Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Australian Research Council Discovery Project grant (DP180100111 til T.P. og N.E.S), National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 til N.E.S.) og Research Fellowship (APP1135928 til T.P.). Forfatterne anerkender faciliteterne i Mikroskopi Australien på Center for Advanced Microscopy, Australian National University, en facilitet, der er finansieret af universitetet og den føderale regering.

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Formaldehyd fiksering er en bekvem og populær metode til at opnå hurtig in vivo crosslinking af biomolekyler10,36,45,46,47,48. Sammenlignet med de andre potentielle biomolekylemål kræver vellykket fangst af translationelle komplekser en øjeblikkelig fiksering under snapkøling af cellerne eller andet materiale. Uden den ufordedne stabilisering er der mulighed for, at forskellige oversættelsesrelaterede processer kan fortsætte, hvilket flytter den komplekse fordeling væk fra den uforstyrrede in vivo state49. Sammenlignet med de andre metoder til translationel anholdelse og ribosomal kompleks stabilisering lover formaldehydhandlingens hurtighed på tværs af cellemembraner og crosslinks vilkårlige karakter bevarelse af den maksimale mangfoldighed af oversættelseskomplekset mellemprodukter tættere på deres oprindeligt distribuerede tilstande50.
Den tilgang, der præsenteres her, er etableret og optimeret i både gær- og pattedyrceller, og metoder er nu afledt af andre grupper til brug på tværs af mere forskelligartet biologisk materiale, såsom i hele hvirveldyr (f.eks. zebrafiskembryoner)10,38,39,49,51,52 . Selv om disse værker kollektivt berolige alsidigheden og den brede anvendelighed af tilgangen, hurtig formaldehyd crosslinking af translationelle komplekser kan betragtes som noget vanskeligt at overføre til nye typer af biologisk materiale på grund af behovet for optimeringer og justeringer.
Et fremmest krav til metodens succes er reoptimering af koncentrationen af formaldehyd og celleindsamlings- og disruptionteknikken. Mindre gennemtrængelige, små og runde gærceller kræver meget højere (mindst 10 gange) formaldehydkoncentration og fysisk forstyrrelse af de faste celler. I modsætning hertil kan store og flade klæbende pattedyrceller i kultur let overfastsættes og kræve blid håndtering ved fiksering, mens ekstraktionen af de faste komplekser kan udføres kemisk med membranforstyrrelse ved hjælp af rengøringsmidler. Under-crosslinking kan tillade mindre stabile eller mere kortvarige mellemprodukter at adskille eller lække i en senere tilstand. Over-crosslinking kan have en negativ indvirkning på evnen til at isolere og studere ribosomale fraktioner og kan skabe selektive bias såsom dybere udtømning af tunge komplekser. I vores observation kan selv mindre ændringer, såsom den type klæbende menneskelige celler, der anvendes, påvirke udbyttet af de genvundne krydslinkede komplekser og kan kræve re-optimering af crosslinking regimet. Vi kan også forudse, at celler med væsentligt forskellige permeabilitetsegenskaber, såsom planteceller, vil kræve yderligere omfattende optimering af fikseringsbetingelserne52. Men det er svært at forestille sig en type biologisk materiale, der ville være helt uforeneligt med tilgangen.
En overvejelse, der er relevant for pattedyrsfikseringsprotokollen, er tætheden og mængden af cellemateriale, der anvendes som input. Det anbefales at have cellerne kontinuerligt voksende uden re-såning eller andre forstyrrelser i mindst 2 dage for at undgå ekstern indflydelse på cellulære oversættelse dynamik. Gældende for de fleste celletyper, men for de fleste klæbende celler konsekvent opnået sammenløb niveauer på ikke mere end 70% vil sikre fravær af større kontakt hæmning virkninger, der kan have en negativ og uforudsigelig indflydelse oversættelse satser.
Et andet interessant og potentielt enestående bekvemt træk ved formaldehydfiksering, der stammer fra dens vilkårlige reaktivitet, er stabiliseringseffekten på translationelle komplekser i systemer med blandet taksonomi. Bakterielle, og endnu mere translationelle komplekser af mitokondrier, kloroplaster og forskellige intracellulære parasitter, har været notorisk vanskeligt at målrette med specifikke oversættelseshæmmere. I TCP-seq-dataene kan fodspor, der er tilknytning til mitotranscriptomet, derimod let observeres i dataene38,39,50. En interessant efterfølgende udvikling kunne være anvendelsen af metoden til at undersøge oversættelse i hele mikrosamfund, f.eks. i jord-, vand- eller tarmprøver, hvor pålidelig hurtig oversættelsesarrest og kompleks stabilisering med andre midler ville være problematisk.
