Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרויקט דיסקברי של מועצת המחקר האוסטרלית (DP180100111 ל- T.P. ו- N.E.S), מענק החוקר הלאומי לבריאות ומחקר רפואי (GNT1175388 ל- N.E.S) ומלגת מחקר (APP1135928 ל- T.P.). המחברים מכירים במתקני מיקרוסקופיה אוסטרליה במרכז למיקרוסקופיה מתקדמת, האוניברסיטה הלאומית האוסטרלית, מתקן הממומן על ידי האוניברסיטה והממשלה הפדרלית.

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

קיבוע פורמלדהיד הוא שיטה נוחה ופופולרית להשגת קישור מהיר של ויוו של ביומולקולס10,36,45,46,47,48. בהשוואה ליעדים הביו-מולולקוליים הפוטנציאליים האחרים, לכידה מוצלחת של מתחמים תרגומיים מחייבת קיבעון מיידי במהלך צינון הצמדה של התאים או חומר אחר. ללא התייצבות לא מוצהרת, קיים פוטנציאל לתהליכים שונים הקשורים לתרגום להמשיך, ולהסיט את ההתפלגות המורכבת הרחק מהמצב הלא מעורער של vivo 49. בהשוואה לשיטות האחרות של מעצר תרגום וייצוב מורכב ריבוזומלי, המהירות של פעולת פורמלדהיד על פני קרום התא והאופי חסר ההשעיה של הקישורים המבטיחים שימור של המגוון המקסימלי של מתחם התרגום המתווכים קרוב יותר למצבם המבוזר במקור50.
הגישה המוצגת כאן נקבעה ומותאמת הן בתאי שמרים והן בתאי יונקים, ושיטות נגזרו כעת על ידי קבוצות אחרות לשימוש על פני חומר ביולוגי מגוון יותר, כגון בחולייתנים שלמים (למשל, עוברים של דגי זברה)10,38,39,49,51,52 . למרות שעבודות אלה מרגיעות באופן קולקטיבי את הרבגוניות ואת הישימות הרחבה של הגישה, קישור מהיר של פורמלדהיד של מתחמי תרגום יכול להיחשב מעט קשה להחליף סוגים חדשים של חומר ביולוגי בשל הצורך של אופטימיזציות והתאמות.
דרישה בראש ובראשונה להצלחת השיטה היא אופטימיזציה מחדש של ריכוז הפורמלדהיד וטכניקת איסוף התאים וההפרעה. פחות חדיר, תאי שמרים קטנים ועגולים דורשים ריכוז פורמלדהיד גבוה בהרבה (לפחות פי 10) ושיבוש פיזי של התאים הקבועים. לעומת זאת, תאי יונקים חסידים גדולים ושטחיים בתרבית יכולים להיות קבועים יתר על המידה ודורשים טיפול עדין על קיבעון, בעוד החילוץ של מתחמים קבועים יכול להתבצע כימית עם הפרעה ממברנה באמצעות דטרגנטים. קישור תת-מוצלב עשוי לאפשר למתווכים פחות יציבים או קצרי מועד יותר לנתק או לדלוף למצב מאוחר יותר. קישור יתר עלול להשפיע לרעה על היכולת לבודד וללמוד שברים ריבוזומליים ויכול ליצור הטיות סלקטיביות כגון דלדול עמוק יותר של מתחמים כבדים. בהתבוננות שלנו, אפילו שינויים קלים, כגון סוג התאים האנושיים החסידים המשמשים, יכולים להשפיע על התשואה של מתחמי crosslinked התאושש ועשויים לדרוש אופטימיזציה מחדש של גדוד crosslinking. אנו יכולים גם לצפות כי תאים עם תכונות חדורות שונות באופן משמעותי, כגון תאים צמחיים, ידרשו אופטימיזציה נרחבת נוספת של תנאי הקיבעון52. עם זאת, קשה לדמיין סוג של חומר ביולוגי שלא יהיה תואם לחלוטין את הגישה.
