Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
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Diese Arbeit wurde durch den Australian Research Council Discovery Project Grant (DP180100111 an T.P. und N.E.S.), den National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 an N.E.S.) und das Research Fellowship (APP1135928 an T.P.) unterstützt. Die Autoren würdigen die Einrichtungen von Microscopy Australia am Centre for Advanced Microscopy der Australian National University, einer Einrichtung, die von der Universität und der Bundesregierung finanziert wird.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die Formaldehydfixierung ist eine bequeme und beliebte Methode, um eine schnelle In-vivo-Vernetzung der Biomoleküle10,36,45,46,47,48zuerreichen. Im Vergleich zu den anderen potenziellen Biomolekül-Targets erfordert die erfolgreiche Erfassung translationaler Komplexe eine sofortige Fixierung während des Snap-Chillings der Zellen oder anderer Materialien. Ohne die unverschichtete Stabilisierung besteht die Möglichkeit, dass verschiedene translationsbezogene Prozesse fortgesetzt werden, wodurch die komplexe Verteilung vom unbeirrten In-vivo-Zustand weg verlagert wird49. Im Vergleich zu den anderen Methoden des translationalen Stillstands und der ribosomalen Komplexstabilisierung versprechen die Schnelligkeit der Formaldehydwirkung über die Zellmembranen und die wahllose Natur der Vernetzung die Erhaltung der maximalen Vielfalt der Intermediäre des Translationskomplexes näher an ihren nativ verteiltenZuständen 50.
Der hier vorgestellte Ansatz wurde sowohl in Hefe- als auch in Säugetierzellen etabliert und optimiert, und es wurden nun Methoden von anderen Gruppen für den Einsatz in vielfältigerem biologischem Material abgeleitet, z. B. in ganzen Wirbeltieren (z. B. Zebrafischembryonen)10,38,39,49,51,52 . Obwohl diese Arbeiten zusammen die Vielseitigkeit und breite Anwendbarkeit des Ansatzes gewährleisten, kann die schnelle Formaldehydvernetzung translationaler Komplexe aufgrund der Notwendigkeit von Optimierungen und Anpassungen als etwas schwierig zu transponieren auf neue Arten von biologischem Material angesehen werden.
Eine wesentliche Voraussetzung für den Erfolg der Methode ist die Re-Optimierung der Konzentration des Formaldehyds und der Zellsammel- und -aufschlusstechnik. Weniger durchlässige, kleine und runde Hefezellen erfordern eine viel höhere (mindestens 10-fache) Formaldehydkonzentration und physikalische Störung der fixierten Zellen. Im Gegensatz dazu können große und abgeflachte anhaftende Säugetierzellen in Kultur leicht überfixiert werden und erfordern bei der Fixierung eine schonende Handhabung, während die Extraktion der fixierten Komplexe chemisch mit Membranaufschluss unter Verwendung von Reinigungsmitteln erfolgen kann. Eine Untervernetzung kann es weniger stabilen oder kurzlebigen Zwischenprodukten ermöglichen, sich zu dissoziieren oder in einen späteren Zustand zu gelangen. Eine Übervernetzung kann die Fähigkeit, ribosomale Fraktionen zu isolieren und zu untersuchen, negativ beeinflussen und selektive Verzerrungen wie eine tiefere Erschöpfung schwerer Komplexe erzeugen. In unserer Beobachtung können selbst geringfügige Veränderungen, wie die Art der verwendeten adhärenten menschlichen Zellen, die Ausbeute der wiederhergestellten vernetzten Komplexe beeinflussen und eine erneute Optimierung des Vernetzungsschemas erfordern. Wir können auch davon ausgehen, dass Zellen mit wesentlich unterschiedlichen Permeabilitätseigenschaften, wie z.B. Pflanzenzellen, eine zusätzliche umfangreiche Optimierung der Fixierungsbedingungen erfordern52. Es ist jedoch schwierig, sich eine Art von biologischem Material vorzustellen, das mit dem Ansatz völlig unvereinbar wäre.
Eine Überlegung, die für das Säugetier-Fixierungsprotokoll relevant ist, ist die Dichte und Menge des Zellmaterials, das als Input verwendet wird. Es wird empfohlen, die Zellen mindestens 2 Tage lang kontinuierlich ohne erneutes Aussäen oder andere Störungen wachsen zu lassen, um äußere Einflüsse auf die zelluläre Translationsdynamik zu vermeiden. Anwendbar für die meisten Zelltypen, aber für die Mehrheit der adhärenten Zellen, die konsistent Konfluenzniveaus von nicht mehr als 70% erreicht werden, wird sichergestellt, dass keine größeren Kontakthemmungseffekte auftreten, die sich negativ und unvorhersehbar auf die Translationsraten auswirken können.
