Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
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Ce travail a été soutenu par une subvention du projet de découverte du Conseil australien de la recherche (DP180100111 à T.P. et N.E.S.), une subvention de chercheur du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (GNT1175388 à N.E.S.) et une bourse de recherche (APP1135928 à T.P.). Les auteurs reconnaissent les installations de Microscopy Australia au Centre for Advanced Microscopy de l’Université nationale australienne, une installation financée par l’Université et le gouvernement fédéral.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La fixation du formaldéhyde est une méthode pratique et populaire pour obtenir une réticulation rapide in vivo des biomolécules10,36,45,46,47,48. Par rapport aux autres cibles potentielles de biomolécules, la capture réussie de complexes translationnels nécessite une fixation immédiate lors du refroidissement instantané des cellules ou d’un autre matériau. Sans la stabilisation non retardée, il est possible que différents processus liés à la traduction se poursuivent, déplaçant la distribution complexe loin de l’état in vivo non perturbé49. Par rapport aux autres méthodes d’arrêt translationnel et de stabilisation du complexe ribosomique, la rapidité de l’action du formaldéhyde à travers les membranes cellulaires et la nature aveugle des réticulations promettent la préservation de la diversité maximale des intermédiaires complexes de traduction plus proches de leurs états distribués nativement50.
L’approche présentée ici a été établie et optimisée dans les cellules de levure et de mammifère, et des méthodes ont maintenant été dérivées par d’autres groupes pour une utilisation dans du matériel biologique plus diversifié, comme chez les vertébrés entiers (par exemple, les embryons de poisson zèbre)10,38,39,49,51,52 . Bien que ces travaux rassurent collectivement la polyvalence et la large applicabilité de l’approche, la réticulation rapide du formaldéhyde des complexes translationnels peut être considérée comme quelque peu difficile à transposer à de nouveaux types de matériel biologique en raison de la nécessité d’optimisations et d’ajustements.
Une exigence primordiale pour le succès de la méthode est la ré-optimisation de la concentration du formaldéhyde et la technique de collecte et de perturbation cellulaire. Les cellules de levure moins perméables, petites et rondes nécessitent une concentration de formaldéhyde beaucoup plus élevée (au moins 10 fois) et une perturbation physique des cellules fixes. En revanche, les cellules de mammifères adhérentes grandes et aplaties en culture peuvent être facilement surfixées et nécessitent une manipulation douce lors de la fixation, tandis que l’extraction des complexes fixes peut être effectuée chimiquement avec perturbation de la membrane à l’aide de détergents. La sous-réticulation peut permettre à des intermédiaires moins stables ou à plus courte durée de vie de se dissocier ou de s’infiltrer dans un état ultérieur. La surréticulation peut affecter négativement la capacité d’isoler et d’étudier les fractions ribosomiques et peut créer des biais sélectifs tels que l’épuisement plus profond des complexes lourds. Dans notre observation, même des altérations mineures, telles que le type de cellules humaines adhérentes utilisées, peuvent affecter le rendement des complexes réticulés récupérés et peuvent nécessiter une réoptimisation du schéma de réticulation. Nous pouvons également prévoir que les cellules ayant des propriétés de perméabilité sensiblement différentes, telles que les cellules végétales, nécessiteront une optimisation supplémentaire étendue des conditions de fixation52. Pourtant, il est difficile d’imaginer un type de matériel biologique qui serait totalement incompatible avec l’approche.
Une considération pertinente pour le protocole de fixation des mammifères est la densité et la quantité de matériel cellulaire utilisé comme intrant. Il est recommandé de faire croître les cellules en continu sans réensemencement ou autres perturbations pendant au moins 2 jours pour éviter les influences externes sur la dynamique de la traduction cellulaire. Applicable pour la plupart des types de cellules, mais pour la majorité des cellules adhérentes, des niveaux de confluence ne dépassant pas 70% garantiront l’absence d’effets majeurs d’inhibition de contact pouvant affecter négativement et de manière imprévisible les taux de traduction.
