Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Australian Research Council Discovery Project grant (DP180100111 aan T.P. en N.E.S), National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 aan N.E.S.) en Research Fellowship (APP1135928 aan T.P.). De auteurs erkennen de faciliteiten van Microscopy Australia in het Centre for Advanced Microscopy, Australian National University, een faciliteit die wordt gefinancierd door de universiteit en de federale overheid.

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Formaldehydefixatie is een handige en populaire methode om snelle in vivo crosslinking van biomoleculen te bereiken10,36,45,46,47,48. In vergelijking met de andere potentiële biomolecuuldoelen vereist een succesvolle vangst van translationele complexen een onmiddellijke fixatie tijdens het snel koelen van de cellen of ander materiaal. Zonder de ongedelayeerde stabilisatie is er een potentieel voor verschillende translatiegerelateerde processen om door te gaan, waardoor de complexe verdeling wordt verschoven van de onverstoorbare in vivo toestand49. Vergeleken met de andere methoden van translationele arrestatie en ribosomale complexe stabilisatie, beloven de snelheid van formaldehyde-actie over celmembranen en de willekeurige aard van de crosslinks behoud van de maximale diversiteit van de translatiecomplextussenproducten dichter bij hun oorspronkelijk gedistribueerde toestanden50.
De hier gepresenteerde aanpak is vastgesteld en geoptimaliseerd in zowel gist- als zoogdiercellen, en methoden zijn nu door andere groepen afgeleid voor gebruik in meer divers biologisch materiaal, zoals bij hele gewervelde dieren (bijv. Zebravisembryo's)10,38,39,49,51,52 . Hoewel deze werken gezamenlijk de veelzijdigheid en brede toepasbaarheid van de aanpak verzekeren, kan snelle formaldehyde-crosslinking van translationele complexen als enigszins moeilijk te transponeren worden beschouwd naar nieuwe soorten biologisch materiaal vanwege de noodzaak van optimalisaties en aanpassingen.
Een belangrijke voorwaarde voor het succes van de methode is de heroptimalisatie van de concentratie van het formaldehyde en de celverzamelings- en verstoringstechniek. Minder doorlatende, kleine en ronde gistcellen vereisen een veel hogere (minstens 10-voudige) formaldehydeconcentratie en fysieke verstoring van de vaste cellen. Daarentegen kunnen grote en afgeplatte aanhangende zoogdiercellen in cultuur gemakkelijk overfixeren en moeten ze voorzichtig worden behandeld bij fixatie, terwijl de extractie van de vaste complexen chemisch kan worden uitgevoerd met membraanverstoring met behulp van detergentia. Onder-crosslinking kan minder stabiele of meer kortlevende tussenproducten in staat stellen om te dissociëren of te lekken in een latere toestand. Over-crosslinking kan het vermogen om ribosomale fracties te isoleren en te bestuderen negatief beïnvloeden en kan selectieve vooroordelen creëren, zoals diepere uitputting van zware complexen. In onze observatie kunnen zelfs kleine veranderingen, zoals het type aanhangende menselijke cellen dat wordt gebruikt, de opbrengst van de herstelde crosslinked complexen beïnvloeden en kunnen heroptimalisatie van het crosslinking-regime vereisen. We kunnen ook verwachten dat cellen met aanzienlijk verschillende permeabiliteitseigenschappen, zoals plantencellen, extra uitgebreide optimalisatie van de fixatieomstandigheden nodig hebben52. Toch is het moeilijk om je een soort biologisch materiaal voor te stellen dat volledig onverenigbaar zou zijn met de aanpak.
Een overweging die relevant is voor het fixatieprotocol van zoogdieren is de dichtheid en hoeveelheid celmateriaal die als input wordt gebruikt. Het wordt aanbevolen om de cellen gedurende ten minste 2 dagen continu te laten groeien zonder opnieuw te zaaien of andere verstoringen om externe invloeden op de cellulaire translatiedynamiek te voorkomen. Toepasbaar voor de meeste celtypen, maar voor de meerderheid van de aanhangende cellen consistent bereikte confluentieniveaus van niet meer dan 70% zullen zorgen voor afwezigheid van belangrijke contactremmingseffecten die de translatiesnelheid negatief en onvoorspelbaar kunnen beïnvloeden.