שיקול אחד הנוגע לפרוטוקול קיבוע היונקים הוא הצפיפות וכמות החומר התאי המשמש כקלט. מומלץ כי התאים יגדלו ללא הרף מבלי לזרוע מחדש או הפרעות אחרות למשך יומיים לפחות, כדי למנוע השפעות חיצוניות על דינמיקת התרגום התאי. ישים עבור רוב סוגי התאים, אבל עבור רוב התאים החסידים השיג בעקביות רמות מפגש של לא יותר מ 70% יבטיח היעדר השפעות עיכוב מגע גדול שיכול להשפיע לרעה ובלתי צפוי על שיעורי התרגום.
מאפיין מעניין נוסף, ואולי נוח במיוחד, של קיבעון פורמלדהיד הנובע מהתגובה חסרת ההפלות שלו הוא השפעת הייצוב על מתחמי תרגום במערכות של טקסונומיה מעורבת. חיידקים, ועוד יותר מכך מתחמים תרגומיים של המיטוכונדריה, כלורופלסטים וטפילים תאיים שונים, היו ידועים לשמצה כקשים למיקוד עם מעכבי תרגום ספציפיים. לעומת זאת, בנתוני TCP-seq, מיפוי טביעות רגליים למיטרוטרן ניתן להבחין בקלות בנתונים38,39,50. התפתחות מעניינת לאחר מכן יכולה להיות שימוש בגישה לחקור תרגום במיקרו-קומוניזם שלם, כגון בדגימות קרקע, מים או מעיים, שבהן מעצר תרגום מהיר ואמין וייצוב מורכב בכל אמצעי אחר יהיו בעייתיים.
כמו כן יש לציין כי עבור החומר המסובך ביותר (כגון רקמות קשות ו / או מגושם), שום דבר לא מונע את השימוש בייצוב פורמלדהיד מיד עם הפרעה לתא הומוגניזציה חומרית. גישה זו כבר משמשת לעתים קרובות כדי להסיר את עיכוב הכניסה לתא בעת ייצוב מתחמי תרגום עם מעכבי מולקולה קטנה ספציפית33,53,54,55. בהתחשב בכך קיבוע פורמלדהיד שימש באופן מסורתי עם תוצאות מצוינות עבור ייצוב מדגם ex vivo / in vitro ביישומים כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית45,56,57,58, אנו יכולים לצפות אפילו פחות השפעות שליליות במקרה זה, במיוחד אלה הקשורים להפקה לקויה של מתחמי התרגום מהתאים הקבועים ביסודיות.
הממצאים שלנו מאשרים את השימושיות של קיבוע פורמלדהיד מהיר לייצב מתחמים ארעיים מאוד, כגון אלה הכוללים eIF4A. ראוי לציין כי בניגוד ליונקים, שמרים eIF4A קשורה הרבה יותר חלש עם מתחם כריכת המכסה eIF4F, וכתוצאה מכך, מתחמים תרגומיים בכלל. eIF4A הולך לאיבוד בדרך כלל במהלך כל טיהור נרחב של החומר ריבוזומלי בשמרים29,59,60,61,62,63. עם זאת, בחומר שמרים קבוע in vivo,ניתן להשיג העשרה אמינה של eIF4A בכל שברי מתחמי התרגום שבהם נוכחותו הייתה צפויה. נתוני Sel-TCP-seq שפורסמו בעבר הדגימו את ההעשרה של eIF2 ו- eIF3 המקשרים ביתר שאת לריבוזומים (אך גם חשפו הרכבה מורכבת מורכבת של חלבונים תרגומיים משותפים)39. לפיכך, השיטה מתאימה לאיתור שניהם, מרכיבים מחוברים חזקים וחלשים יותר של מתחמי התרגום.
לסיכום, הצגנו גישה שימושית כדי לקבל תובנות בעיקר על השינויים המתרחשים בשלב החניכה של התרגום וכאשר נדרשת התפלגות ריבוזומלית מינימלית על ה- mRNA. חשוב לציין, הגישה מתאימה לייצוב של רכיבים ערמומיים ודינמיים יחסית של מתחמי תרגום, כגון eIF4A, וניתן להשתמש בה באופן נרחב בכפוף לאופטימיזציות הדרושות. סיפקנו גם ראיות לתועלת של קיבעון פורמלדהיד בתרחישים של שינוי דינמי מהיר של תרגום, פתיחת תחומי חקירה כגון תגובות תאיות בקצב מהיר לשינויים סביבתיים או תנאי לחץ.