Une autre caractéristique intéressante, et potentiellement particulièrement pratique, de la fixation du formaldéhyde découlant de sa réactivité aveugle est l’effet de stabilisation sur les complexes translationnels dans les systèmes de taxonomie mixte. Les complexes bactériens, et plus encore translationnels de mitochondries, de chloroplastes et de différents parasites intracellulaires, ont été notoirement difficiles à cibler avec des inhibiteurs de traduction spécifiques. En revanche, dans les données TCP-seq, les empreintes mappées au mitotranscriptome sont facilement observables dans les données38,39,50. Un développement ultérieur intéressant pourrait être l’utilisation de l’approche pour étudier la traduction dans des microcommunautés entières, telles que dans des échantillons de sol, d’eau ou d’intestin, où un arrêt translationnel rapide fiable et une stabilisation complexe avec tout autre moyen seraient problématiques.
Il convient également de mentionner que pour les matériaux les plus compliqués (tels que les tissus durs et / ou volumineux), rien n’empêche l’utilisation de la stabilisation du formaldéhyde immédiatement après la perturbation cellulaire et l’homogénéisation du matériau. Cette approche est déjà fréquemment utilisée pour éliminer le délai d’entrée cellulaire lors de la stabilisation de complexes translationnels avec des inhibiteurs spécifiques de petites molécules33,53,54,55. Étant donné que la fixation du formaldéhyde a été traditionnellement utilisée avec d’excellents résultats pour la stabilisation d’échantillons ex vivo / in vitro dans des applications telles que la microscopie électronique45,56 , 57,58, nous pouvons nous attendre à des effets encore moins négatifs dans ce cas, en particulier ceux associés à la mauvaise extraction des complexes translationnels des cellules complètement fixées.
Nos résultats confirment la facilité d’utilisation de la fixation rapide du formaldéhyde pour stabiliser les complexes hautement transitoires, tels que ceux qui incluent eIF4A. Il est à noter que, contrairement aux mammifères, la levure eIF4A est beaucoup plus faiblement associée au complexe de liaison au capuchon eIF4F et, par conséquent, aux complexes translationnels en général. eIF4A est généralement perdu lors d’une purification étendue du matériel ribosomique dans la levure29,59,60,61,62,63. Pourtant, dans le matériau de levure fixe in vivo,il est possible d’obtenir un enrichissement fiable d’eIF4A dans toutes les fractions de complexes translationnels où sa présence serait anticipée. Les données Sel-TCP-seq publiées précédemment ont démontré l’enrichissement d’eIF2 et d’eIF3 qui s’associent plus fortement aux ribosomes (mais ont également révélé un assemblage transitoire de complexe protéique co-translationnel)39. Ainsi, la méthode convient à la détection des constituants attachés plus forts et plus faibles des complexes translationnels.
Pour résumer, nous avons présenté une approche utile pour mieux comprendre principalement les changements qui se produisent à la phase d’initiation de la traduction et lorsque la distribution ribosomique sur l’ARNm est minimalement perturbée. Il est important de noter que l’approche convient à la stabilisation de composants relativement labiles et dynamiques de complexes translationnels, tels que eIF4A, et peut être largement utilisée sous réserve des optimisations nécessaires. Nous avons également fourni des preuves de l’utilité de la fixation du formaldéhyde dans les scénarios de changement dynamique rapide de la traduction, ouvrant des domaines d’investigation tels que les réponses cellulaires rapides aux changements environnementaux ou aux conditions de stress.