Det skal også nævnes, at intet forhindrer brugen af formaldehydstabilisering umiddelbart efter celleforstyrrelser og materiale homogenisering for det mest komplicerede materiale (såsom hårdt og/eller voluminøst væv). Denne fremgangsmåde anvendes allerede ofte til at fjerne celleindtastningsforsinkelsen, når du stabiliserer translationelle komplekser med specifikke små molekylehæmmere33,53,54,55. I betragtning af at formaldehydfiksering traditionelt er blevet brugt med fremragende resultater til ex vivo / in vitro-prøvestabilisering i applikationer som elektronmikroskopi45,56,57,58, kan vi forvente endnu mindre negative virkninger i dette tilfælde, især dem, der er forbundet med den dårlige ekstraktion af de translationelle komplekser fra de grundigt faste celler.
Vores resultater bekræfter anvendeligheden af hurtig formaldehydfiksering for at stabilisere meget forbigående komplekser, såsom dem, der omfatter eIF4A. Det er bemærkelsesværdigt, at gær eIF4A i modsætning til pattedyr er meget svagere forbundet med capbindingskomplekset eIF4F og som følge heraf translationelle komplekser generelt. eIF4A går normalt tabt under enhver omfattende rensning af ribosomalt materiale i gær29,59,60,61,62,63. Men i det in vivo-fastegærmateriale er det muligt at opnå pålidelig berigelse af eIF4A i alle fraktioner af translationelle komplekser, hvor dets tilstedeværelse ville blive forventet. De tidligere offentliggjorte Sel-TCP-seq-data har vist berigelsen af eIF2 og eIF3, der i højere grad forbinder med ribosomer (men også afslørede forbigående forekommende co-translationelle proteinkompleksmontering)39. Metoden er således velegnet til påvisning af både stærkere og svagere vedhæftede bestanddele af de translationelle komplekser.
Sammenfattende har vi præsenteret en tilgang, der er nyttig til at få indsigt primært i de ændringer, der sker i oversættelsesfasen, og når der kræves minimalt ribosomal fordeling over mRNA. Det er vigtigt, at tilgangen er velegnet til stabilisering af relativt labile og dynamiske komponenter i translationelle komplekser, såsom eIF4A, og kan bruges bredt udsat for nødvendige optimeringer. Vi har også fremlagt dokumentation for nytten af formaldehydfiksering i scenarierne med hurtig dynamisk ændring af oversættelsen, der åbner undersøgelsesområder såsom hurtige cellulære reaktioner på miljøændringer eller stressforhold.

Levende organismer er underlagt dynamiske intra- og ekstracellulære ændringer i hele deres levetid, hvilket kræver hurtige reaktioner for at opretholde homøostase og sikre overlevelse. For at muliggøre miljøtilpasning justerer eukaryote celler deres stofskifte via genekspressionskontrol. Genekspressionskontrol kan udøves under transskription og/eller oversættelse; med translationelle svar generelt forekommer hurtigere1,2,3,4. For eksempel opstår der typisk translationelle ændringer inden for 1-30 min fra stressdebuten, mens ændringer på transskriptionsniveau følger timer efter stresseksponering3,4,5. Ændringer i oversættelsesoutput opnås hurtigere på grund af den vedvarende tilgængelighed af messenger (m)RNA-molekyler i cytoplasmaet. Omvendt skal nye mRNA-molekyler syntetiseres på transskriptionsniveau, og i eukaryoter skal forarbejdes og eksporteres fra kernen, hvilket giver omfattende forsinkelser i responstiden2,4,6,7,8.