Ein weiteres interessantes und potenziell einzigartig praktisches Merkmal der Formaldehydfixierung, das sich aus ihrer wahllosen Reaktivität ergibt, ist der stabilisierende Effekt auf translationale Komplexe in Systemen gemischter Taxonomie. Bakterielle und noch mehr translationale Komplexe von Mitochondrien, Chloroplasten und verschiedenen intrazellulären Parasiten waren bekanntermaßen schwer mit spezifischen Translationsinhibitoren zu bekämpfen. Im Gegensatz dazu sind in den TCP-seq-Daten Footprints, die dem Mitotranskriptom zugeordnet sind, in den Daten38,39,50leicht beobachtbar. Eine interessante spätere Entwicklung könnte die Verwendung des Ansatzes zur Untersuchung der Translation in ganzen Mikrogemeinschaften sein, wie in Boden-, Wasser- oder Darmproben, wo ein zuverlässiger schneller translationaler Stillstand und eine komplexe Stabilisierung mit anderen Mitteln problematisch wären.
Es sollte auch erwähnt werden, dass für das komplizierteste Material (wie hartes und / oder sperriges Gewebe) nichts die Verwendung einer Formaldehydstabilisierung unmittelbar nach Zellaufschluss und Materialhomogenisierung verhindert. Dieser Ansatz wird bereits häufig eingesetzt, um die Zelleintrittsverzögerung bei der Stabilisierung translationaler Komplexe mit spezifischen niedermolekularen Inhibitoren33,53,54,55zubeseitigen. Angesichts der Tatsache, dass die Formaldehydfixierung traditionell mit hervorragenden Ergebnissen für die Ex-vivo/In-vitro-Probenstabilisierung in Anwendungen wie der Elektronenmikroskopie45,56,57,58verwendet wurde, können wir in diesem Fall noch weniger negative Effekte erwarten, insbesondere solche, die mit der schlechten Extraktion der translationalen Komplexe aus den gründlich fixierten Zellen verbunden sind.
Unsere Ergebnisse bestätigen die Verwendbarkeit der schnellen Formaldehydfixierung zur Stabilisierung hochtransienter Komplexe, wie sie eIF4A enthalten. Bemerkenswert ist, dass Hefe eIF4A im Gegensatz zu Säugetieren viel schwächer mit dem Kappenbindungskomplex eIF4F und damit mit translationalen Komplexen im Allgemeinen assoziiert ist. eIF4A geht in der Regel bei einer umfangreichen Reinigung des ribosomalen Materials in Hefe29,59,60,61,62,63 verloren. Im in vivo-Fixhefematerial ist es jedoch möglich, eine zuverlässige Anreicherung von eIF4A in allen Fraktionen translationaler Komplexe zu erreichen, bei denen sein Vorhandensein erwartet würde. Die zuvor veröffentlichten Sel-TCP-seq-Daten haben die Anreicherung von eIF2 und eIF3 gezeigt, die stärker mit den Ribosomen assoziiert sind (aber auch eine vorübergehend auftretende co-translationale Proteinkomplex-Assemblierung zeigten)39. Somit eignet sich das Verfahren zum Nachweis sowohl stärkerer als auch schwächerer anhaftender Bestandteile der translationalen Komplexe.
Zusammenfassend haben wir einen Ansatz vorgestellt, der nützlich ist, um in erster Linie Einblicke in die Veränderungen zu gewinnen, die in der Initiationsphase der Translation auftreten und wann eine minimal gestörte ribosomale Verteilung über die mRNA erforderlich ist. Wichtig ist, dass der Ansatz für die Stabilisierung von relativ labilen und dynamischen Komponenten translationaler Komplexe wie eIF4A geeignet ist und breit eingesetzt werden kann, um den notwendigen Optimierungen unterzogen zu werden. Wir haben auch Beweise für die Nützlichkeit der Formaldehydfixierung in den Szenarien einer schnellen dynamischen Veränderung der Translation erbracht, die Untersuchungsbereiche wie schnelllebige zelluläre Reaktionen auf Umweltveränderungen oder Stressbedingungen eröffnen.