Les organismes vivants sont soumis à des changements intra- et extracellulaires dynamiques tout au long de leur vie, qui nécessitent des réponses rapides pour maintenir l’homéostasie et assurer leur survie. Pour permettre l’adaptation environnementale, les cellules eucaryotes ajustent leur métabolisme via le contrôle de l’expression des gènes. Le contrôle de l’expression génique peut être exercé pendant la transcription et/ou la traduction; avec des réponses translationnelles se produisant généralement plus rapidement1,2,3,4. Par exemple, les changements translationnels surviennent généralement dans les 1 à 30 minutes suivant l’apparition du stress, tandis que les altérations au niveau de la transcription suivent des heures aprèsl’expositionau stress3,4,5. Les altérations de la production de traduction sont obtenues plus rapidement en raison de la disponibilité persistante de molécules d’ARN messager (m) dans le cytoplasme. Inversement, au niveau de la transcription, de nouvelles molécules d’ARNm doivent être synthétisées, et chez les eucaryotes, traitées et exportées à partir du noyau, produisant des retards importants dans le temps de réponse2,4,6,7,8.
La réponse translationnelle aiguë au stress est généralement caractérisée par une diminution globale de la production de traduction, avec la régulation sélective à la hausse des protéines nécessaires à la survie cellulaire1,3,4,9. La diminution de la production de protéines est considérée comme cruciale en raison de la dépense énergétique élevée du processus3,7. Pour faciliter l’inhibition sélective et la régulation à la hausse, les réponses translationnelles sont servies par une gamme de mécanismes de régulation complexes. La régulation peut être exercée à travers toutes les phases de la traduction : initiation, allongement, fin de la biosynthèse polypeptidique et recyclage ribosomique10,11,12,13, mais se manifeste le plus fortement à la phase d’initiation5,7,9,10,13. Au cours de l’initiation, la petite sous-unité ribosomique (SSU), assistée par des facteurs d’initiation eucaryotes (eIF), se lie et scanne la région non traduite (UTR) de 5' de l’ARNm jusqu’à ce qu’un codon de départ soit reconnu2,5,6,8,11,12,13. Les mécanismes de réglementation ciblent souvent les eIF affectant la reconnaissance des joints, la numérisation et le démarrage. Par exemple, le facteur d’initiation eIF2, un facteur de traduction essentiel qui aide au recrutement d’un initiateur Met-ARNtiMet à la SSU, est souvent ciblé chez les eucaryotes dans des conditions de stress4,6,11. Chez la levure, la phosphorylation de ce facteur peut être induite sous privation de nutriments et stress osmotique1,4,11,14,15, et dans les cellules de mammifères, la famine en acides aminés, le stress du réticulum endoplasmique (RE), le stress UV, l’infection virale et les niveaux d’oxygène altérés peuvent déclencher cette réponse8,9,11. La régulation rapide de la traduction spécifique de l’ARNm est évidente dans la réponse des cellules de mammifères à l’hypoxie, qui présente une inhibition globale de la traduction rapide et une régulation sélective à la hausse de la biosynthèse des facteurs inductibles par l’hypoxie (HIF). Les HIF sont des facteurs de transcription, qui provoquent ensuite une reprogrammation cellulaire à plus long terme au niveau de la transcription de l’ADN.8,9,16. Des réponses similaires ont été observées chez les levures soumises à un stress thermique, avec une expression translationnelle rapide des protéines de choc thermique (HSP) suivie de réponses retardées au niveau de la transcription17,18. En plus de la privation de nutriments et du choc thermique, les réponses translationnelles chez la levure ont été étudiées sous différents modes d’oxygène.8,19salinité5, phosphate, soufre20,21 et l’azote22,23 Niveaux. Cette recherche a des implications généralisées pour les utilisations industrielles de la levure, telles que la cuisson et la fermentation24,25. Les réponses translationnelles peuvent également contribuer à mieux comprendre des maladies telles que les troubles neurodégénératifs et les maladies cardiaques, qui se caractérisent par des stress intracellulaires tels que le stress oxydatif. Dans l’ensemble, les réponses translationnelles font partie intégrante du contrôle de l’expression génique et facilitent l’adaptation rapide à un large éventail de conditions de stress chez les organismes eucaryotes.