Akut translationel reaktion på stress er generelt karakteriseret ved et generelt fald i oversættelsesproduktionen, med selektiv upregulation af proteiner, der er nødvendige for celleoverlevelse1,3,4,9. Reduktion af proteinproduktionsproduktionen menes at være afgørende på grund af processens høje energiomkostninger3,7. For at lette den selektive hæmning og upregulation betjenes translationelle reaktioner af en række komplekse reguleringsmekanismer. Regulering kan udøves på tværs af alle faser af oversættelsen: indledning, forlængelse, afslutning af polypeptidbiosyntese og ribosomal genanvendelse10,11,12,13, men udstilles mest i indledningsfasen5,7,9,10,13. Under indledningen binder den lille ribosomale underenhed (SSU), bistået af eukaryote indledningsfaktorer (eIF'er), sig til og scanner 5' uoversatte regioner (UTR) i mRNA, indtil en start codon er anerkendt2,5,6,8,11,12,13. Reguleringsmekanismer er ofte rettet mod eIF'er, der påvirker vedhæftede filer, scanninger og start af codongenkendelse. F.eks. er indledningsfaktoren eIF2, en væsentlig oversættelsesfaktor, der hjælper med ansættelsen af en initiativtager Met-tRNAiMet til SSU, er ofte målrettet i eukaryoter under stress betingelser4,6,11. I gær kan fosforylering af denne faktor induceres under næringsstofmangel og osmotisk stress1,4,11,14,15og i pattedyrceller kan aminosyre sult, endoplasmisk reticulum (ER) stress, UV-stress, virusinfektion og ændrede iltniveauer udløse dette svar8,9,11. Hurtig opregulering af specifik mRNA-oversættelse er tydelig i pattedyrcellens reaktion på hypoxi, som udviser en global hurtig oversættelseshæmning og selektiv upregulering af hypoxiinukible faktorer (HIF'er) biosyntese. HIF'er er transskriptionsfaktorer, som derefter fremkalder langsigtet cellulær omprogrammering på DNA-transskriptionsniveau8,9,16. Lignende reaktioner er blevet observeret i gær under varme stress, med hurtig translationel udtryk for Heat Shock Proteins (HSP'er) efterfulgt af forsinkede transskription-niveau svar17,18. Ud over næringsstofmangel og varmechok er translationelle reaktioner i gær blevet undersøgt under varierende ilt8,19salinitet5, fosfat, svovl20,21 og kvælstof22,23 Niveauer. Denne forskning har vidtrækkende konsekvenser for den industrielle anvendelse af gær, såsom bagning og gæring24,25. Translationelle reaktioner kan også være medvirkende til at fremme forståelsen af sygdomme som neurodegenerative lidelser og hjertesygdomme, der er karakteriseret ved intracellulære belastninger som oxidativ stress. Samlet set er translationelle reaktioner en integreret del af genekspressionskontrol og letter hurtig tilpasning til en bred vifte af stressforhold i eukaryote organismer.
For at studere translationelle svar er der brug for metoder, der giver minimalt forvrængede snapshots af oversættelseslandskabet. Polysome profilering er en klassisk tilgang, der anvendes i studiet af oversættelse på tværs af mRNA, der involverer adskillelse af poly (ribo)somale fraktioner af mRNA via ultracentrifugering gennem saccharose gradienter26,27. Metoden kan anvendes til at undersøge oversættelsesniveauer for individuelle mRNA'er (med detektionsmetoder som omvendt transskription og polymerasekædereaktion, RT-PCR26) eller globalt i forbindelse med teknikker med høj kapacitet (mikroarray eller RNA-seq28,29). En mere udviklet tilgang er ribosom profilering, der gør det muligt at studere positioner af aflange ribosomer langs et mRNA-molekyle i genom-dækkende skala, samt konklusionen af effektiviteten af oversættelse på tværs af transskriptom og udnyttelse af de vigtigste og alternative startsteder30,31. Ribosom profilering indebærer isolering og sekventering af mRNA fragmenter beskyttet af ribosomal tilstedeværelse over dem. Ribosom profilering har givet betydelig indsigt i oversættelse dynamik på tværs af en række betingelser, herunder hypoxisk stress, varmechok og oxidativ stress31,32. Teknikken er blevet tilpasset flere kildematerialetyper, herunder gær- og pattedyrceller.
Mens polysome og ribosom profilering har været grundlæggende i at udvide mulighederne for forskning i oversættelse, processen med oversættelse omfatter forskellige translationelle mellemprodukter og komplekser, der er vanskelige at fange med disse metoder11,13. En yderligere begrænsning skyldes den manglende evne til at studere hurtige reaktionstyper, da translationelle komplekser enten stabiliseres in vivo ved tilsætning af specifikke oversættelseshæmmere (antibiotika), hvilket fører til visse ribosomfordelingsartefakter eller ex vivo på cellelyseis specifikt (antibiotika) eller uspecifikt (højt salt eller magnesiumioner), hvilket fører til afsavn af de korterelivede eller mindre stabile mellemprodukter33, 34,35.
