的细胞裂解物。（b） 与 （a） 相同，但适用于 2.2% w/v 甲醛固定细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
使用蔗糖梯度沉降（"多体分析"）监测与主动翻译mRNA相关的核糖体的翻译状态是一种广泛应用的技术26，27，28。结合定量微阵列分析和最近的高通量测序28、44，多体分析提供了有关核糖体相关mRNA转录组的信息。在蛋白质生物合成研究领域，传统上认为多体体的存在表明积极参与相应mRNA的翻译。进一步的结论通常（但并非总是）是合理的，即在给定长度的mRNA上存在的核糖体越多（多体的阶数越高），mRNA参与翻译的次数就越积极。因此，从分离活性翻译RNA的角度来看，从其余材料中分离多体部分可能是有用的。在足迹分析方法中，特别是TCP-seq 10，38，39，它从扫描，开始和停止密码子复合物中产生释放的SSU的单独群体，去除不与完整单体或多体共沉积的核糖体亚基可能具有额外的洞察力。
因此，我们采用了将"非翻译"mRNPs（例如游离SSU（与单个SSU结合的mRNA或没有附着的mRNA的SSU）从mRNA的"主动翻译"池中分离出来。为了实现这一点，我们假设参与与一种（单核）或几种核糖体（多体）相互作用的mRNA可以被主动翻译。这些复合物可以通过其较高的沉淀系数与其他复合物分开。我们还建议将"主动翻译"的mRNA池分离到蔗糖垫（50%w / v蔗糖）中，而不是直接在管壁上沉淀材料。将快速沉淀的配合物离心到垫子中，使我们能够使用吸光度剖面读数来监测分离，并与造粒和再增溶相比，实现溶解，非聚集和非变性材料的更高输出10，38。
总体而言，为了纯化单个SSU，核糖体，二组和可能紧凑堆积的高阶多微体，固定澄清的裂解物进行了两阶段超速离心过程（图5）。在第一个蔗糖梯度中，超速离心导致梯度顶部（蔗糖的10%-20%w / v）部分分离的游离SSU和LSU，而交联的翻译池包括与一个完全核糖体相关的多微体和mRNA集中在梯度的底部（蔗糖的50%w / v）（图5a).然后将含有翻译的mRNA池的蔗糖层的底部50%w / v浓缩其RNA，并用RNase I消化其RNA，然后进行第二次蔗糖梯度超速离心以获得单独的SSU，LSU，RS，RNase抗性二组（DS）和小分数的高阶核酸酶抗性多微体（图5b）。用乙酸铀酰进行阴性染色和用透射电子显微镜成像证实了在每个沉降阶段分离的复合物的身份（图5）。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig05.jpg"> 图5：从未翻译的RNA中分离出总翻译的RNA级分（a，c）示意图（左）和相应的代表性结果（右;数据类型和绘图如图2图例中所述）（a）第一次不连续蔗糖梯度分离非翻译的细胞质基质组分，包括游离SSU和翻译的mRNA库，通过与核糖体和多微体共沉降鉴定， 和（c）通过受控的RNase I消化和超速离心分离从翻译的mRNA池中释放的单个核糖体复合物，通过第二个线性蔗糖梯度进入SSU，LSU，核糖体（RS）和核酸酶抗性二体（DS）级分。包括高（15 AU260）和低（8 AU 260）未饥饿消化物质的量，以证明当对次要馏分感兴趣时增加超速离心负荷的可能性。高阶核酸酶抗性多体也可以被鉴定（例如，所提供的例子中的三体）。（b，d）来自（a，c）的醋酸铀酰对比部分的代表性TEM图像，如标记。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