Lebende Organismen unterliegen über ihre Lebensspanne dynamischen intra- und extrazellulären Veränderungen, die schnelle Reaktionen erfordern, um die Homöostase aufrechtzuerhalten und das Überleben zu sichern. Um die Anpassung an die Umwelt zu ermöglichen, passen eukaryotische Zellen ihren Stoffwechsel über die Genexpressionskontrolle an. Die Kontrolle der Genexpression kann während der Transkription und/oder Translation ausgeübt werden; wobei translationale Antworten im Allgemeinen schneller auftreten1,2,3,4. Zum Beispiel treten translationale Veränderungen typischerweise innerhalb von 1-30 Minuten nach Beginn des Stresses auf, während Veränderungen auf Transkriptionsebene Stunden nach der Stressexpositionfolgen 3,4,5. Veränderungen der Translationsleistung werden aufgrund der anhaltenden Verfügbarkeit von Boten(m)RNA-Molekülen im Zytoplasma schneller erreicht. Umgekehrt müssen auf der Transkriptionsebene neue mRNA-Moleküle synthetisiert und in Eukaryoten verarbeitet und aus dem Kern exportiert werden, was zu erheblichen Verzögerungen in der Reaktionszeitführt 2,4,6,7,8.
Akute translationale Reaktion auf Stress ist im Allgemeinen durch eine allgemeine Abnahme der Translationsleistung gekennzeichnet, wobei die selektive Hochregulierung von Proteinen für das Zellüberleben notwendig ist1,3,4,9. Es wird angenommen, dass die Verringerung der Proteinproduktion aufgrund des hohen Energieaufwands des Prozesses entscheidend ist3,7. Um die selektive Hemmung und Hochregulierung zu erleichtern, werden translationale Reaktionen durch eine Reihe komplexer Regulationsmechanismen bedient. Regulation kann über alle Phasen der Translation ausgeübt werden: Initiierung, Dehnung, Beendigung der Polypeptid-Biosynthese und ribosomales Recycling10,11,12,13, zeigt sich aber am stärksten in der Initiationsphase5,7,9,10,13. Während der Initiierung bindet die kleine ribosomale Untereinheit (SSU), unterstützt durch eukaryotische Initiationsfaktoren (eIFs), an die 5' untranslatierte Region (UTR) der mRNA und scannt sie, bis ein Startcodon erkannt wird2,5,6,8,11,12,13. Regulierungsmechanismen zielen häufig auf eIFs ab, die das Anhängen, Scannen und starten die Codonerkennung beeinflussen. Zum Beispiel der Initiationsfaktor eIF2, ein wesentlicher Translationsfaktor, der bei der Rekrutierung einer Initiator-Met-tRNA hilftiMet zur SSU, wird oft bei Eukaryoten unter Stressbedingungen ins Visier genommen4,6,11. In Hefe kann die Phosphorylierung dieses Faktors unter Nährstoffentzug und osmotischem Stress induziert werden1,4,11,14,15, und in Säugetierzellen können Aminosäuremangel, endoplasmatischer Retikulum (ER) -Stress, UV-Stress, Virusinfektion und veränderte Sauerstoffwerte diese Reaktion auslösen8,9,11. Die schnelle Hochregulierung der spezifischen mRNA-Translation zeigt sich in der Reaktion der Säugetierzellen auf Hypoxie, die eine globale schnelle Translationshemmung und selektive Hochregulierung der Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIFs) Biosynthese aufweist. HIFs sind Transkriptionsfaktoren, die dann eine längerfristige zelluläre Reprogrammierung auf der DNA-Transkriptionsebene auslösen8,9,16. Ähnliche Reaktionen wurden in Hefe unter Hitzestress beobachtet, mit schneller translationaler Expression von Hitzeschockproteinen (HSPs), gefolgt von verzögerten Reaktionen auf Transkriptionsebene.17,18. Zusätzlich zu Nährstoffentzug und Hitzeschock wurden translationale Reaktionen in Hefe unter unterschiedlichem Sauerstoff untersucht.8,19Salzgehalt5, Phosphat, Schwefel20,21 und Stickstoff22,23 Stufen. Diese Forschung hat weitreichende Auswirkungen auf die industrielle Verwendung von Hefe, wie Backen und Fermentieren24,25. Translationale Reaktionen können auch dazu beitragen, das Verständnis von Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen und Herzerkrankungen zu fördern, die durch intrazelluläre Belastungen wie oxidativen Stress gekennzeichnet sind. Insgesamt sind translationale Reaktionen integraler Bestandteil der Genexpressionskontrolle und ermöglichen eine schnelle Anpassung an ein breites Spektrum von Stressbedingungen in eukaryotischen Organismen.