Formaldehyd er meget udbredt til at krydslinke nukleinsyrer og proteiner, såsom i kromatin immunprecipitation (ChIP) og crosslinking immunoprecipitation (CLIP) undersøgelser. Dens lille størrelse og fremragende celle permeabilitet giver mulighed for en hurtig in vivo handling36. Baseret på den hurtige formaldehyd crosslinking er ribosom profileringsmetoden blevet udvidet med TCP-seq (Translation Complex Profile Sekventering)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, der først blev udviklet i gær, gør det muligt at hente alle mellemprodukter til oversættelse, herunder scanning eller SSU-komplekser efter opsigelsen og flere ribosomale konfigurationer37,38,41,42. Metoden er blevet anvendt i flere undersøgelser10,38,39,41,42, hvoraf nogle bruger en kombinationstilgang af både oversættelseshæmmere og formaldehyd crosslinking at lette anholdelsen af oversættelse. En anden modificeret version af teknikken, selektiv TCP-seq39, er for nylig blevet anvendt til at omfatte immunpurification af de krydslinkede komplekser, der udvider omfanget af TCP-seq-applikationerne. Den formelledehydkrydsning har en hurtig, effektiv og reversibel karakter, der gør disse tilgange velegnede til at studere forbigående mRNA:oversættelseskomplekse interaktioner, især i forbindelse med meget dynamiske responsveje på oversættelsesniveau.
Her beskriver vi processerne for in vivo formaldehyd crosslinking med henblik på omfattende oversættelse kompleks stabilisering og isolation. Vi leverer separate protokoller nuanceret for gær og pattedyr celler (Figur 1). Vi skitserer endvidere eksempler på den efterfølgende anvendelse af det krydslinkstabilerede materiale (figur 1), f.eks. IP) og berigelse af translationelle komplekser, der indeholder specifikke interessefaktorer, elektronmikroskopi og RNA-sekventering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk, der viser en oversigt over den typiske eksperimentelle opsætning. De vigtigste trin i in vivo formaldehydstabilisering af translationelle komplekser fremstilles som et rutediagram suppleret med oplysninger om de vigtigste nødvendige instrumenter. Potentielle downstream-anvendelser af det krydslinkede materiale er skitseret, herunder eksempler, der med succes er blevet anvendt, men ikke direkte dækket i denne protokol, såsom SPRI perlerensning af RNA, RNA-sekventering og massespektrometri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

Hurtige reaktioner, der indebærer hurtig omfordeling af messenger(m)RNA og ændringer af mRNA-oversættelse, er relevante for løbende homøostatiske justeringer af cellerne. Disse justeringer er afgørende for eukaryote celle overlevelsesevne og 'skade kontrol' under svingende næringsstof og saltholdighed niveauer, temperatur, og forskellige kemiske og stråling understreger. På grund af den meget dynamiske karakter af RNA-niveau svar, og ustabiliteten i mange af RNA: RNA og RNA: protein mellemprodukter, opnå et meningsfuldt øjebliksbillede af den cytoplasmatiske RNA tilstand er kun muligt med et begrænset antal metoder. Transcriptome-dækkende, RNA-seq-baserede ribosom profilering-type eksperimenter er blandt de mest informative datakilder til kontrol af oversættelse. Men, fravær af en ensartet RNA og RNA:protein mellemliggende stabilisering kan føre til forskellige fordomme, især i de hurtige cellulære respons veje. I denne artikel leverer vi en detaljeret protokol med hurtig fiksering, der gælder for eukaryote celler af forskellig permeabilitet, for at hjælpe i RNA og RNA: protein mellemliggende stabilisering. Vi giver endvidere eksempler på isolering af de stabiliserede RNA:proteinkomplekser baseret på deres co-sedimentering med ribosomale og poly (ribo)somale fraktioner. Det adskilte stabiliserede materiale kan efterfølgende bruges som en del af ribosom profileringslignende eksperimenter, f.eks. Alsidigheden af TCP-seq-stil metoder er nu blevet demonstreret af applikationerne i en række organismer og celletyper. De stabiliserede komplekser kan også desuden affinitetsrenses og afbildes ved hjælp af elektronmikroskopi, adskilt i forskellige poly (ribo)somale fraktioner og udsat for RNA-sekventering på grund af den lette krydslink-vending. Derfor kan metoder baseret på snap-chilling og formaldehydfiksering, efterfulgt af den sedimenteringsbaserede eller anden type RNA:proteinkompleks berigelse, være af særlig interesse i at undersøge finere detaljer om hurtig RNA:protein kompleks dynamik i levende celler.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Vi præsenterer en teknik til hurtigt at stabilisere translationelle (proteinbiosyntese) komplekser med formaldehyd crosslinking i levende gær og pattedyr celler. Tilgangen muliggør dissekering af forbigående mellemprodukter og dynamiske RNA:proteininteraktioner. De krydslinkede komplekser kan bruges i flere downstream-applikationer, såsom i dybe sekventeringsbaserede profileringsmetoder, mikroskopi og massespektrometri.