Een ander interessant en potentieel uniek handig kenmerk van formaldehydefixatie dat voortkomt uit zijn willekeurige reactiviteit is het stabilisatie-effect op translationele complexen in systemen van gemengde taxonomie. Bacteriële, en nog meer translationele complexen van mitochondriën, chloroplasten en verschillende intracellulaire parasieten, zijn notoir moeilijk te targeten met specifieke translatieremmers. In de TCP-seq-gegevens daarentegen zijn voetafdrukken die zijn toegewezen aan het mitotranscriptoom gemakkelijk waarneembaar in de gegevens38,39,50. Een interessante latere ontwikkeling zou het gebruik van de aanpak kunnen zijn om vertaling te onderzoeken in hele microgemeenschappen, zoals in bodem-, water- of darmmonsters, waar betrouwbare snelle translationele arrestatie en complexe stabilisatie met andere middelen problematisch zouden zijn.
Er moet ook worden vermeld dat voor het meest gecompliceerde materiaal (zoals harde en / of omvangrijke weefsels) niets het gebruik van formaldehydestabilisatie onmiddellijk na celverstoring en materiaalhomogenisatie verhindert. Deze aanpak wordt al vaak gebruikt om de celinvoervertraging weg te nemen bij het stabiliseren van translationele complexen met specifieke kleine molecuulremmers33,53,54,55. Gezien het feit dat formaldehydefixatie traditioneel wordt gebruikt met uitstekende resultaten voor ex vivo / in vitro monsterstabilisatie in toepassingen zoals elektronenmicroscopie45,56,57,58, kunnen we in dit geval nog minder negatieve effecten verwachten, met name die geassocieerd met de slechte extractie van de translationele complexen uit de grondig gefixeerde cellen.
Onze bevindingen bevestigen de bruikbaarheid van snelle formaldehydefixatie om zeer voorbijgaande complexen te stabiliseren, zoals die met eIF4A. Het is opmerkelijk dat gist eIF4A, in tegenstelling tot zoogdieren, veel zwakker geassocieerd is met het dopbindende complex eIF4F en, als gevolg daarvan, translationele complexen in het algemeen. eIF4A gaat meestal verloren tijdens een uitgebreide zuivering van het ribosomale materiaal in gist29,59,60,61,62,63. Toch is het in het in vivo-vastegistmateriaal mogelijk om een betrouwbare verrijking van eIF4A te bereiken in alle fracties van translationele complexen waar de aanwezigheid ervan zou worden verwacht. De eerder gepubliceerde Sel-TCP-seq-gegevens hebben de verrijking van eIF2 en eIF3 aangetoond die sterker associëren met de ribosomen (maar ook voorbijgaand optredende co-translationele eiwitcomplexassemblage onthulden)39. De methode is dus geschikt voor de detectie van zowel sterkere als zwakkere gehechte bestanddelen van de translationele complexen.
Samenvattend hebben we een benadering gepresenteerd die nuttig is om vooral inzicht te krijgen in de veranderingen die optreden in de startfase van de translatie en wanneer minimaal verstoorde ribosomale verdeling over het mRNA vereist is. Belangrijk is dat de aanpak geschikt is voor de stabilisatie van relatief labiele en dynamische componenten van translationele complexen, zoals eIF4A, en breed kan worden gebruikt, onderworpen aan noodzakelijke optimalisaties. We hebben ook bewijs geleverd van het nut van formaldehydefixatie in de scenario's van snelle dynamische verandering van translatie, waardoor onderzoeksgebieden worden geopend, zoals snelle cellulaire reacties op omgevingsveranderingen of stressomstandigheden.