Afin d’étudier les réponses translationnelles, il est nécessaire de disposer de méthodes qui fournissent des instantanés du paysage de la traduction les moins déformés. Le profilage des polysomes est une approche classique utilisée dans l’étude de la traduction à travers l’ARNm, impliquant la séparation des fractions poly(ribo)somales de l’ARNm par ultracentrifugation par gradients de saccharose26,27. L’approche peut être utilisée pour explorer les niveaux de traduction pour les ARNm individuels (avec les méthodes de détection telles que la transcription inverse et la réaction en chaîne par polymérase, RT-PCR26),ou globalement en conjonction avec des techniques à haut débit (microréseau ou ARN-seq28,29). Une approche plus évoluée est le profilage des ribosomes, qui permet d’étudier les positions des ribosomes allongés le long d’une molécule d’ARNm à l’échelle du génome, ainsi que l’inférence de l’efficacité de la traduction à travers le transcriptome et l’utilisation des sites de départ principaux et alternatifs30,31. Le profilage des ribosomes implique l’isolement et le séquençage de fragments d’ARNm protégés par la présence ribosomique sur eux. Le profilage des ribosomes a fourni des informations considérables sur la dynamique de la traduction dans un certain nombre de conditions, y compris le stress hypoxique, le choc thermique et le stress oxydatif31,32. La technique a été adaptée à plusieurs types de matériaux sources, y compris les cellules de levure et de mammifères.
Alors que le profilage des polysomes et des ribosomes a été fondamental dans l’extension des capacités de la recherche en traduction, le processus de traduction comprend divers intermédiaires et complexes translationnels qui sont difficiles à capturer avec ces méthodes11,13. Une limitation supplémentaire provient du manque de capacité à étudier les types de réponse rapide, car les complexes translationnels sont soit stabilisés in vivo par l’ajout d’inhibiteurs de traduction spécifiques (antibiotiques), conduisant à certains artefacts de distribution des ribosomes, soit ex vivo lors de la lyse cellulaire spécifiquement (antibiotiques) ou de manière non spécifique (ions sel ou magnésium élevés), conduisant à la privation des intermédiaires à vie plus courte ou moins stables33, 34,35.
Le formaldéhyde est largement utilisé pour réticuler les acides nucléiques et les protéines, comme dans les études d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et d’immunoprécipitation réticulative (CLIP). Sa petite taille et son excellente perméabilité cellulaire permettent une action in vivo rapide36. Sur la base de la réticulation rapide du formaldéhyde, l’approche de profilage des ribosomes a été étendue avec le séquençage de profil complexe de traduction (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, d’abord développé en levure, permet la capture de tous les intermédiaires de traduction, y compris les complexes SSU à balayage ou post-terminaison et les configurations ribosomiquesmultiples37,38,41,42. La méthode a été utilisée dans plusieurs études10,38,39,41,42, dont certaines utilisent une approche combinatoire des inhibiteurs de traduction et de la réticulation du formaldéhyde pour faciliter l’arrêt de la traduction. Une autre version modifiée de la technique, tcp-seq39sélectif, a récemment été utilisée pour inclure l’immunopurification des complexes réticulés, élargissant ainsi la portée des applications TCP-seq. La nature rapide, efficace et réversible de la réticulation du formaldéhyde rend ces approches adaptées à l’étude des interactions complexes transitoires ARNm:traduction, en particulier dans le contexte de voies de réponse très dynamiques au niveau de la traduction.