אורגניזמים חיים נתונים לשינויים פנים-תאיים דינמיים לאורך תוחלת החיים שלהם, הדורשים תגובות מהירות כדי לשמור על הומאוסטזיס ולהבטיח הישרדות. כדי לאפשר הסתגלות סביבתית, תאים אאוקריוטים להתאים את חילוף החומרים שלהם באמצעות בקרת ביטוי גנים. ניתן להפעיל בקרת ביטוי גנים במהלך תמלול ו/או תרגום; עם תגובות תרגומיות המתרחשות בדרך כלל מהר יותר1,2,3,4. לדוגמה, שינויים תרגומיים בדרך כלל להתעורר בתוך 1-30 דקות של תחילת הלחץ, בעוד שינויים ברמת שעתוק לאחר שעות לאחרחשיפהללחץ 3,4,5. שינויים בתפוקת התרגום מושגים מהר יותר בשל הזמינות המתמשכת של מולקולות RNA שליח (m) בציטופלסמה. לעומת זאת, ברמת התמלול, מולקולות mRNA חדשות חייבות להיות מסונתזות, ובאאוקריוטים, מעובדים ומיוצאים מהגרעין, ומייצרים עיכובים נרחבים בזמן התגובה2,4,6,7,8.
תגובה תרגומית חריפה ללחץ מאופיינת בדרך כלל בירידה כוללת בתפוקת התרגום, עם עלייה סלקטיבית של חלבונים הדרושים להישרדות התא1,3,4,9. הפחתת תפוקת ייצור החלבון נחשבת חיונית בשל הוצאות האנרגיה הגבוהות של התהליך3,7. כדי להקל על העיכוב הסלקטיבי ועליית, תגובות תרגומיות מוגשות על ידי מגוון של מנגנוני רגולציה מורכבים. ניתן להפעיל רגולציה בכל שלבי התרגום: חניכה, התארכות, סיום ביוסינתזה של פוליפפטיד ומיחזור ריבוזומלי10,11,12,13אבל מוצג בצורה החזקה ביותר בשלב החניכה,5,7,9,10,13. במהלך החניכה, תת-unit ריבוזומלי קטן (SSU), בסיוע גורמי חניכה אאוקריוטיים (eIFs), נקשר לאזור הלא מתועד של 5' (UTR) עד לזיהוי קודון התחלה2,5,6,8,11,12,13. מנגנוני רגולציה מתמקדים לעתים קרובות במזיפים אלקטרוניים המשפיעים על התקשרות, סריקה והפעלה של זיהוי קודון. לדוגמה, גורם החניכה eIF2, גורם תרגום חיוני המסייע בגיוס של יזם Met-tRNAiMet לSSU, הוא לעתים קרובות ממוקד אאוקריוטים בתנאי לחץ4,6,11. בשמרים, זרחן של גורם זה יכול להיות מושרה תחת חסך תזונתי ומתח אוסמוטי1,4,11,14,15ובתאי יונקים, רעב בחומצות אמינו, לחץ רטיקולום אנדופלסמי (ER), מתח UV, זיהום ויראלי ורמות חמצן משתנות עלולים לעורר תגובה זו.8,9,11. עלייה מהירה בתרגום mRNA ספציפי ניכרת בתגובת תאי היונקים להיפקסיה, המציגה עיכוב תרגום מהיר גלובלי וערעור סלקטיבי של ביוסינתזה של גורמים היפוקסיה-בלתי ניתנים לערעור (HIFs). HIFs הם גורמי שעתוק, אשר לאחר מכן לעורר תכנות סלולרי לטווח ארוך יותר ברמת שעתוק DNA8,9,16. תגובות דומות נצפו בשמרים תחת לחץ חום, עם ביטוי תרגום מהיר של חלבוני הלם חום (HSPs) ואחריו תגובות מושהות ברמת שעתוק17,18. בנוסף למחסור בחומרים מזינים והלם חום, תגובות תרגומיות בשמרים נחקרו תחת חמצן משתנה8,19מליחות,5פוספט, גופרית,20,21 וחנקן22,23 רמות. למחקר זה השלכות נרחבות על השימושים התעשייתיים של שמרים, כגון אפייה ותסיסה24,25. תגובות תרגומיות עשויות גם להיות אינסטרומנטליות בקידום ההבנה של מחלות כגון הפרעות ניווניות ומחלות לב, המאופיינות בלחצים תאיים כמו עקה חמצונית. בסך הכל, תגובות תרגומיות הן חלק בלתי נפרד מהבקרה בביטוי הגנים ומאפשרות הסתגלות מהירה למגוון רחב של תנאי לחץ באורגניזמים אאוקריוטים.