Levende organismen zijn onderhevig aan dynamische intra- en extracellulaire veranderingen gedurende hun levensduur, die snelle reacties vereisen om de homeostase te behouden en overleving te garanderen. Om aanpassing aan het milieu mogelijk te maken, passen eukaryote cellen hun metabolisme aan via genexpressiecontrole. Genexpressiecontrole kan worden uitgeoefend tijdens transcriptie en/of translatie; waarbij translationele responsen over het algemeen sneller optreden1,2,3,4. Translationele veranderingen treden bijvoorbeeld meestal op binnen 1-30 minuten na het begin van de stress, terwijl veranderingen op transcriptieniveau uren na stressblootstelling3,4,5volgen. Veranderingen in de translatie-output worden sneller bereikt als gevolg van de aanhoudende beschikbaarheid van boodschapper (m)RNA-moleculen in het cytoplasma. Omgekeerd moeten op transcriptieniveau nieuwe mRNA-moleculen worden gesynthetiseerd en in eukaryoten worden verwerkt en geëxporteerd vanuit de kern, waardoor uitgebreide vertragingen in de responstijd2,4,6,7, 8ontstaan.
Acute translationele respons op stress wordt over het algemeen gekenmerkt door een algehele afname van de translatie-output, met de selectieve upregulatie van eiwitten die nodig zijn voor celoverleving1,3,4,9. Het verminderen van de eiwitproductie-output wordt als cruciaal beschouwd vanwege de hoge energiekosten van het proces3,7. Om de selectieve remming en upregulatie te vergemakkelijken, worden translationele responsen bediend door een reeks complexe regulerende mechanismen. Regulatie kan worden uitgeoefend in alle fasen van de vertaling: initiatie, verlenging, beëindiging van polypeptide biosynthese en ribosomale recycling10,11,12,13, maar wordt het sterkst tentoongesteld in de initiatiefase5,7,9,10,13. Tijdens de initiatie bindt de kleine ribosomale subeenheid (SSU), bijgestaan door eukaryote initiatiefactoren (eIFs), zich aan en scant het 5' onvertaalde gebied (UTR) van mRNA totdat een startcodon wordt herkend2,5,6,8,11,12,13. Regelgevende mechanismen zijn vaak gericht op eIF's die van invloed zijn op hechting, scannen en codonherkenning starten. Bijvoorbeeld de initiatiefactor eIF2, een essentiële vertaalfactor die helpt bij de rekrutering van een initiator Met-tRNAiMet aan de SSU, is vaak gericht op eukaryoten onder stressomstandigheden4,6,11. In gist kan fosforylering van deze factor worden geïnduceerd onder tekort aan voedingsstoffen en osmotische stress1,4,11,14,15, en in zoogdiercellen kunnen aminozuurgebrek, endoplasmatisch reticulum (ER) stress, UV-stress, virale infectie en veranderde zuurstofniveaus deze reactie veroorzaken8,9,11. Snelle upregulatie van specifieke mRNA-translatie is duidelijk in de zoogdiercelrespons op hypoxie, die een wereldwijde snelle translatieremming en selectieve upregulatie van hypoxie-induceerbare factoren (HIFs) biosynthese vertoont. HIFs zijn transcriptiefactoren, die vervolgens cellulaire herprogrammering op langere termijn op DNA-transcriptieniveau uitlokken8,9,16. Vergelijkbare reacties zijn waargenomen in gist onder hittestress, met snelle translationele expressie van Heat Shock Proteins (HSP's) gevolgd door vertraagde reacties op transcriptieniveau17,18. Naast het tekort aan voedingsstoffen en hitteschok zijn translationele reacties in gist bestudeerd onder verschillende zuurstof8,19zoutgehalte5, fosfaat, zwavel20,21 en stikstof22,23 Niveaus. Dit onderzoek heeft wijdverspreide implicaties voor het industriële gebruik van gist, zoals bakken en fermentatie24,25. Translationele reacties kunnen ook een rol spelen bij het bevorderen van het begrip van ziekten zoals neurodegeneratieve aandoeningen en hartaandoeningen, die worden gekenmerkt door intracellulaire spanningen zoals oxidatieve stress. Over het algemeen zijn translationele reacties een integraal onderdeel van de genexpressiecontrole en vergemakkelijken ze een snelle aanpassing aan een breed scala aan stressomstandigheden in eukaryote organismen.