Um translationale Antworten zu untersuchen, sind Methoden erforderlich, die minimal verzerrte Momentaufnahmen der Übersetzungslandschaft liefern. Polysomenprofilierung ist ein klassischer Ansatz, der bei der Untersuchung der Translation über mRNA verwendet wird, bei dem poly(ribo)somale Anteile von mRNA durch Ultrazentrifugation durch Saccharosegradienten getrennt werden26,27. Der Ansatz kann verwendet werden, um Translationsniveaus für einzelne mRNAs (mit den Nachweismethoden wie Reverse Transkription und Polymerase-Kettenreaktion, RT-PCR26) oder global in Verbindung mit Hochdurchsatztechniken (Microarray oder RNA-seq28,29) zu untersuchen. Ein weiterentwickelter Ansatz ist das Ribosomen-Profiling, das die Untersuchung von Positionen länglicher Ribosomen entlang eines mRNA-Moleküls auf genomweiter Skala sowie die Rückschlüsse auf die Effizienz der Translation über Transkriptome und die Nutzung der Haupt- und alternativen Startstellenermöglicht 30,31. Das Ribosomen-Profiling beinhaltet die Isolierung und Sequenzierung von mRNA-Fragmenten, die durch ribosomale Präsenz geschützt sind. Die Ribosomenprofilierung hat einen beträchtlichen Einblick in die Translationsdynamik unter einer Reihe von Bedingungen gegeben, darunter hypoxischer Stress, Hitzeschock und oxidativer Stress31,32. Die Technik wurde an mehrere Quellmaterialtypen angepasst, darunter Hefe- und Säugetierzellen.
Während polysomen- und ribosomenprofilierung grundlegend für die Erweiterung der Fähigkeiten der Translationsforschung waren, umfasst der Prozess der Translation verschiedene translationale Zwischenprodukte und Komplexe, die mit diesen Methoden schwer zu erfassen sind11,13. Eine zusätzliche Einschränkung ergibt sich aus der mangelnden Fähigkeit, Schnellreaktionstypen zu untersuchen, da translationale Komplexe entweder in vivo durch zugesetzte spezifische Translationsinhibitoren (Antibiotika) stabilisiert werden, was zu bestimmten Ribosomenverteilungsartefakten führt, oder ex vivo bei Zelllyse spezifisch (Antibiotika) oder unspezifisch (hohe Salz- oder Magnesiumionen), was zum Entzug der kurzlebigen oder weniger stabilen Zwischenprodukte führt33. 34,35.
Formaldehyd wird häufig zur Vernetzung von Nukleinsäuren und Proteinen verwendet, z. B. in Chromatin-Immunpräzipitationsstudien (ChIP) und Crosslinking Immunoprecipitation (CLIP). Seine geringe Größe und ausgezeichnete Zellpermeabilität ermöglichen eine schnelle In-vivo-Aktion 36. Basierend auf der schnellen Formaldehydvernetzung wurde der Ribosomenprofilierungsansatz um das Translation Complex Profile Sequencing (TCP-seq)10,36,37,38,39,40erweitert. TCP-seq, zuerst in Hefe entwickelt, ermöglicht die Erfassung aller Übersetzungszwischenprodukte, einschließlich Scannen oder Post-Termination SSU-Komplexe und mehrere ribosomale Konfigurationen37,38,41,42. Die Methode wurde in mehreren Studienverwendet 10,38,39,41 ,42,von denen einige einen kombinatorischen Ansatz sowohl von Translationsinhibitoren als auch von Formaldehydvernetzung verwenden, um den Stillstand der Translation zu erleichtern. Eine weitere modifizierte Version der Technik, selektives TCP-seq39,wurde kürzlich eingesetzt, um die Immunreinigung der vernetzten Komplexe einzubeziehen und den Umfang der TCP-seq-Anwendungen zu erweitern. Die schnelle, effiziente und reversible Natur der Formaldehydvernetzung macht diese Ansätze geeignet, um transiente mRNA:Translation-Komplex-Interaktionen zu untersuchen, insbesondere im Kontext hochdynamischer Reaktionswege auf Translationsebene.