כדי ללמוד תגובות תרגומיות, נדרשות שיטות המספקות תמונות מעוותות מינימליות של נוף התרגום. פרופיל פוליזום הוא גישה קלאסית המשמשת בחקר התרגום על פני mRNA, הכוללת הפרדה של שברים סומליים פולי (ריבו) של mRNA באמצעות אולטרה צנטריפוגה באמצעות שיפועי סוכרוז26,27. הגישה עשויה לשמש כדי לחקור רמות תרגום עבור mRNAs בודדים (עם שיטות הזיהוי כגון שעתוק הפוך ותגובת שרשרת פולימראז, RT-PCR26), או ברחבי העולם בשילוב עם טכניקות תפוקה גבוהה (microarray או RNA-seq28,29). גישה מפותחת יותר היא פרופיל ריבוזום, המאפשר לחקור עמדות של ריבוסומים מוארכים לאורך מולקולת mRNA בקנה מידה רחב גנום, כמו גם את המסקנה של יעילות התרגום על פני transcriptome וניצול של אתרי ההתחלה העיקריים והאלטרנטיביים30,31. פרופיל ריבוזום כרוך בבידוד ורצף של שברי mRNA המוגנים על ידי נוכחות ריבוזומלית עליהם. פרופיל ריבוסום סיפק תובנה ניכרת על דינמיקת התרגום על פני מספר תנאים, כולל מתח היפוקסי, הלם חום ומתח חמצוני31,32. הטכניקה הותאמה לסוגי חומרי מקור מרובים, כולל שמרים ותאי יונקים.
בעוד פרופיל polysome ו ribosome היו בסיסיים בהרחבת יכולות המחקר בתרגום, תהליך התרגום כולל מתווכים תרגומיים שונים ומתחמים שקשה ללכוד בשיטות אלה11,13. מגבלה נוספת נובעת מהיעדר יכולת לחקור סוגי תגובה מהירים, שכן מתחמי תרגום מתייצבים ב- vivo על ידי תוספת של מעכבי תרגום ספציפיים (אנטיביוטיקה), מה שמוביל לממצאי הפצה מסוימים של ריבוזום, או ex vivo על תמוגה התא במיוחד (אנטיביוטיקה) או באופן לא ספציפי (יונים מלח או מגנזיום גבוהים), מה שמוביל למחסור במתווכים קצרי מועד או פחות יציבים33, 34,35.
פורמלדהיד נמצא בשימוש נרחב כדי לקשר בין חומצות גרעין וחלבונים, כגון במחקרים אימונופרציפיטציה של כרומטין (ChIP) וקישור אימונופרציפיטציה (CLIP). גודלו הקטן וחמידות התאים המצוינת שלו מאפשרים פעולה מהירה ב- vivo 36. בהתבסס על קישור מהיר פורמלדהיד, הגישה ליצירת פרופיל ריבוזום הורחבה עם ריצוף הפרופיל המורכב של התרגום (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, שפותח לראשונה בשמרים, מאפשר לכידה של כל מתווכים תרגום, כולל סריקה או לאחר סיום מתחמי SSU ותצורות ריבוזומליות מרובות37,38,41,42. השיטה נוצלה במספר מחקרים10,38,39,41,42, שחלקם משתמשים בגישה קומבינטורית של מעכבי תרגום וקישורים פורמלדהיד כדי להקל על מעצר התרגום. גירסה שונה נוספת של הטכניקה, סלקטיבי TCP-seq39, הועסק לאחרונה כדי לכלול אימונופורציה של מתחמים crosslinked, הרחבת היקף יישומי TCP-seq. האופי המהיר, היעיל והה הפיך של קישור צולב פורמלדהיד הופך גישות אלה מתאים לחקר mRNA ארעי: אינטראקציות מורכבות תרגום, במיוחד בהקשר של מסלולי תגובה דינמיים מאוד ברמת התרגום.