Om translationele responsen te bestuderen, zijn methoden nodig die minimaal vervormde momentopnamen van het vertaallandschap bieden. Polysome profiling is een klassieke benadering die wordt gebruikt in de studie van translatie over mRNA, waarbij poly(ribo)somale fracties van mRNA worden gescheiden via ultracentrifugatie via sucrosegradiënten26,27. De aanpak kan worden gebruikt om de vertaalniveaus voor individuele mRNA's te onderzoeken (met de detectiemethoden zoals reverse transcriptie en polymerasekettingreactie, RT-PCR26), of wereldwijd in combinatie met high-throughput technieken (microarray of RNA-seq28,29). Een meer geëvolueerde benadering is ribosoomprofilering, die de studie mogelijk maakt van posities van langwerpige ribosomen langs een mRNA-molecuul op genoombrede schaal, evenals de gevolgtrekking van efficiëntie van translatie over transcriptoom en gebruik van de belangrijkste en alternatieve startplaatsen30,31. Ribosoomprofilering omvat de isolatie en sequencing van mRNA-fragmenten beschermd door ribosomale aanwezigheid eroverheen. Ribosoomprofilering heeft veel inzicht gegeven in de translatiedynamiek over een aantal aandoeningen, waaronder hypoxische stress, hitteschok en oxidatieve stress31,32. De techniek is aangepast aan meerdere soorten bronmateriaal, waaronder gist en zoogdiercellen.
Hoewel polysoom- en ribosoomprofilering van fundamenteel belang zijn geweest bij het uitbreiden van de mogelijkheden van onderzoek in vertaling, omvat het vertaalproces verschillende translationele tussenproducten en complexen die moeilijk te vangen zijn met deze methoden11,13. Een bijkomende beperking komt voort uit het gebrek aan vermogen om snelle responstypen te bestuderen, aangezien translationele complexen ofwel in vivo worden gestabiliseerd door de toevoeging van specifieke translatieremmers (antibiotica), wat leidt tot bepaalde ribosoomverdelingsartefacten, of ex vivo op cellyse specifiek (antibiotica) of niet-specifiek (hoog zout- of magnesiumionen), wat leidt tot de ontbering van de korterlevende of minder stabiele tussenproducten33, 34,35.
Formaldehyde wordt veel gebruikt om nucleïnezuren en eiwitten te crosslinken, zoals in chromatine immunoprecipitatie (ChIP) en crosslinking immunoprecipitatie (CLIP) studies. Het kleine formaat en de uitstekende celdoorlaatbaarheid zorgen voor een snelle in vivo actie36. Op basis van de snelle formaldehyde crosslinking is de ribosoomprofileringsbenadering uitgebreid met de Translation Complex Profile Sequencing (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, voor het eerst ontwikkeld in gist, maakt het mogelijk om alle translatietussenproducten vast te leggen, inclusief scanning of post-termination SSU-complexen en meerdere ribosomale configuraties37,38,41,42. De methode is gebruikt in verschillende studies10,38,39,41, 42,waarvan sommige een combinatorische benadering van zowel translatieremmers als formaldehyde-crosslinking gebruiken om de arrestatie van vertaling tevergemakkelijken. Een andere aangepaste versie van de techniek, selectieve TCP-seq39, is onlangs gebruikt om immunozuivering van de crosslinked complexen op te nemen, waardoor het bereik van de TCP-seq-toepassingen wordt verbreed. De snelle, efficiënte en omkeerbare aard van formaldehyde crosslinking maakt deze benaderingen geschikt voor het bestuderen van transiënte mRNA:translatie complexe interacties, met name in de context van zeer dynamische responsroutes op translatieniveau.