Nous détaillons ici les processus de réticulation in vivo du formaldéhyde dans le but d’une stabilisation et d’un isolement complexes de traduction complète. Nous fournissons des protocoles distincts nuancés pour les cellules de levure et de mammifère(Figure 1). Nous décrivons également des exemples d’utilisation ultérieure du matériau stabilisé par réticulation(figure 1),par exemple pour la détection du facteur protéique co-purifié à l’aide de l’immunobuvardage (Western-blotting), de la purification immuno-assistée (ou « immunoprécipitation »; IP) et l’enrichissement de complexes translationnels contenant des facteurs d’intérêt spécifiques, la microscopie électronique et le séquençage de l’ARN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> Figure 1: Schéma illustrant une vue d’ensemble de la configuration expérimentale typique. Les principales étapes de la stabilisation in vivo du formaldéhyde des complexes translationnels sont représentées sous la forme d’un organigramme, complété par des informations sur les principaux instruments nécessaires. Les applications potentielles en aval du matériau réticulé sont décrites, y compris des exemples qui ont été utilisés avec succès mais qui ne sont pas directement couverts par ce protocole, tels que la purification de l’ARN par billes SPRI, le séquençage de l’ARN et la spectrométrie de masse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

Les réponses rapides impliquant une redistribution rapide de l’ARN messager (m) et des altérations de la traduction de l’ARNm sont pertinentes pour les ajustements homéostatiques en cours des cellules. Ces ajustements sont essentiels à la survie des cellules eucaryotes et au « contrôle des dommages » lors de la fluctuation des niveaux de nutriments et de salinité, de la température et de divers stress chimiques et radiologiques. En raison de la nature très dynamique des réponses au niveau de l’ARN et de l’instabilité de nombreux intermédiaires ARN:ARN et ARN:protéine, l’obtention d’un instantané significatif de l’état de l’ARN cytoplasmique n’est possible qu’avec un nombre limité de méthodes. Les expériences de profilage de ribosomes à l’échelle du transcriptome et basées sur l’ARN sont parmi les sources de données les plus informatives pour le contrôle de la traduction. Cependant, l’absence d’une stabilisation intermédiaire uniforme de l’ARN et de l’ARN:protéine peut entraîner différents biais, en particulier dans les voies de réponse cellulaire au rythme rapide. Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé de fixation rapide applicable aux cellules eucaryotes de perméabilité différente, pour aider à la stabilisation intermédiaire de l’ARN et de l’ARN: protéine. Nous fournissons également des exemples d’isolement des complexes ARN:protéine stabilisés en fonction de leur co-sédimentation avec des fractions ribosomiques et poly(ribo)somales. Le matériau stabilisé séparé peut ensuite être utilisé dans le cadre d’expériences de type profilage de ribosomes, telles que l’approche de séquençage de profils complexes de traduction (TCP-seq) et ses dérivés. La polyvalence des méthodes de style TCP-seq a maintenant été démontrée par les applications dans une variété d’organismes et de types de cellules. Les complexes stabilisés peuvent également être purifiés par affinité et imagés à l’aide de la microscopie électronique, séparés en différentes fractions poly(ribo)somales et soumis au séquençage de l’ARN, en raison de la facilité de l’inversion de la réticulation. Par conséquent, les méthodes basées sur le refroidissement instantané et la fixation du formaldéhyde, suivies de l’enrichissement à base de sédimentation ou d’un autre type d’enrichissement du complexe ARN:protéine, peuvent être particulièrement intéressantes pour étudier les détails plus fins de la dynamique rapide du complexe ARN:protéine dans les cellules vivantes.

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Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Nous présentons une technique pour stabiliser rapidement les complexes translationnels (biosynthèse des protéines) avec réticulation du formaldéhyde dans les cellules de levures et de mammifères vivantes. L’approche permet de disséquer les intermédiaires transitoires et les interactions dynamiques ARN:protéine. Les complexes réticulés peuvent être utilisés dans de multiples applications en aval telles que les méthodes de profilage basées sur le séquençage en profondeur, la microscopie et la spectrométrie de masse.