Hurtig In Vivo Fiksering og isolering af translationelle komplekser fra eukaryote celler

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Arbejdsgangen består af voksende celler under strengt kontrollerede miljøforhold, hurtigt nedkøling af dem ved hjælp af smeltevand/is og fastgørelse med foroptimeret koncentration af formaldehyd og inkubationstid. Fikseringsreaktionen slukkes derefter ved hjælp af overskydende primære aminogruppeholdige forbindelser, såsom glycin eller tryps. Celler opsamles, vaskes og kan opbevares frosne.Faste celler kan mekanisk eller kemisk lys, og lysatet bruges til adskillelse af ribosomale fraktioner baseret på deres molekylære størrelse, sedimenteringsegenskaber eller affinitetsmarkører. Tilgangen resulterer i alsidigt materiale, der kan til immunassisteret rensning og detektion, berigelse af komplekser, der indeholder specifikke faktorer i elektronmikroskopi. Ved krydslinkede dybe blokeringer, RNA-forstærkning eller hybridiseringsbaserede analyser bliver RNA-sekventering og massespektrometri mulig.Opret en en-liters gær kultur i en orbital shaker med en start optisk tæthed ikke mere end 0,05 absorbans enheder på 600 nanometer og bruge peptone og dextrose medier på 30 grader celsius. Opret en præparativ centrifuge med kompatible rotor- og centrifugeflasker til peltering af den flydende suspension af gærceller ved 5000 G ved fire grader celsius. Hold styr på den optiske tæthed af de voksende celler.Det skal være mellem 0,6 og 0,8 absorbansenheder og 600 nanometer på indsamlingstidspunktet, hvis den eksponentielle vækstfase er af interesse. Når cellerne er klar, skal du oprette en isboks inde i den kemiske røghætte med en bager indeholdende 250 gram ren knust vandis og vise dig også 25 milliliter trypsin og frisk købt methanol stabiliseret 37% formaldehydopløsning inde i hætten. Hæld den nyeste cellekultur i bageren, der indeholder isen.Derefter tilsættes 75 milliliter af 37% formaldehyd til en endelig koncentration på 2,2% vægt over volumen intenst røre blandingen, indtil isen smelter. Når isen er smeltet, skal du oprette en timer i 10 minutter Efter inkubation i 10 minutter overføres kulturen til de forkølede centrifugeflasker og pellet cellerne ved centrifugering ved fire grader celsius, 5000 G i fem minutter. Mens spin er, på pre-cool en 50 milliliter rør og holde frisklavet buffer A indeholdende glycin at neutralisere eventuelle resterende formaldehyd på is.Efter centrifugering placeres centrifugerørene på isen med pelletsiden i kontakt med isen. Bring rørene ind i røghætten og kassér supernatanten i en formaldehydaffaldsbeholder. Re-suspendere celle pellet fra gamle rør i 20 milliliter buffer A ved hjælp af en 25 milliliter stripette og overføre til en 50 milliliter rør.Opfange volumen til 40 milliliter med buffer A og indsamle vaskecellerne ved centrifugering af fire grader celsius, 5000 G i fem minutter. Kassér supernatanten, og ophæng cellepillen igen i 40 milliliterbuffer A, som er buffer A, der ikke indeholder glycin for at fjerne glycinforurening. Pellet cellerne igen ved centrifugering ved fire grader celsius, 5000 G fem minutter.Gentag vaskene med buffer A en, en gang til. Kassér supernatanten, og læg cellepillen på is. Veje røret med pellet, den våde cellemasse skal være ca. et gram pr. Liter af cellekulturen.Fyld polystyren fra kasse foret med aluminiumsfolie med flydende nitrogen til en dybde på ca. tre centimeter. Placer ved 50 milliliter rør oprejst i kassen. Re-suspendere pellet i 550 mikroliter af buffer A to ved pipetter og hvirvlende i 10 sekunder.Tilsæt 10 mikroliter af 40 enheder pr. mikroliter RNase-hæmmer og vortex igen i 10 sekunder. Brug en milliliter pipette, dryp celleaffjedringen i de 50 milliliter to, der indeholder det flydende nitrogen. For at forberede det næste skridt, pre-cool 1,5 milliliter kerne fri rør på tøris og 10 milliliter rustfrit stål slibning krukker.Overfør de frosne celleaffjedringsdråber i krukkerne ved hjælp af en ren steril