Hier beschrijven we de processen van in vivo formaldehyde crosslinking met het oog op uitgebreide translatie complexe stabilisatie en isolatie. We bieden afzonderlijke protocollen genuanceerd voor gist- en zoogdiercellen(figuur 1). We schetsen verder voorbeelden van het latere gebruik van het crosslink-gestabiliseerde materiaal (figuur 1), zoals voor co-gezuiverde eiwitfactordetectie met behulp van immunoblotting (western-blotting), immuno-geassisteerde zuivering (of 'immunoprecipitatie'; IP) en verrijking van translationele complexen die specifieke factoren van belang, elektronenmicroscopie en RNA-sequencing bevatten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> Figuur 1: Schema met een overzicht van de typische experimentele opstelling. De belangrijkste stappen van in vivo formaldehydestabilisatie van translationele complexen worden weergegeven als een stroomdiagram, aangevuld met informatie over de belangrijkste noodzakelijke instrumenten. Mogelijke downstream-toepassingen van het verknoopte materiaal worden geschetst, inclusief voorbeelden die met succes zijn gebruikt maar niet direct in dit protocol zijn behandeld, zoals SPRI-parelzuivering van RNA, RNA-sequencing en massaspectrometrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

Snelle reacties met snelle herverdeling van boodschapper(m)RNA en veranderingen in mRNA-translatie zijn relevant voor voortdurende homeostatische aanpassingen van de cellen. Deze aanpassingen zijn van cruciaal belang voor de overlevingskansen van eukaryote cellen en 'damage control' tijdens fluctuerende voedings- en zoutgehalteniveaus, temperatuur en verschillende chemische en stralingsstress. Vanwege de zeer dynamische aard van de reacties op RNA-niveau en de instabiliteit van veel van de RNA:RNA- en RNA:eiwittussenproducten, is het verkrijgen van een zinvolle momentopname van de cytoplasmatische RNA-toestand alleen mogelijk met een beperkt aantal methoden. Transcriptoombrede, op RNA-seq gebaseerde ribosoomprofileringsexperimenten behoren tot de meest informatieve gegevensbronnen voor de controle van de translatie. Afwezigheid van een uniform RNA en RNA:eiwit intermediaire stabilisatie kan echter leiden tot verschillende vooroordelen, met name in de snelle cellulaire responsroutes. In dit artikel bieden we een gedetailleerd protocol van snelle fixatie dat van toepassing is op eukaryote cellen met verschillende permeabiliteit, om te helpen bij RNA en RNA: eiwit intermediaire stabilisatie. We geven verder voorbeelden van isolatie van de gestabiliseerde RNA:eiwitcomplexen op basis van hun co-sedimentatie met ribosomale en poly(ribo)somale fracties. Het gescheiden gestabiliseerde materiaal kan vervolgens worden gebruikt als onderdeel van ribosoomprofileringsachtige experimenten, zoals in translation complex profile sequencing (TCP-seq) benadering en zijn afgeleiden. Veelzijdigheid van de TCP-seq-achtige methoden is nu aangetoond door de toepassingen in een verscheidenheid aan organismen en celtypen. De gestabiliseerde complexen kunnen ook extra affiniteitsgezuiverd en in beeld worden gebracht met behulp van elektronenmicroscopie, gescheiden in verschillende poly (ribo) somale fracties en onderworpen aan RNA-sequencing, vanwege het gemak van de crosslink-omkering. Daarom kunnen methoden op basis van snap-chilling en formaldehyde-fixatie, gevolgd door de sedimentatie-gebaseerde of een ander type RNA:eiwitcomplexverrijking, van bijzonder belang zijn bij het onderzoeken van fijnere details van snelle RNA:eiwitcomplexdynamiek in levende cellen.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