为了检查固定方案对短暂核糖体相关蛋白（特别是eIF）保留的适用性，我们测试了eIF4A的共沉淀，eIF4A是一种不稳定的eIF，动态结合到核糖体组分。我们利用eIF4A串联亲和纯化（TAP）标记的酵母菌株（TIF1-TAP），并使用抗TAP抗体研究了来自固定细胞与非固定细胞的材料中的eIF4A存在，与Pab1p的丰度相比作为额外的RNA结合对照，使用SDS-PAGE然后进行蛋白质印迹（图6）。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig06.jpg"> 图6：体内甲醛固定后翻译复合物中瞬时蛋白的稳定性。（a，b）（顶部图）（a）非固定和（b）2.2%甲醛固定eIF4A-TAP酵母细胞的全细胞裂解物（WCL）通过超速离心分离并可视化如图2图例中所述。（底图）在相应梯度（顶图）中分析的材料分离时，对各自的蔗糖梯度分数进行蛋白质印迹成像，并将WCL作为对照。（c）固定和非固定材料分数中eIF4A或Pab1p丰度之间的平均比率。根据（a，b）（底图）的数据计算了eIF4A（黑条）和Pab1p（灰条）的相对比例（归一化为所有2-7个分数的信号），并得出了它们与固定到非固定比率的2，3（SSU，LSU），4，5（RS，轻多聚体）和6，7（重多聚体）。误差线表示与均值之比的标准差，合并分数（虚线框）被视为重复项。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
与它们在细胞中的高丰度一致，我们观察到来自全细胞裂解物（WCL）中的蛋白质和来自非固定细胞的较慢沉降组分的高强度信号（图6a，下图）。我们还在WCL中检测到大量来自固定细胞的这些蛋白质，并保证了交联材料提取的效率和没有意外损失（图6b，底图）。然而，与非固定细胞相比，与Pab1p相比，来自固定细胞的材料在沉降较快的核糖体组分中显示出eIF4A的相对存在升高（图6c）。这一结果表明，eIF4A与甲醛交联材料中的聚体仍然更紧密地结合。
在确认交联对核糖体级分中eIF4A存在的积极和特异性稳定作用后，我们使用来自eIF4A标记（TIF1-TAP）酵母菌株的固定材料，通过用磁性IgG磁珠的亲和纯化来捕获和富集含eIF4A的配合物。在通过蔗糖梯度（例如，酵母方案的第1.3节）进行第一次沉降后，我们有亲和力富集的WCL，游离SSU和多体（翻译的mRNA池）级分，以及从翻译池中拆卸成具有RNase I的单个复合物（例如，酵母方案的第1.4节）时第二次沉降的SSU，LSU和RS级分（图7).在所有情况下，除了LSU级分外，我们都能够观察到纯化馏分（洗脱液，E）中eIF4A的选择性富集，与源材料（输入，I）中存在β肌动蛋白（图7）相比。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig07.jpg"> 图7：通过瞬时相关的eIF4A选择性免疫纯化 体内 甲醛稳定的转化复合物。该示意图说明了不同翻译复合物和eIF4A表位的来源，包括eIF4A-TAP酵母细胞的非分馏澄清WCL;游离SSU和翻译的RNA库（多体）在第一次超速离心中分离;SSU，LSU和RS级分通过RNase I消化从翻译的RNA中释放出来，并使用第二次超速离心分离（见文本）。蛋白质印迹图像提供了与同时染色的β肌动蛋白对照的丰度相比，馏分中eIF4A丰度的可视化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
附表1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/Janapala%20et%20al%20JoVE62639R2%20Buffer%20recipe%20table.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>