spatel. Dyk slibeglassene ned i flydende nitrogen i et minut, hvilket sikrer, at væskefasen forbliver over krydset. Opret en Cryo blanding mølle på 27 Hertz for agitation i et minut.Omrør de forseglede slibeglas ved 27 Hertz i et minut i røremøllen. Re-afkøle krukker i flydende nitrogen som før og ryste i et minut yderligere. Overfør krukkerne til iskassen, der indeholder tøris, sammen med de 1,5 milliliter kernefrie rør.Ved hjælp af en lille stålspatel overfører resultaterne i polstret grind dato i rørene. Opbevar derefter rørene på minus 80 grader celsius. I to T175 kolber vokse HEK 293 celler til 60 til 70% sammenløb og Dalbeko's modificerede Eagle medium og 10% føtalt kvæg serum ved 37 grader og 5% kuldioxid.Mindst tre timer før den ønskede fikseringstid skal du udskifte T175-kolbens medier med nøjagtigt 30 milliliter forvarmede komplette medier. Forbered en iskasse til randen med knust vandis og hold i røghætten sammen med de nødvendige buffere, også en is. Hvis du vil knække cellerne ned, skal T175-kolben fjernes fra kuvøsen og formelt trykke den mod isen for at sikre maksimal overfladekontakt.Inde i en kemisk røghætte, vippe kolben på sin side, så medierne indsamler på siden modsat cellerne. Pipette 168 mikroliter på 37% vejes efter volumen formaldehyd direkte ind i de samlede medier. Giver en endelig koncentration på 0,2% formaldehyd.Bland straks. Inkuber kolberne på is i 10 minutter yderligere. Hæld mediet i en passende affaldsbeholder gennem kolbesiden modsat cellerne.Ved hjælp af en strippete, pipette i 30 milliliter af Dalbeko's fosfat buffered saltvand uden calcium og magnesiumioner og desuden indeholder 50 millimolar glycin forsigtigt på siden overfor cellerne. Bland ved at vugge kolben, returnere blitzen til vandret position og inkubere i 10 minutter mere på is. Hæld opløsningen gennem kolbesiden modsat cellen og tilsæt forsigtigt syv milliliter standard 0,25% trypsin EDTA-opløsning for at løsne og suspendere cellerne igen.Inkuber kolben ved stuetemperatur i fem, maksimalt 10 minutter. Find kolben lodret og ved hjælp af et strippete, opsamle de fritliggende celler ved forsigtigt at vaske eventuelle resterende fra kolbevæggene og overfør suspensionen til et 50 milliliterrør, der er sat på is. Suppler straks den indsamlede affjedringsopløsning med 20 milliliter komplette medier og blandes ved forsigtigt at vende røret.Pellet cellerne ved centrifugering røret på 100 G i fem minutter og fire grader celsius. Cellepillen skal være tydeligt synlig. Hæld af medierne og forsigtigt re-suspendere pellet i 10 milliliter af Dalbeko's fosfat buffered saltvand uden glycin.Centrifuge røret igen ved 100 G i fem minutter og ved fire grader celsius Hæld vaskebufferen af og ophæng pelleten igen i 800 mikroliter iskold Dalbekos fosfatbuffered saltvand uden glycin, men indeholder magnesium og calciumioner. Overfør de re-suspenderede celler til et nyt lavt proteinbindingsrør på 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Centrifugere røret ved 100 G i tre minutter ved fire grader celsius.Kassér forsigtigt supernatanten ved hjælp af en milliliter pipetter. På dette stadium kan cellepillen fryses ved minus 80 grader celsius eller gå videre til cellelyset. I et biosikkerhedsskab tilsættes 300 mikroliter lysisbuffer baseret på ikke-ionisk, ikke-denaturerende vaskemiddel og syv mikroliter af arginase-hæmmer og blandes godt ved pipetter ved hjælp af en milliliterspids.Fastgør forsigtigt en 25 gauge nål til en en til tre milliliter sprøjte og kraftigt pipette blandingen ved hjælp af mindst syv langsomme opadgående indtag og hurtige nedadgående udstødning slagtilfælde. Kassér sprøjten og nålen i den skarpe beholder, og gentag proceduren med en 31-gauge nål og 0,3 milliliter sprøjte. Kassér sprøjten og nålen i den skarpe beholder.Centrifugere røret på 12.000 G i fem minutter ved fire grader for at fjerne cellerester. Supernatanten overføres til et nyt lavt proteinbindingsrør på 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Opbevar