כאן אנו מפרטים את התהליכים של קישור צולב של in vivo פורמלדהיד לצורך ייצוב ובידוד מורכבים של תרגום מקיף. אנו מספקים פרוטוקולים נפרדים לניואנסים עבור שמרים ותאי יונקים(איור 1). אנו מתארים דוגמאות נוספות לשימוש הבא בחומר המיוצב באמצעות קישור מקושר(איור 1),כגון לזיהוי גורמי חלבון מטוהרים באמצעות אימונובלוטינג (סופג מערבי), טיהור בסיוע אימונו (או 'אימונו-פחת'; IP) והעשרה של מתחמים תרגומיים המכילים גורמי עניין ספציפיים, מיקרוסקופיית אלקטרונים ורצף RNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> איור 1: תרשים המתאר סקירה כללית של ההתקנה הניסיונית הטיפוסית. השלבים העיקריים של ייצוב פורמלדהיד in vivo של מתחמים תרגומיים מתוארים כתרשים זרימה, בתוספת מידע על המכשירים העיקריים הדרושים. יישומים פוטנציאליים במורד הזרם של החומר המקושר מפורטים, כולל דוגמאות אשר הועסקו בהצלחה אך לא כוסו ישירות בפרוטוקול זה, כגון טיהור חרוזים SPRI של RNA, ריצוף RNA וספקטרומטריית מסה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

תגובות מהירות הכוללות חלוקה מחדש מהירה של RNA שליחים ושינויים בתרגום mRNA רלוונטיים להתאמות הומיאוסטטיות מתמשכות של התאים. התאמות אלה הן קריטיות לשרידות תאים אאוקריוטיים ו'בקרת נזקים ' במהלך רמות חומר מינון ומליחות משתנות, טמפרטורה ולחצים כימיים וקרינה שונים. בשל האופי הדינמי ביותר של התגובות ברמת הרנ"א, וחוסר היציבות של רבים מתווכים RNA:RNA ו- RNA:protein, קבלת תמונה משמעותית של מצב ה- RNA הציטופלסמי אפשרית רק עם מספר מוגבל של שיטות. ניסויי פרופיל ריבוזום מבוססי רנ"א הם בין מקורות הנתונים האינפורמטיביים ביותר לשליטה בתרגום. עם זאת, היעדר ייצוב ביניים אחיד של RNA ו-RNA:חלבון עלול להוביל להטיות שונות, במיוחד במסלולי התגובה התאית המהירה. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של קיבעון מהיר החל על תאים אאוקריוטים של חמינות שונה, כדי לסייע RNA ו RNA: ייצוב ביניים חלבון. אנו מספקים דוגמאות לבידוד של מתחמי ה- RNA: חלבון המיוצבים בהתבסס על משקעים משותפים שלהם עם שברים סומליים ריבוזומליים ופוליבו. ניתן להשתמש בחומר המיוצב המופרד כחלק מניסויים מסוג ריבוזום פרופיל, כגון בגישה של ריצוף פרופיל מורכב תרגום (TCP-seq) ונגזרותיו. רב-תכליתיות של שיטות בסגנון TCP-seq הוכח כעת על ידי היישומים במגוון אורגניזמים וסוגי תאים. ניתן גם לטוהר ולדמות את המתחמים המיוצבים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים, מופרדים לשברים סומליים שונים של פולי(ריבו) ונבדקים לרצף RNA, בשל קלות היפוך הקישור הצולב. לכן, שיטות המבוססות על קיבוע snap-chilling ופורמלדהיד, ואחריו מבוסס משקעים או סוג אחר של העשרה מורכבת RNA: חלבון, יכול להיות עניין מיוחד בחקירת פרטים עדינים יותר של דינמיקה מורכבת RNA: חלבון מהיר בתאים חיים.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