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Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

我们提出了一种技术，可以快速稳定活酵母和哺乳动物细胞中具有甲醛交联的转化（蛋白质生物合成）复合物。该方法能够解剖瞬态中间体和动态RNA：蛋白质相互作用。交联复合物可用于多种下游应用，例如基于深度测序的分析方法、显微镜和质谱分析。

从真核细胞 中快速体内 固定和分离转化复合物

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

工作流程包括在严格控制的环境条件下生长细胞，使用融化的水/冰快速冷却它们，并用预先优化的甲醛浓度和孵育时间固定。然后使用过量的含伯氨基化合物（例如甘氨酸或胰蛋白酶）淬灭固定反应。细胞被收集，洗涤，可以冷冻储存。固定细胞可以机械或化学裂解，裂解物用于根据其分子大小，沉降特性或亲和力标记物分离核糖体级分。该方法导致可用于免疫辅助纯化和检测的多功能材料，在电子显微镜中富集含有特定因子的复合物。在交联深度封闭、RNA扩增或基于杂交的分析、RNA测序和质谱分析后成为可能。在600纳米处起始光密度不超过0.05个吸光度单位的轨道振荡器中设置一升酵母培养物，并在30摄氏度下使用蛋白胨和葡萄糖培养基。设置一个具有兼容转子和离心机瓶的制备离心机，用于在4摄氏度下以5000 G沉淀酵母细胞的液体悬浮液。记录生长细胞的光密度。如果指数增长阶段感兴趣，则在收集时，它必须介于0.6至0.8吸光度单位和600纳米之间。一旦细胞准备就绪，在化学通风橱内设置一个冰柜，里面有一个含有250克干净碎水冰的面包师，并在烟罩内向您展示25毫升胰蛋白酶和新购买的甲醇稳定37%甲醛溶液。将最新的细胞培养物倒入含有冰块的面包师中。然后加入75毫升37%甲醛，最终浓度为体积2.2%的重量，强烈搅拌混合物，直到冰融化。冰融化后，设置计时器10分钟孵育10分钟后，将培养物转移到预冷的离心瓶中，并通过在4摄氏度，5000 G下离心细胞沉淀5分钟。旋转时，在预冷50毫升管上并保持新鲜制备的含有甘氨酸的缓冲液A，以中和冰上剩余的甲醛。离心后，将离心管放在冰上，沉淀面与冰接触。将管子带入通风橱，并将上清液丢弃到甲醛废物容器中。使用25毫升条带将旧管中的细胞沉淀重新悬浮在20毫升缓冲液A中，然后转移到50毫升管中。用缓冲液A将体积组成40毫升，并通过离心4摄氏度，5000 G收集洗涤细胞5分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重新悬浮在40毫升缓冲液A中，该缓冲液A不含甘氨酸以除去甘氨酸污染。通过在4摄氏度，5000G下离心5分钟再次沉淀细胞。用缓冲液A重复洗涤，再洗一次。弃去上清液并将细胞沉淀放在冰上。用沉淀称量管，湿细胞质量应约为每一升细胞培养物一克。将聚苯乙烯从装有液氮的铝箔衬里的盒子中填充到约三厘米的深度。将50毫升管直立放置在盒子中。通过移液和涡旋10秒将沉淀重新悬浮在550微升缓冲液A 2中。每微升RNase抑制剂加入10微升40单位，再次涡旋10秒。使用一毫升移液器，将细胞悬浮液滴入含有液氮的50毫升2中。为了准备下一步，在干冰和10毫升不锈钢研磨罐上预冷1.5毫升无核管。使用干净的无菌刮刀将冷冻的细胞悬浮液滴转移到罐中。将研磨罐浸入液氮中一分钟，确保液相保持在液络部上方。在27赫兹处设置一个冷冻混合磨机，搅拌一分钟。在混合器研磨机中以27赫兹搅拌密封的研磨罐一分钟。像以前一样在液氮中重新冷却罐子，并进一步摇晃一分钟。将罐子与1.5毫升无核管一起转移到装有干冰的冰盒中。使用小钢刮刀将填充的研磨结果转移到管中。然后将管子储存在零下80摄氏度。在两个T175烧瓶中，将HEK 293个细胞生长到60%至70%汇合度和Dalbeko的改良鹰培养基和10%胎牛血清，浓度为37度和5%二氧化碳。在所需固定时间前至少三小时，将 T175 烧瓶的培养基更换为精确 30 毫升预热的完整培养基。用碎水冰准备一个冰箱，并与所需的缓冲液（也是冰）一起保存在通风橱中。为了使细胞快速冷却，请从培养箱中取出T175烧瓶，然后将其正式压在冰上，以确保最大的表面接触。在化学通风橱内，将烧瓶倾斜到其侧面，以便培养基聚集在与细胞相反的一侧。将168微升37%的甲醛直接移液到混合培养基中。