De workflow bestaat uit het kweken van cellen in strikt gecontroleerde omgevingsomstandigheden, ze snel koelen met behulp van smeltwater / ijs en fixeren met vooraf geoptimaliseerde concentratie formaldehyde en incubatietijd. De fixatiereactie wordt vervolgens geblust met behulp van een teveel aan primaire aminogroepbevattende verbindingen, zoals glycine of tryps. Cellen worden verzameld, gewassen en kunnen bevroren worden opgeslagen.Vaste cellen kunnen mechanisch of chemisch worden gelyseerd en het lysaat wordt gebruikt voor de scheiding van de ribosomale fracties op basis van hun moleculaire grootte, sedimentatie-eigenschappen of affiniteitsmarkers. De aanpak resulteert in veelzijdig materiaal dat bruikbaar is voor immunoondersteunde zuivering en detectie, verrijking van complexen die specifieke factoren bevatten in elektronenmicroscopie. Na crosslinked deep blocking, RNA amplificatie of hybridisatie gebaseerde analyses, worden RNA sequencing en massaspectrometrie mogelijk.Zet een gistcultuur van één liter op in een orbitale shaker met een beginnende optische dichtheid van niet meer dan 0,05 absorptie-eenheden op 600 nanometer en gebruik pepton en dextrosemedia bij 30 graden Celsius. Stel een voorbereidende centrifuge in met compatibele rotor- en centrifugeflessen voor het pelleteren van de vloeibare suspensie van gistcellen bij 5000 G bij vier graden Celsius. Houd de optische dichtheid van de groeiende cellen bij.Het moet tussen 0,6 en 0,8 absorptie-eenheden en 600 nanometer zijn op het moment van verzamelen als de exponentiële groeifase van belang is. Zodra de cellen klaar zijn, zet je een koelbox in de chemische zuurkast met een bakker met 250 gram schoon crushed water ijs en laat je ook 25 milliliter trypsine en vers gekochte methanol gestabiliseerde 37% formaldehyde-oplossing in de kap zien. Giet de ene laatste celkweek in de bakker met daarin het ijs.Voeg vervolgens 75 milliliter 37% formaldehyde toe aan een eindconcentratie van 2,2% gewicht over volume en roer het mengsel intens totdat het ijs smelt. Zodra het ijs is gesmolten, stelt u een timer in voor 10 minuten Na het broeden gedurende 10 minuten, brengt u de cultuur over in de voorgekoelde centrifugeflessen en pellett u de cellen door centrifugering op vier graden Celsius, 5000 G gedurende vijf minuten. Terwijl de spin is, koel een buis van 50 milliliter voor en bewaar vers bereide buffer A met glycine om eventuele resterende formaldehyde op ijs te neutraliseren.Plaats na het centrifugeren de centrifugebuizen op ijs met de pelletzijde in contact met het ijs. Breng de buizen in de zuurkast en gooi het supernatant weg in een formaldehyde afvalcontainer. Hang de celkorrel opnieuw uit oude buizen in 20 milliliter buffer A met behulp van een stripette van 25 milliliter en breng over in een buis van 50 milliliter.Vul het volume aan tot 40 milliliter met buffer A en vang de wascellen op door een centrifugering van vier graden Celsius, 5000 G gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en suspensie de celkorrel opnieuw in buffer A van 40 milliliter, buffer A die geen glycine bevat om glycineverontreiniging te verwijderen. Pellet de cellen opnieuw door centrifugeren bij vier graden Celsius, 5000 G vijf minuten.Herhaal de wasbeurten met buffer A, nog één keer. Gooi het bovennatuurlijk middel weg en leg de celkorrel op ijs. Weeg de buis met de pellet, de natte celmassa moet ongeveer één gram per liter celcultuur zijn.Vul polystyreen uit doos bekleed met aluminiumfolie met vloeibare stikstof tot een diepte van ongeveer drie centimeter. Plaats op 50 milliliter buis rechtop in de doos. Suspensie de pellet opnieuw in 550 microliter buffer A twee door gedurende 10 seconden te pipetteren en vortexen.Voeg 10 microliter van 40 eenheden per microliter RNase-remmer toe en vortex opnieuw gedurende 10 seconden. Druppel met behulp van een pipet van één milliliter de celsuspensie in de 50 milliliter twee die de vloeibare stikstof bevatten. Om u voor te bereiden op de volgende stap, koelt u 1,5 milliliter kernvrije buizen voor op droogijs en 10 milliliter roestvrijstalen slijppotten.Breng de bevroren celsuspendruppels over in de potten met behulp van een schone steriele spatel. Dompel de maalpotten gedurende één minuut onder in vloeibare stikstof, zodat