זרימת העבודה מורכבת מגידול תאים בתנאים סביבתיים מבוקרים לחלוטין, צמרמורת מהירה שלהם באמצעות מים נמסים / קרח ותיקון עם ריכוז אופטימיזציה מראש של פורמלדהיד וזמן הדגירה. תגובת הקיבעון מרווה לאחר מכן באמצעות עודף של תרכובות המכילות קבוצת אמינו ראשונית, כגון גליצין או טריפס. תאים נאספים, נשטפים וניתן לאחסן אותם קפואים.תאים קבועים יכולים להיות lysed מכני או כימי, ואת lysate משמש להפרדה של שברים ריבוזומליים בהתבסס על הגודל המולקולרי שלהם, תכונות משקעים או סמני זיקה. הגישה מביאה לחומר רב-תכליתי שמיש לטיהור וזיהוי בסיוע אימונו, העשרה של מתחמים המכילים גורמים ספציפיים במיקרוסקופיית אלקטרונים. לאחר חסימה עמוקה מוצלבת, הגברת RNA או ניתוחים מבוססי הכלאה, רצף RNA וספקטרומטריית מסה הופכים לאפשריים.הגדר תרבות שמרים של ליטר אחד בשייקר מסלולית עם צפיפות אופטית התחלתית לא יותר מ 0.05 יחידות ספיגה ב 600 ננומטר ולהשתמש פפטון ו מדיה דקסטרוז ב 30 מעלות צלזיוס. הגדר צנטריפוגה הכנה עם רוטור תואם ובקבוקי צנטריפוגה עבור גלולה ההשעיה הנוזלית של תאי שמרים ב 5000 G בארבע מעלות צלזיוס. שמור תיעוד של הצפיפות האופטית של התאים הגדלים.זה חייב להיות בין 0.6 ל 0.8 יחידות ספיגה ו 600 ננומטר בזמן האיסוף אם שלב הצמיחה המעריכי הוא עניין. ברגע שהתאים מוכנים, הקימו מקרר בתוך מכסה המנוע הכימי עם אופה המכיל 250 גרם של קרח מים כתוש נקיים ותראו לכם גם 25 מיליליטר טריפסין ומתנול שנרכש טרי התייצב 37% תמיסת פורמלדהיד בתוך מכסה המנוע. יוצקים את תרבית התא האחרונה לאופה המכיל את הקרח.לאחר מכן להוסיף 75 מיליליטר של 37%פורמלדהיד לריכוז סופי של 2.2% משקל על נפח מערבבים באינטנסיביות את התערובת עד שהקרח נמס. לאחר הקרח נמס, להגדיר שעון במשך 10 דקות לאחר הדגירה במשך 10 דקות, להעביר את התרבות לתוך בקבוקי צנטריפוגה מקורר מראש גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס, 5000 G במשך חמש דקות. בעוד הספין הוא, על מראש מגניב צינור 50 מיליליטר ולשמור על חיץ מוכן טרי A המכיל גליצין כדי לנטרל כל פורמלדהיד שנותר על קרח.לאחר צנטריפוגה, מניחים את צינורות הצנטריפוגה על קרח עם צד הכדור במגע עם הקרח. מכניסים את הצינורות למכסה המנוע של האדים ומשליכים את הסופר-נט למיכל פסולת פורמלדהיד. להשעות מחדש את גלולה התא מצינורות ישנים ב 20 מיליליטר של חוצץ A באמצעות סטריפט 25 מיליליטר והעברה לתוך צינור 50 מיליליטר.לפצות את הנפח ל 40 מיליליטר עם חוצץ A ולאסוף את תאי לשטוף על ידי צנטריפוגה של ארבע מעלות צלזיוס, 5000 G במשך חמש דקות. להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את גלולה התא ב 40 מיליליטר חוצץ אחד, שהוא חוצץ A לא מכיל גליצין כדי להסיר זיהום גליצין. גלולה התאים שוב על ידי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס, 5000 G חמש דקות.