Fixation et isolement rapides in vivo de complexes translationnels à partir de cellules eucaryotes

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Le flux de travail consiste à cultiver des cellules dans des conditions environnementales strictement contrôlées, à les refroidir rapidement à l’aide d’eau de fonte / glace et à les fixer avec une concentration pré-optimisée de formaldéhyde et un temps d’incubation. La réaction de fixation est ensuite éteinte en utilisant un excès de composés contenant des groupes aminés primaires, tels que la glycine ou les tryps. Les cellules sont collectées, lavées et peuvent être conservées congelées.Les cellules fixes peuvent être lysées mécaniquement ou chimiquement, et le lysat est utilisé pour la séparation des fractions ribosomiques en fonction de leur taille moléculaire, de leurs propriétés de sédimentation ou de leurs marqueurs d’affinité. L’approche aboutit à un matériau polyvalent utilisable pour la purification et la détection immuno-assistées, l’enrichissement de complexes contenant des facteurs spécifiques en microscopie électronique. Lors d’un blocage profond réticulé, d’analyses basées sur l’amplification ou l’hybridation de l’ARN, le séquençage de l’ARN et la spectrométrie de masse deviennent possibles.Installez une culture de levure d’un litre dans un agitateur orbital avec une densité optique de départ ne dépassant pas 0,05 unité d’absorbance à 600 nanomètres et utilisez des milieux de peptone et de dextrose à 30 degrés Celsius. Installez une centrifugeuse préparative avec des bouteilles de rotor et de centrifugeuse compatibles pour granuler la suspension liquide des cellules de levure à 5000 G à quatre degrés Celsius. Gardez une trace de la densité optique des cellules en croissance.Il doit être compris entre 0,6 et 0,8 unité d’absorbance et 600 nanomètres au moment de la collecte si la phase de croissance exponentielle présente un intérêt. Une fois que les cellules sont prêtes, installez une glacière à l’intérieur de la hotte chimique avec un boulanger contenant 250 grammes de glace d’eau pilée propre et montrez-vous également 25 millilitres de trypsine et une solution de formaldéhyde stabilisée à 37% de méthanol fraîchement achetée à l’intérieur de la hotte. Versez la dernière culture cellulaire dans le boulanger contenant la glace.Ajouter ensuite 75 millilitres de formaldéhyde à 37% à une concentration finale de 2,2% de poids sur le volume remuer intensément le mélange jusqu’à ce que la glace fonde. Une fois la glace fondue, installez une minuterie pendant 10 minutes Après l’incubation pendant 10 minutes, transférez la culture dans les bouteilles de centrifugeuse pré-refroidies et abattez les cellules par centrifugation à quatre degrés Celsius, 5000 G pendant cinq minutes. Pendant que le spin est, sur pré-refroidir un tube de 50 millilitres et garder le tampon A fraîchement préparé contenant de la glycine pour neutraliser tout formaldéhyde restant sur la glace.Après la centrifugation, placez les tubes de centrifugeuse sur de la glace avec le côté granulé en contact avec la glace. Apportez les tubes dans la hotte et jetez le surnageant dans un conteneur à déchets de formaldéhyde. Remettez en suspension la pastille de cellule à partir de vieux tubes dans 20 millilitres de tampon A à l’aide d’une bandelette de 25 millilitres et transférez-la dans un tube de 50 millilitres.Porter le volume à 40 millilitres avec le tampon A et prélever les cellules de lavage par centrifugation de quatre degrés Celsius, 5000 G pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez-la en suspension dans le tampon A one de 40 millilitres, qui est un tampon A ne contenant pas de glycine pour éliminer la contamination par la glycine. Abattez à nouveau les cellules par centrifugation à quatre degrés Celsius, 5000 G cinq minutes.Répétez les lavages avec le tampon A une fois de plus. Jetez le surnageant et placez la pastille de cellule sur de la glace. Pesez le tube avec la pastille, la masse cellulaire humide doit être d’environ un gramme par litre de culture cellulaire.Remplissez le polystyrène de la boîte recouverte de papier d’aluminium avec de l’azote liquide jusqu’à une profondeur d’environ trois centimètres. Placer à 50 millilitres de tube à la verticale dans la boîte. Re-suspendez la pastille dans 550 microlitres de tampon A deux par pipetage et vortex pendant 10 secondes.Ajouter 10 microlitres de 40 unités par microlitre inhibiteur de la RNase et vortex à nouveau pendant 10 secondes. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, égoutter la suspension cellulaire dans les deux millilitres de 50 millilitres contenant l’azote liquide. Pour vous préparer à l’étape suivante, pré-refroidissez des tubes sans noyau de 1,5 millilitre sur de la glace carbonique et des pots de broyage en acier inoxydable de 10 millilitres.Transférez les gouttelettes de suspension cellulaire congelées dans les bocaux à l’aide d’une spatule stérile propre. Immergez les pots de broyage dans de l’azote liquide pendant une minute, en vous assurant que la phase liquide reste au-dessus de la jonction. Installez un mélangeur Cryo à 27 Hertz pour l’agitation pendant une minute.Agiter les pots de broyage scellés à 27 Hertz pendant une minute dans le broyeur mélangeur. Refroidir à nouveau les pots dans de l’azote liquide comme auparavant et agiter encore une minute. Transférez les pots dans la glacière contenant de la glace carbonique avec les tubes sans noyau de 1,5 millilitre.À l’aide d’une petite spatule en acier, transférez les résultats de la date de broyage rembourrée dans les tubes. Ensuite, stockez les tubes à moins 80 degrés Celsius. Dans deux flacons T175, on développe 293 cellules HEK jusqu’à une confluence de 60 à 70 % et le milieu Eagle modifié de Dalbeko et le sérum bovin fœtal à 37 degrés et 5 % de dioxyde de carbone.Au moins trois heures avant le temps de fixation souhaité, remplacez le support de la fiole T175 par précisément 30 millilitres de support complet préchauffé. Préparez une glacière à ras bord avec de la glace d’eau pilée et conservez-la dans la hotte avec les tampons nécessaires, ainsi qu’une glace. Pour refroidir les cellules, retirez la fiole T175 de l’incubateur et appuyez-la formellement contre la glace pour assurer un contact maximal avec la surface.À l’intérieur d’une hotte à fumée chimique, inclinez la fiole sur le côté afin que le milieu s’accumule sur le côté opposé aux cellules. Pipette 168 microlitres de 37% pesés en volume de formaldéhyde directement dans le milieu groupé. Donner une concentration finale de 0,2% de formaldéhyde.Mélangez immédiatement. Incuber les flacons sur de la glace pendant 10 minutes de plus. Versez le milieu dans un récipient à déchets approprié à travers le côté de la fiole opposé aux cellules.À l’aide d’un strippete, pipette dans 30 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dalbeko sans ions calcium et magnésium et contenant en outre doucement 50 millimolaires de glycine sur le côté opposé aux cellules. Mélanger en berçant la fiole, remettre le flash en position horizontale et incuber pendant 10 minutes de plus sur la glace. Verser la solution à travers le côté de la fiole opposé à la cellule et ajouter doucement sept millilitres de solution standard d’EDTA de trypsine à 0,25% pour détacher et suspendre à nouveau les cellules.Incuber la fiole à température ambiante pendant cinq minutes au maximum 10 minutes. Localisez la fiole verticalement et à l’aide d’un strippete, recueillez les cellules détachées en lavant doucement tout ce qui reste des parois de la fiole et transférez la suspension dans un tube de 50 millilitres posé sur de la glace. Complétez immédiatement la solution de suspension collectée avec 20 millilitres de support complet et mélangez en retournant doucement le tube.Abattez les cellules en centrifugant le tube à 100 G pendant cinq minutes et quatre degrés Celsius. La pastille de cellule doit être clairement visible. Versez le support et remettez doucement la pastille dans 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dalbeko sans glycine.Centrifuger à nouveau le tube à 100 G pendant cinq minutes et à quatre degrés Celsius Verser le tampon de lavage et suspendre à nouveau la pastille dans 800 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dalbeko glacée sans glycine, mais contenant des ions magnésium et calcium. Transférer les cellules en suspension dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre à faible teneur en protéines. Centrifuger le tube à 100 G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.Jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’un millilitre pipetter. À ce stade, la pastille cellulaire peut être congelée à moins 80 