de vloeibare fase boven de junctie blijft. Zet een Cryo-mengmolen op 27 Hertz voor agitatie gedurende één minuut.Roer de verzegelde maalpotten op 27 Hertz gedurende één minuut in de mengmolen. Koel de potten opnieuw af in vloeibare stikstof zoals voorheen en schud nog een minuut verder. Breng de potten over naar de ijsdoos met droogijs samen met de 1,5 milliliter kernvrije buizen.Met behulp van een kleine stalen spatel worden de resultaten in gewatteerde maaldatum in de buizen overgebracht. Bewaar de buisjes vervolgens bij min 80 graden. In twee T175 Kolven groeien HEK 293 cellen tot 60 tot 70% confluentie en Dalbeko's gemodificeerd Eagle medium en 10% foetaal runderserum bij 37 graden en 5% koolstofdioxide.Vervang ten minste drie uur vóór de gewenste fixatietijd de media van de T175-kolf door precies 30 milliliter voorverwarmde complete media. Bereid een ijskast tot de rand voor met gemalen waterijs en bewaar in de zuurkast samen met de vereiste buffers, ook een ijs. Om de cellen te koelen, verwijdert u de T175-kolf uit de incubator en drukt u deze formeel tegen het ijs om maximaal contact met het oppervlak te garanderen.Kantel in een chemische zuurkast de kolf op zijn kant zodat de media zich verzamelen aan de kant tegenover de cellen. Pipetteer 168 microliter van 37 volumeprocent formaldehyde rechtstreeks in de gepoolde media. Dit geeft een eindconcentratie van 0,2% formaldehyde.Meteen mengen. Incubeer de kolven verder nog 10 minuten op ijs. Giet de media af in een geschikte afvalcontainer via de kolfzijde tegenover de cellen.Pipetteer met behulp van een strippete 30 milliliter Dalbeko's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium- en magnesiumionen en bevat bovendien 50 millimolar glycine zachtjes aan de kant tegenover de cellen. Meng door de kolf te wiegen, breng de flitser terug in horizontale positie en incubeer nog 10 minuten op ijs. Giet de oplossing af via de kolfzijde tegenover de cel en voeg voorzichtig zeven milliliter standaard 0,25% trypsine EDTA-oplossing toe om de cellen los te maken en opnieuw te laten suspenseren.Incubeer de kolf bij kamertemperatuur gedurende vijf, maximaal 10 minuten. Plaats de kolf verticaal en gebruik een strippete, verzamel de losgemaakte cellen door voorzichtig de resterende van de kolfwanden te wassen en breng de suspensie over in een buis van 50 milliliter die op ijs is gezet. Vul de verzamelde suspensieoplossing onmiddellijk aan met 20 milliliter complete media en meng door de buis voorzichtig om te draaien.Pellet de cellen door de buis vijf minuten en vier graden op 100 G te centrifugeren. Celkorrel moet duidelijk zichtbaar zijn. Giet de media af en suspensie de pellet voorzichtig opnieuw in 10 milliliter Dalbeko's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder glycine.Centrifugeer de buis opnieuw bij 100 G gedurende vijf minuten en bij vier graden Celsius Giet de wasbuffer af en suspensie de pellet opnieuw in 800 microliter ijskoude Dalbeko's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder glycine, maar met magnesium- en calciumionen. Breng de opnieuw gesuspendeerde cellen over in een nieuwe microcentrifugebuis met een laag eiwitgehalte van 1,5 milliliter. Centrifugeer de buis bij 100 G gedurende drie minuten bij vier graden Celsius.Gooi het supernatant voorzichtig weg met behulp van een milliliter pipetter. In dit stadium kan de celkorrel worden ingevroren bij min 80 graden Celsius of doorgaan naar de cellysisstap. Voeg in een bioveiligheidskast 300 microliter lysisbuffer op basis van niet-ionisch, niet-denaturerend wasmiddel en zeven microliter arginaseremmer toe en meng goed door te pipetteren met één milliliterpunt.Bevestig voorzichtig een naald van 25 gauge aan een spuit van één tot drie milliliter en pipetteer het mengsel krachtig met behulp van ten minste zeven langzame opwaartse inlaat en snelle neerwaartse uitlaatslagen. Gooi de spuit en naald in de bak van de sharp en herhaal de procedure met een naald van 31 gauge en een spuit van 0,3 milliliter. Gooi de spuit en naald in de bak van de sharp.Centrifugeer de buis bij 12.000 G gedurende vijf minuten bij vier graden om het celafval te verwijderen. Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis met een laag eiwitgehalte van 1,5 milliliter. Bewaar zowel het celafval als lysaat bij min 80 graden celsius.Translationele complexen zijn gevoelig voor de ionische samenstelling van de buffers. Omittance van magnesiumchloride en toevoeging van EDTA trokken hoge sedimentatie-eigenschappen af, en hoewel calciumchloride resulteerde in betere resultaatpieken, was de verbetering marginaal. We kozen dus voor buffer één.2,2% volumegewicht formaldehyde heeft de polysomen uitstekend geconserveerd en heeft de totale opbrengst niet verlaagd in vergelijking met 4% volumegewicht formaldehyde. In zoogdiercellen werd een veel lagere concentratie formaldehyde van 0,2 volumeprocent gebruikt. Hogere concentraties resulteerden in aanzienlijk polyribosomaal materiaalverlies.15 millimolaire EDTA toegevoegd aan het lysaat en alle daaropvolgende buffers vertoonden een duidelijk minder destabiliserend effect op de polysomale fracties, afgeleid van de vaste cellen. En dit effect werd gedeeltelijk gerepliceerd met 50 millimolaire EDTA met materiaal van 4% vaste cellen, weerstand biedend, zich beter ontvouwend. Glucose-uitputting veroorzaakt een van de meest dramatische en snelle translationele remmende effecten op gist.Zowel zenuw toegevoegd als lokaal veroorzaakte omstandigheden geïnduceerde polysoom demontage was licht, maar blijkbaar meer polysomen vastgehouden in lage toegevoegde glucose. Belangrijk is dat polysomaal materiaal uit de vaste cellen een hoog onderscheid laat zien tussen de uitgehongerde en niet-uitgehongerde cellen, wat wijst op de geschiktheid van formaldehydefixatie om verschillen in dynamische translatieprocessen te behouden. In benaderingen zoals tacy paysake kan het extra inzichtelijk zijn om kleine ribosomale subeenheden te verwijderen die niet goed samenvallen met de volledige wortelstokken waarvoor we een tweetraps ultracentrifugatie hebben gebruikt, waardoor de isolatie van SSU, LSU, RS, RNase-resistente diazomen, DS en hoge orde polysomen bevestigd door elektronenmicroscopie van de vaste fracties mogelijk is.Vergeleken met de niet-vaste cellen vertoonde materiaal uit de vaste cellen een verhoogde aanwezigheid van labiele eIF4A in de snelst sedimenterende ribosomale fracties. Met behulp van vast materiaal van de eIF4A tapi-stam om eIF4A-bevattende complexen met magnetische IDG-kralen te vangen en te verrijken, konden we selectieve verrijking van de eIF4A waarnemen in vergelijking met bèta-actine in SSU en RS, maar niet LSU-fracties van de tweede gradiënt op RNase één demontage. Vergeleken met andere methoden van translationele rust, belooft de snelheid van formaldehyde-actie over celmembranen en de willekeurige aard van dwarsverbindingen het behoud van de maximale diversiteit van vertaalcomplextussenproducten.Onze bevindingen voldoen aan de bruikbaarheid van snelle formaldehydefixatie om zeer voorbijgaande complexen te stabiliseren en bewijzen het nut ervan in de scenario's van snelle cellulaire reacties op omgevingsveranderingen of stressomstandigheden.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Oprichting van Microbiële Eukaryote Enrichment Culturen van een chemisch Stratified Antarctic Lake en Beoordeling van Carbon Fixatie Potentiële

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo&#39;s van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaden

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Een In vivo Crosslinking Aanpak eiwitcomplexen te isoleren van Drosophila Embryo&#39;s

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Genoom-brede Zuivering van extrachromosomale circulaire DNA van eukaryote cellen

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...