חזור על הכביסות עם חוצץ A, עוד פעם אחת. להשליך את supernatant ומניחים את גלולה התא על קרח. שקול את הצינור עם הכדור, מסת התא הרטוב צריך להיות בערך גרם אחד לכל ליטר אחד של תרבית התא.מלאו פוליסטירן מקופסה מרופדת בנייר אלומיניום עם חנקן נוזלי לעומק של כשלושה סנטימטרים. מניחים בצינור 50 מיליליטר זקוף בקופסה. להשעות מחדש את הכדור ב 550 microliters של חוצץ A שתיים על ידי pipetting ומערבולת במשך 10 שניות.הוסף 10 מיקרוליטרים של 40 יחידות לכל מעכב RNase מיקרוליטר ומערבולת שוב במשך 10 שניות. באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, מטפטפים את ההשעיה של התא לתוך 50 מיליליטר 2 המכילים את החנקן הנוזלי. כדי להתכונן לשלב הבא, טרום מגניב 1.5 מיליליטר גרעין חינם צינורות על קרח יבש 10 מיליליטר צנצנות טחינה נירוסטה.מעבירים את טיפות ההשעיה הקפואות לתוך הצנצנות באמצעות מרית סטרילית נקייה. שקועים בצנצנות הטחינה בחנקן נוזלי למשך דקה אחת, ומבטיחים שהשלב הנוזלי יישאר מעל הצומת. הקם טחנת ערבוב קריו ב 27 הרץ לתסיסה במשך דקה אחת.להסעיר את צנצנות הטחינה האטומות ב 27 הרץ במשך דקה אחת בטחנת המיקסר. מצננים מחדש את הצנצנות בחנקן נוזלי כבעבר ומנערים עוד דקה. מעבירים את הצנצנות לקופסת הקרח המכילה קרח יבש יחד עם צינורות ללא גרעין 1.5 מיליליטר.באמצעות מרית פלדה קטנה להעביר את התוצאות תאריך לטחון מרופד לתוך הצינורות. ואז לאחסן את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס. בשני צלוחיות T175 לגדל HEK 293 תאים ל 60 עד 70% מפגש ואת המדיום הנשר שונה של Dalbeko ו 10% סרום בקר עוברי ב 37 מעלות ו 5% פחמן דו חמצני.לפחות שלוש שעות לפני זמן הקיבעון הרצוי, החליפו את המדיה של בקבוקון T175 בדיוק ב-30 מיליליטר של מדיה שלמה מחוממת מראש. הכן מקרר עד הקצה עם קרח מים כתוש ולשמור על מכסה המנוע אדים יחד עם חוצצים נדרשים, גם קרח. כדי לצנן את התאים, להסיר את בקבוקון T175 מן האינקובטור ולחץ אותו באופן רשמי נגד הקרח הבטחת מגע משטח מקסימלי.בתוך מכסה המנוע של אדים כימיים, הטה את הבקבוק על צידו כך שהתקשורת תאסוף בצד שממול לתאים. פיפט 168 מיקרוליטרים של 37% נשקלים על ידי פורמלדהיד נפח ישירות לתוך המדיה המאוחסת. נותן ריכוז סופי של 0.2% פורמלדהיד.מערבבים מיד. לדגור את הבקבוקונים על הקרח במשך 10 דקות נוספות. יוצקים את המדיה לתוך מיכל פסולת מתאים דרך הצד הבקבוקון מול התאים.באמצעות סטריפטי, פיפטה ב 30 מיליליטר של תמיסת מלח חוצץ פוספט של Dalbeko ללא יוני סידן ומגנזיום ובנוסף מכיל 50 גליצין מילימולר בעדינות בצד שממול לתאים. מערבבים על ידי נדנדת הבקבוקון, מחזירים את הפלאש למיקום אופקי ודגור במשך 10 דקות נוספות על הקרח. יוצקים את הפתרון דרך הצד הבקבוקון ממול לתא ולהוסיף בעדינות שבעה מיליליטרים של פתרון EDTA 0.25%טריפסין סטנדרטי לנתק ולהשעות מחדש את התאים.