degrés Celsius ou passer à l’étape de lyse cellulaire. Dans une armoire de biosécurité, ajoutez 300 microlitres de tampon de lyse à base de détergent non ionique et non dénaturant, et sept microlitres d’inhibiteur de l’arginase et mélangez bien en pipetant à l’aide d’une pointe d’un millilitre.Fixez soigneusement une aiguille de calibre 25 à une seringue d’un à trois millilitres et pipetez vigoureusement le mélange en utilisant au moins sept prises lentes vers le haut et des courses d’échappement rapides vers le bas. Jetez la seringue et l’aiguille dans le bac de l’aiguillon et répétez la procédure avec une aiguille de calibre 31 et une seringue de 0,3 millilitre. Jetez la seringue et l’aiguille dans le bac de l’objets tranchants.Centrifuger le tube à 12 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés pour éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre à faible teneur en protéines. Stockez les débris cellulaires et le lysat à moins 80 degrés Celsius.Les complexes translationnels sont sensibles à la composition ionique des tampons. L’omission du chlorure de magnésium et l’ajout d’EDTA ont abrogé les propriétés de sédimentation élevées, et bien que le chlorure de calcium ait entraîné de meilleurs pics de résultat, l’amélioration était marginale. Nous avons donc choisi le tampon un.Le formaldéhyde de 2,2 % masse par volume a parfaitement préservé les polysomes et n’a pas diminué le rendement global par rapport au formaldéhyde de 4 % poids par volume. Dans les cellules de mammifères, une concentration beaucoup plus faible de formaldéhyde de 0,2% poids par volume a été utilisée. Comme des concentrations plus élevées ont entraîné une perte substantielle de matière polyribosomale.15 millimolaires d’EDTA ajoutés au lysat et tous les tampons ultérieurs ont montré un effet déstabilisateur nettement moindre sur les fractions polysomiques, dérivées des cellules fixes. Et cet effet a été partiellement répliqué avec de l’EDTA de 50 millimolaires avec un matériau provenant de cellules fixes à 4%, résistant, se déployant mieux. L’épuisement du glucose provoque l’un des effets inhibiteurs translationnels les plus spectaculaires et les plus rapides sur la levure.Le désassemblage des polysomes induit par les conditions ajoutées au nerf et les conditions de cause locale étaient légèrement, mais évidemment plus de polysomes conservés dans le glucose faiblement ajouté. Il est important de noter que le matériau polysomique des cellules fixes démontre une grande distinction entre les cellules affamées et non affamées, ce qui indique l’adéquation de la fixation du formaldéhyde pour préserver les différences dans les processus translationnels dynamiques. Dans des approches telles que tacy paysake, il peut être également judicieux d’éliminer les petites sous-unités ribosomiques qui ne co-se déposent pas bien avec les rhizomes complets pour lesquels nous avons utilisé une ultracentrifugation en deux étapes, permettant l’isolement des diazomes résistants SSU, LSU, RS, RNase, DS et polysomes d’ordre élevé confirmés par microscopie électronique des fractions fixes.Par rapport aux cellules non fixes, le matériau des cellules fixes a démontré une présence élevée d’eIF4A labile dans les fractions ribosomiques sédimentantes les plus rapides. En utilisant un matériau fixe de la souche eIF4A tapi pour capturer et enrichir les complexes contenant de l’eIF4A avec des billes magnétiques IDG, nous avons pu observer un enrichissement sélectif de l’eIF4A par rapport à la bêta-actine dans SSU et RS, mais pas les fractions LSU du deuxième gradient lors du démontage RNase one. Par rapport à d’autres méthodes de repos translationnel, la rapidité de l’action du formaldéhyde à travers les membranes cellulaires et la nature aveugle des liaisons croisées promettent la préservation de la diversité maximale des intermédiaires complexes de traduction.Nos résultats conforment à la facilité d’utilisation de la fixation rapide du formaldéhyde pour stabiliser les complexes hautement transitoires et démontrent l’utilité dans les scénarios de réponses cellulaires rapides aux changements environnementaux ou aux conditions de stress.

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Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Unit 1

Translation: RNA to Protein

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