Hier beschreiben wir die Prozesse der in vivo Formaldehydvernetzung zum Zwecke einer umfassenden Stabilisierung und Isolierung von Translationskomplexen. Wir bieten separate Protokolle, die für Hefe- und Säugetierzellen nuanciert sind (Abbildung 1). Wir skizzieren weiterhin Beispiele für die anschließende Verwendung des vernetzungsstabilisierten Materials (Abbildung 1), wie z.B. für den co-gereinigten Proteinfaktornachweis mittels Immunoblotting (Western-Blotting), immununterstützter Aufreinigung (oder "Immunpräzipitation"; IP) und Anreicherung von translationalen Komplexen mit spezifischen Interessantfaktoren, Elektronenmikroskopie und RNA-Sequenzierung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Überblicks über den typischen Versuchsaufbau. Hauptschritte der in vivo Formaldehydstabilisierung translationaler Komplexe werden als Flussdiagramm dargestellt, ergänzt durch Informationen über die wichtigsten notwendigen Instrumente. Mögliche nachgelagerte Anwendungen des vernetzten Materials werden skizziert, einschließlich Beispiele, die erfolgreich eingesetzt wurden, aber nicht direkt in diesem Protokoll abgedeckt sind, wie z.B. SPRI-Perlenreinigung von RNA, RNA-Sequenzierung und Massenspektrometrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

Schnelle Reaktionen mit schneller Umverteilung von Messenger(m)RNA und Veränderungen der mRNA-Translation sind relevant für die laufende homöostatische Anpassung der Zellen. Diese Anpassungen sind entscheidend für die Überlebensfähigkeit eukaryotischer Zellen und die "Schadenskontrolle" bei schwankenden Nährstoff- und Salzgehaltswerten, Temperaturen und verschiedenen chemischen und Strahlungsbelastungen. Aufgrund der hochdynamischen Natur der RNA-Level-Antworten und der Instabilität vieler RNA:RNA- und RNA:Protein-Zwischenprodukte ist es nur mit einer begrenzten Anzahl von Methoden möglich, eine aussagekräftige Momentaufnahme des zytoplasmatischen RNA-Zustands zu erhalten. Transkriptom-weite, RNA-seq-basierte Ribosom-Profiling-Experimente gehören zu den informativsten Datenquellen für die Kontrolle der Translation. Das Fehlen einer einheitlichen RNA und einer RNA:Protein-Intermediärstabilisierung kann jedoch zu unterschiedlichen Verzerrungen führen, insbesondere in den schnelllebigen zellulären Antwortwegen. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll der schnellen Fixierung zur Verfügung, das auf eukaryotische Zellen unterschiedlicher Permeabilität anwendbar ist, um die Stabilisierung von RNA und RNA:Protein-Intermediär zu unterstützen. Darüber hinaus liefern wir Beispiele für die Isolierung der stabilisierten RNA:Protein-Komplexe basierend auf ihrer Co-Sedimentation mit ribosomalen und poly(ribo)somalen Fraktionen. Das abgetrennte stabilisierte Material kann anschließend als Teil von Ribosomenprofilierungsexperimenten verwendet werden, z. B. im TCP-seq-Ansatz (Translation Complex Profile Sequencing) und seinen Derivaten. Die Vielseitigkeit der Methoden im TCP-seq-Stil wurde nun durch die Anwendungen in einer Vielzahl von Organismen und Zelltypen demonstriert. Die stabilisierten Komplexe können aufgrund der Leichtigkeit der Vernetzungsumkehr auch zusätzlich affinitätsgereinigt und elektronenmikroskopisch abgebildet, in verschiedene poly(ribo)somale Fraktionen getrennt und einer RNA-Sequenzierung unterzogen werden. Daher können Methoden, die auf Snap-Chilling und Formaldehyd-Fixierung basieren, gefolgt von der sedimentationsbasierten oder anderen Art der RNA:Protein-Komplex-Anreicherung, von besonderem Interesse sein, um feinere Details der schnellen RNA:Protein-Komplexdynamik in lebenden Zellen zu untersuchen.

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Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Wir stellen eine Technik zur schnellen Stabilisierung translationaler (Proteinbiosynthese) Komplexe mit Formaldehydvernetzung in lebenden Hefe- und Säugetierzellen vor. Der Ansatz ermöglicht die Sezierung transienter Zwischenprodukte und dynamischer RNA:Protein-Interaktionen. Die vernetzten Komplexe können in mehreren nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, z. B. in Deep-Sequencing-basierten Profilierungsmethoden, Mikroskopie und Massenspektrometrie.

Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Der Workflow besteht darin, Zellen unter streng kontrollierten Umgebungsbedingungen zu züchten, sie mit Schmelzwasser / Eis schnell zu kühlen und mit voroptimierter Konzentration von Formaldehyd und Inkubationszeit zu fixieren. Die Fixierungsreaktion wird dann unter Verwendung eines Überschusses an primären Aminogruppen-haltigen Verbindungen wie Glycin oder Tryps abgeschreckt. Zellen werden gesammelt, gewaschen und können gefroren gelagert werden.Fixierte Zellen können mechanisch oder chemisch lysiert werden, und das Lysat wird zur Trennung der ribosomalen Fraktionen basierend auf ihrer Molekülgröße, Sedimentationseigenschaften oder Affinitätsmarkern verwendet. Der Ansatz führt zu einem vielseitigen Material, das für die immununterstützte Reinigung und Detektion sowie die Anreicherung von Komplexen mit spezifischen Faktoren in der Elektronenmikroskopie verwendet werden kann. Bei vernetzter Tiefenblockierung, RNA-Amplifikation oder hybridisierungsbasierten Analysen, RNA-Sequenzierung und Massenspektrometrie werden möglich.Richten Sie eine Ein-Liter-Hefekultur in einem Orbitalschüttler mit einer optischen Ausgangsdichte von nicht mehr als 0,05 Absorptionseinheiten bei 600 Nanometern ein und verwenden Sie Pepton- und Dextrosemedien bei 30 Grad Celsius. Stellen Sie eine präparative Zentrifuge mit kompatiblem Rotor und Zentrifugenflaschen für die Pelletierung der flüssigen Suspension von Hefezellen bei 5000 G bei vier Grad Celsius auf. Halten Sie die optische Dichte der wachsenden Zellen fest.Sie muss zum Zeitpunkt der Sammlung zwischen 0,6 und 0,8 Absorptionseinheiten und 600 Nanometern liegen, wenn die exponentielle Wachstumsphase von Interesse ist. Sobald die Zellen fertig sind, stellen Sie eine Eisbox im chemischen Abzug mit einem Bäcker auf, der 250 Gramm sauberes Crushed Water Ice enthält, und zeigen Sie Ihnen auch 25 Milliliter Trypsin und frisch gekaufte Methanol stabilisierte 37% Formaldehydlösung in der Haube. Gießen Sie die eine aktuelle Zellkultur in den Bäcker, der das Eis enthält.Dann fügen Sie 75 Milliliter 37% Formaldehyd zu einer Endkonzentration von 2,2% Gewicht über volumen intensiv die Mischung um, bis das Eis schmilzt. Sobald das Eis geschmolzen ist, stellen Sie einen Timer für 10 Minuten auf Nach der Inkubation für 10 Minuten, übertragen Sie die Kultur in die vorgekühlten Zentrifugenflaschen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei vier Grad Celsius, 5000 G für fünf Minuten. Während des Spins ein 50-Milliliter-Röhrchen vorkühlen und frisch vorbereiteten Puffer A mit Glycin aufbewahren, um das verbleibende Formaldehyd auf Eis zu neutralisieren.Nach dem Zentrifugieren die Zentrifugenröhrchen mit der Pelletseite in Kontakt mit dem Eis auf Eis legen. Bringen Sie die Rohre in den Abzug und entsorgen Sie den Überstand in einem Formaldehyd-Abfallbehälter. Suspendieren Sie das Zellpellet aus alten Rohren in 20 Milliliter Puffer A mit einer 25-Milliliter-Stripette und übertragen Sie es in ein 50-Milliliter-Röhrchen.Mit Puffer A das Volumen auf 40 Milliliter auffüllen und die Waschzellen durch Zentrifugation von vier Grad Celsius, 5000 G für fünf Minuten sammeln. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in 40 Milliliter Puffer A eins, der Puffer A ist, der kein Glycin enthält, um Glycinkontamination zu entfernen. Pelletieren Sie die Zellen erneut durch Zentrifugation bei vier Grad Celsius, 5000 G fünf Minuten.Wiederholen Sie die Wäschen mit Puffer A ein, noch einmal. Entsorgen Sie den Überstand und legen Sie das Zellpellet auf Eis. Wiegen Sie das Röhrchen mit dem Pellet, die Nasszellmasse sollte etwa ein Gramm pro Liter der Zellkultur betragen.Füllen Sie Polystyrol aus einer mit Aluminiumfolie ausgekleideten Box mit flüssigem Stickstoff bis zu einer Tiefe von etwa drei Zentimetern. 