både cellerester og lysat ved minus 80 grader celsius.Translationelle komplekser er følsomme over for buffernes ioniske sammensætning. Udeladelse af magnesiumchlorid og tilsætning af EDTA ophævede høje sedimenteringsegenskaber, og mens calciumchlorid resulterede i bedre resultattoppe, var forbedringen marginal. Vi valgte således buffer en.2,2% vægt efter volumen formaldehyd glimrende bevaret polysomes og ikke mindske det samlede udbytte i forhold til 4% vægt efter volumen formaldehyd. I pattedyrceller blev der anvendt en meget lavere koncentration af formaldehyd på 0,2% vægt efter volumen. Da højere koncentrationer resulterede i betydelige polyribosomale materialetab.15 millimolar EDTA tilsat lysatet og alle efterfølgende buffere udviste markant mindre destabiliseringseffekt på de polysomale fraktioner, der stammer fra de faste celler. Og denne effekt blev delvist replikeret med 50 millimolar EDTA med materiale fra 4% faste celler, modstå, udfolder sig bedre. Glukoseudtømning fremkalder en af de mest dramatiske og hurtige translationelle hæmmende virkninger på gær.Både nerve tilsat og lokalt årsag betingelser induceret polysome demontering var lidt, men åbenbart mere polyomer bevaret i lav tilsat glukose. Det er vigtigt, at polysomalt materiale fra de faste celler viser en høj sondring mellem de udsultede og ikke-udsultede celler, der angiver formaldehydfikseringens egnethed til at bevare forskelle i dynamiske translationelle processer. I tilgange som taktile paysake, kan det være desuden indsigtsfulde at fjerne små ribosomale subunits, der ikke co-bosætte sig godt med de komplette jordstængler, som vi ansat en to-trins ultracentrifugering, så isolering af SSU, LSU, RS, RNase resistente diazoer, DS, og høj orden polyomer bekræftet af elektronmikroskopi af de faste fraktioner.Sammenlignet med de ikke-faste celler viste materiale fra de faste celler forhøjet tilstedeværelse af labile eIF4A i de hurtigste sedimenterende ribosomale fraktioner. Ved hjælp af fast materiale fra eIF4A tapi stamme til at fange og berige eIF4A indeholdende komplekser med magnetiske IDG perler, vi var i stand til at observere selektiv berigelse af eIF4A i forhold til beta-actin i SSU og RS, men ikke LSU fraktioner fra den anden gradient på RNase en demontering. Sammenlignet med andre metoder til translationel hvile lover formaldehydhandlingens hurtighed på tværs af cellemembraner og den vilkårlige karakter af krydsforbindelser bevarelsen af den maksimale mangfoldighed af oversættelseskomplekser.Vores resultater er i overensstemmelse med anvendeligheden af hurtig formaldehydfiksering for at stabilisere meget forbigående komplekser og evidensens anvendelighed i scenarierne for hurtige cellulære reaktioner på miljøændringer eller stressforhold.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Etablering af Mikrobielle Eukaryote berigelseskulturer fra en kemisk Stratificeret Antarktis Lake og vurdering af kulstofbinding potentiale

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering af ribo Bundet Gryende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; Til at identificere Translationelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv og hurtig Isolering af Debuterende embryoner fra<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frø

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifikation af post-translationelle modifikationer til planteprotein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

En In vivo Crosslinking tilgang til Isoler proteinkomplekser Fra Drosophila Embryoner

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolering og funktionel analyse af mitokondrier fra dyrkede celler og mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Hele genomet Oprensning af ekstrakromosomalt cirkulært DNA fra eukaryote celler

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering af nukleinsyrer: en enkel og hurtig DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...