给予终浓度为0.2%甲醛。立即混合。将烧瓶在冰上孵育10分钟。将培养基倒入适当的废物容器中，通过与细胞相对的烧瓶侧。使用剥离液，在30毫升不含钙和镁离子的Dalbeko磷酸盐缓冲盐水中移液，并在细胞对面的一侧轻轻地含有50毫摩尔甘氨酸。摇动烧瓶搅拌，将闪光灯放回水平位置，在冰上再孵育10分钟。通过与细胞相反的烧瓶侧倒出溶液，轻轻加入7毫升标准0.25%胰蛋白酶EDTA溶液以分离并重新悬浮细胞。将烧瓶在室温下孵育五分钟，最多10分钟。垂直定位烧瓶并使用剥离物，通过轻轻洗涤烧瓶壁上的任何剩余物来收集分离的细胞，并将悬浮液转移到设置在冰上的50毫升管中。立即用20毫升完整的培养基补充收集的悬浮液，并通过轻轻翻转管子混合。通过将管以100G离心5分钟和4摄氏度来沉淀细胞。细胞沉淀必须清晰可见。倒出培养基，轻轻地将沉淀重新悬浮在10毫升的Dalbeko磷酸盐缓冲盐水中，不含甘氨酸。再次将管在100 G下离心五分钟，并在4摄氏度下倒出洗涤缓冲液，并将沉淀重新悬浮在800微升冰冷的Dalbeko磷酸盐缓冲盐水中，不含甘氨酸，但含有镁和钙离子。将重新悬浮的细胞转移到新的低蛋白结合1.5毫升微量离心管中。将试管在4摄氏度下以100 G离心三分钟。使用一毫升移液器小心地丢弃上清液。在这个阶段，细胞沉淀可以在零下80摄氏度下冷冻或进入细胞裂解步骤。在生物安全柜中加入300微升基于非离子，非变性洗涤剂的裂解缓冲液和7微升精氨酸酶抑制剂，并使用一毫升吸头移液充分混合。小心地将25号针头连接到一到三毫升的注射器上，并使用至少七个缓慢向上的进气和快速向下的排气行程大力移液混合物。将注射器和针头丢弃到夏普的箱子中，然后用31号针头和0.3毫升注射器重复该过程。将注射器和针头丢弃到尖锐的垃圾箱中。将试管以12， 000 G离心五分钟，以四度除去细胞碎片。将上清液转移到新的低蛋白结合1.5毫升微量离心管中。储存细胞碎片并在零下80摄氏度下裂解。平移复合物对缓冲液的离子组成敏感。省略氯化镁和添加EDTA消除了高沉降性能，虽然氯化钙导致更好的结果峰值，但改善幅度很小。因此，我们选择了缓冲区一。2.2%的体积重量甲醛很好地保存了多聚体，并且与4%的体积重量相比，甲醛没有降低总收率。在哺乳动物细胞中，使用低得多的甲醛浓度，即0.2%重量体积。由于浓度较高，导致大量的多核糖体物质损失。向裂解物和所有后续缓冲液中加入15毫摩尔EDTA对来自固定细胞的多体组分表现出明显较小的不稳定作用。这种效应用50毫摩尔EDTA部分复制，材料来自4%固定细胞，抵抗力，展开得更好。葡萄糖消耗引起对酵母最显著和最快速的转化抑制作用之一。神经添加和局部原因条件诱导的多体分解均略有增加，但明显多微体保留在低添加葡萄糖中。重要的是，来自固定细胞的多体物质显示出饥饿细胞和非饥饿细胞之间的高度区别，这表明甲醛固定适用于保持动态平移过程中的差异。在诸如tacy paysake之类的方法中，去除与完全根茎不能很好地共同沉降的小核糖体亚基可能是另外有见地的，我们采用了两级超速离心，允许分离SSU，LSU，RS，RNase抗重氮酶，DS和高阶多微体，通过固定级分的电子显微镜确认。与非固定细胞相比，来自固定细胞的材料在沉积最快的核糖体组分中显示出不稳定的eIF4A的存在。使用来自eIF4A tapi菌株的固定材料来捕获和富集含有磁性IDG微珠配合物的eIF4A，我们能够观察到与SSU和RS中的β-肌动蛋白相比，eIF4A的选择性富集，但不包括RNase one拆卸后第二梯度的LSU级分。与其他转化静息方法相比，甲醛作用在细胞膜上的迅速性和交联的不加区分性保证了翻译复合中间体的最大多样性。我们的发现符合快速甲醛固定的可用性，以稳定高度瞬态的复合物，并证明在细胞对环境变化或应激条件的快速反应情况下的有用性。

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Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

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Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

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