50 Milliliter Rohr aufrecht in die Box legen. Suspendieren Sie das Pellet in 550 Mikrolitern Puffer A zwei durch Pipettieren und Wirbeln für 10 Sekunden.Fügen Sie 10 Mikroliter à 40 Einheiten pro Mikroliter RNase-Inhibitor hinzu und wirbeln Sie erneut für 10 Sekunden. Tropfen Sie mit einer Pipette von einem Milliliter die Zellsuspension in die 50 Milliliter zwei, die den flüssigen Stickstoff enthalten. Um sich auf den nächsten Schritt vorzubereiten, kühlen Sie 1,5 Milliliter kernfreie Rohre auf Trockeneis und 10 Milliliter Edelstahl-Mahlgläser vor.Die gefrorenen Zellsuspensionströpfchen mit einem sauberen sterilen Spatel in die Gläser geben. Tauchen Sie die Mahlgläser für eine Minute in flüssigen Stickstoff ein, um sicherzustellen, dass die flüssige Phase über der Verbindung bleibt. Richten Sie eine Kryo-Mischmühle bei 27 Hertz für das Rühren für eine Minute ein.Rühren Sie die versiegelten Mahlgläser bei 27 Hertz für eine Minute in der Mischermühle. Kühlen Sie die Gläser wie bisher in flüssigem Stickstoff ab und schütteln Sie sie eine Minute weiter. Geben Sie die Gläser zusammen mit den 1,5 Milliliter kernfreien Röhren in die Eisbox mit Trockeneis.Mit einem kleinen Stahlspatel übertragen Sie die Ergebnisse im gepolsterten Schleifdatum in die Rohre. Dann lagern Sie die Röhren bei minus 80 Grad Celsius. In zwei T175-Kolben wachsen HEK 293-Zellen zu 60 bis 70% Konfluenz und Dalbekos modifiziertes Eagle-Medium und 10% fötales Rinderserum bei 37 Grad und 5% Kohlendioxid.Ersetzen Sie das Medium des T175-Kolbens mindestens drei Stunden vor der gewünschten Fixierzeit durch exakt 30 Milliliter vorgewärmtes Komplettmedium. Bereiten Sie eine Eisbox bis zum Rand mit zerstoßenem Wassereis vor und bewahren Sie sie zusammen mit den erforderlichen Puffern, ebenfalls einem Eis, im Abzug auf. Um die Zellen zu kühlen, entfernen Sie den T175-Kolben aus dem Inkubator und drücken Sie ihn formell gegen das Eis, um maximalen Oberflächenkontakt zu gewährleisten.Kippen Sie den Kolben in einem chemischen Abzug auf die Seite, so dass sich das Medium auf der den Zellen gegenüberliegenden Seite sammelt. 168 Mikroliter von 37 Vol.-% Formaldehyd direkt in das gepoolte Medium pipettieren. Ergibt eine Endkonzentration von 0,2% Formaldehyd.Sofort mischen. Die Kolben für weitere 10 Minuten auf Eis inkubieren. Gießen Sie das Medium in einen geeigneten Abfallbehälter durch die Kolbenseite gegenüber den Zellen.Mit einem 30 Milliliter Dalbekos phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium- und Magnesiumionen pipettieren und zusätzlich 50 Millimolar Glycin schonend auf der den Zellen gegenüberliegenden Seite enthalten. Mischen Sie durch Schaukeln des Kolbens, bringen Sie den Blitz in die horizontale Position zurück und inkubieren Sie für weitere 10 Minuten auf dem Eis. Gießen Sie die Lösung durch die Kolbenseite gegenüber der Zelle ab und fügen Sie vorsichtig sieben Milliliter der Standard-0,25% Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um die Zellen zu lösen und wieder zu suspendieren.Den Kolben bei Raumtemperatur fünf, maximal 10 Minuten inkubieren. Positionieren Sie den Kolben senkrecht und mit einer Abisolierung, sammeln Sie die abgetrennten Zellen, indem Sie vorsichtig alle verbleibenden von den Kolbenwänden waschen und die Suspension in ein 50-Milliliter-Rohr auf Eis geben. Die gesammelte Suspensionslösung sofort mit 20 Millilitern kompletter Medien ergänzen und durch vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens mischen.Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie das Röhrchen bei 100 G für fünf Minuten und vier Grad Celsius zentrifugieren. Zellpellets müssen gut sichtbar sein. Gießen Sie das Medium ab und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 10 Millilitern der phosphatgepufferten Kochsalzlösung von Dalbeko ohne Glycin.Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut bei 100 G für fünf Minuten und bei vier Grad Celsius Gießen Sie den Waschpuffer ab und suspendieren Sie das Pellet in 800 Mikroliter eiskalter Dalbekos phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Glycin, aber mit Magnesium- und Calciumionen. Übertragen Sie die respondierten Zellen in ein neues proteinarmes 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 100 G für drei Minuten bei vier Grad Celsius.Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einem Milliliter-Pipetter. In diesem Stadium kann das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius eingefroren werden oder zum Zelllyseschritt übergehen. In einer Biosicherheitswerkbank werden 300 Mikroliter Lysepuffer auf Der Basis von nichtionischem, nicht denaturierendem Reinigungsmittel und sieben Mikroliter Arginaseinhibitor hinzugefügt und durch Pipettieren mit einer Milliliterspitze gut gemischt.Befestigen Sie vorsichtig eine 25-Gauge-Nadel an einer Ein- bis Drei-Milliliter-Spritze und pipettieren Sie die Mischung kräftig mit mindestens sieben langsamen Aufwärtseinlass- und schnellen Abwärtsauspuffbewegungen nach unten. Entsorgen Sie die Spritze und die Nadel in den Behälter des Scharfen und wiederholen Sie den Vorgang mit einer 31-Gauge-Nadel und einer 0,3-Milliliter-Spritze. Entsorgen Sie die Spritze und die Nadel in den Behälter des Scharfen.Zentrifugieren Sie die Röhre bei 12.000 G für fünf Minuten bei vier Grad, um die Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand in ein neues proteinarmes 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie sowohl die Zelltrümmer als auch das Lysat bei minus 80 Grad Celsius.Translationale Komplexe reagieren empfindlich auf die ionische Zusammensetzung der Puffer. Das Weglassen von Magnesiumchlorid und die Zugabe von EDTA hoben hohe Sedimentationseigenschaften auf, und während Calciumchlorid zu besseren Ergebnisspitzen führte, war die Verbesserung marginal. Wir haben daher Puffer eins ausgewählt.2,2 Vol.-% Formaldehyd konservierte die Polysomen hervorragend und verringerte die Gesamtausbeute im Vergleich zu 4% Vol.-%-Formaldehyd nicht. In Säugetierzellen wurde eine viel geringere Konzentration von Formaldehyd von 0,2 Vol.-% verwendet. Da höhere Konzentrationen zu erheblichen polyribosomalen Materialverlusten führten.15 Millimolar EDTA, die dem Lysat und allen nachfolgenden Puffern zugesetzt wurden, zeigten eine deutlich geringere Destabilisierungswirkung auf die polysomalen Fraktionen, die von den fixierten Zellen abgeleitet wurden. Und dieser Effekt wurde teilweise mit 50 Millimolar EDTA mit Material aus 4% fixierten Zellen repliziert, widerstand, entfaltete sich besser. Glukosemangel löst eine der dramatischsten und schnellsten translationalen hemmenden Wirkungen auf Hefe aus.Sowohl nervenzugesetzte als auch lokal verursachte Bedingungen induzierte Polysom-Demontage war leicht, aber offensichtlich hielten mehr Polysomen in niedrig zugesetzter Glukose zurück. Wichtig ist, dass polysomales Material aus den fixierten Zellen eine hohe Unterscheidung zwischen den ausgehungerten und nicht ausgehungerten Zellen aufweist, was auf die Eignung der Formaldehydfixierung hinweist, um Unterschiede in dynamischen Translationsprozessen zu erhalten. In Ansätzen wie tacy paysake kann es zusätzlich aufschlussreich sein, kleine ribosomale Untereinheiten zu entfernen, die sich nicht gut mit den vollständigen Rhizomen absetzen, für die wir eine zweistufige Ultrazentrifugation verwendet haben, die die Isolierung von SSU, LSU, RS, RNase-resistenten Diazomen, DS und Polysomen höherer Ordnung ermöglicht, die durch Elektronenmikroskopie der festen Fraktionen bestätigt werden.Im Vergleich zu den nicht fixierten Zellen zeigte material aus den fixierten Zellen eine erhöhte Präsenz von labilem eIF4A in den am schnellsten sedimentierenden ribosomalen Fraktionen. Unter Verwendung von festem Material aus der eIF4A-Tapi-Dehnung zur Erfassung und Anreicherung von eIF4A-haltigen Komplexen mit magnetischen IDG-Kügelchen konnten wir eine selektive Anreicherung des eIF4A im Vergleich zu Beta-Aktin in SSU und RS beobachten, jedoch keine LSU-Fraktionen aus dem zweiten Gradienten bei RNase one-Demontage. Im Vergleich zu anderen Methoden der translationalen Ruhe verspricht die Schnelligkeit der Formaldehydwirkung über Zellmembranen und die wahllose Natur von Vernetzungen die Erhaltung der maximalen Vielfalt von Translationskomplex-Zwischenprodukten.Unsere Ergebnisse entsprechen der Verwendbarkeit einer schnellen Formaldehydfixierung zur Stabilisierung hochtransienter Komplexe und belegen die Nützlichkeit in Szenarien schneller zellulärer Reaktionen auf Umweltveränderungen oder Stressbedingungen.

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Biology

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

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Forschung

Biologie

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Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

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Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

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FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...