לדגור על הבקבוק בטמפרטורת החדר במשך חמש, מקסימום 10 דקות. אתר את הבקבוקון אנכית באמצעות strippete, לאסוף את התאים המנותקים על ידי שטיפת בעדינות כל שנותר מקירות הבקבוקון ולהעביר את המתלה לתוך צינור 50 מיליליטר להגדיר על קרח. מיד להשלים את פתרון ההשעיה שנאסף עם 20 מיליליטר של מדיה מלאה לערבב על ידי בעדינות היפוך הצינור.גלולה את התאים על ידי centrifuging הצינור ב 100 G במשך חמש דקות וארבע מעלות צלזיוס. גלולה תא חייב להיות גלוי בבירור. יוצקים את התקשורת ומשהים בעדינות את הכדור ב-10 מיליליטר של תמיסת מלח מחוסנת פוספט של דלבקו ללא גליצין.צנטריפוגה הצינור שוב ב 100 G במשך חמש דקות וב בארבע מעלות צלזיוס לשפוך את חוצץ לשטוף ולהשעות מחדש את הכדור ב 800 microliters של קרח קר פוספט של תמיסת מלח חוצץ של Dalbeko ללא גליצין, אבל המכיל מגנזיום ויוני סידן. העבר את התאים המושעים מחדש לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר חדש. צנטריפוגה הצינור ב 100 G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.בזהירות להשליך את supernatant באמצעות pipetter מיליליטר אחד. בשלב זה, כדור התא יכול להיות קפוא במינוס 80 מעלות צלזיוס או להמשיך לשלב תמוגת התא. בארון בטיחות ביולוגית להוסיף 300 microliters של חוצץ תמוגה המבוסס על חומר ניקוי לא יוני, לא denaturing, ושבע microliters של מעכב ארגינז לערבב היטב על ידי pipetting באמצעות קצה מיליליטר אחד.בזהירות לצרף מחט 25 מד למזרק אחד עד שלושה מיליליטר ו pipette במרץ את התערובת באמצעות לפחות שבע ספיגה איטית כלפי מעלה ומשיכות פליטה במהירות כלפי מטה. להשליך את המזרק ואת המחט לתוך הפח של חד ולחזור על ההליך עם מחט 31 מד ומזרק 0.3 מיליליטר. להשליך את המזרק והמחט לפח של החדה.צנטריפוגות הצינור ב 12, 000 G במשך חמש דקות בארבע מעלות כדי להסיר את פסולת התא. מעבירים את הסופרנט לצינור צנטריפוגה מיקרו-1.5 מיליליטר חדש עם חלבון נמוך. לאחסן את פסולת התא וליזייט במינוס 80 מעלות צלזיוס.מתחמי תרגום רגישים להרכב היוני של המאגרים. אומיטנס של מגנזיום כלוריד ותוספת של תכונות משקעים גבוהות של EDTA, ובעוד סידן כלוריד הביא לשיאים תוצאה טובה יותר, השיפור היה שולי. לכן בחרנו חוצץ אחד.משקל של 2.2% לפי פורמלדהיד נפח שמר מצוין על הפוליוזומים ולא הפחית את התשואה הכוללת לעומת 4% משקל לפי פורמלדהיד נפח. בתאי יונקים, ריכוז נמוך בהרבה של פורמלדהיד של 0.2% משקל לפי נפח שימש. כמו ריכוזים גבוהים יותר הביא לאובדן חומר פוליריבוסומלי משמעותי.15 מילימולר EDTA הוסיף lysate וכל המאגרים הבאים הציגו אפקט פחותה באופן ייחודי על השברים הפוליזומליים, נגזר התאים הקבועים. ואפקט זה שוכפל חלקית עם EDTA 50 מילימולר עם חומר מ 4% תאים קבועים, התנגדות, התגלגלות טובה יותר. דלדול גלוקוז מעורר את אחת ההשפעות המעכבות התרגומיות הדרמטיות והמהירות ביותר על שמרים.הן העצבים שנוספו והן גורמים באופן מקומי לתנאים הנגרמים מפירוק פוליום היו מעט, אך ככל הנראה יותר פוליוזומים נשמרו בגלוקוז הוסיף נמוך. חשוב לציין, חומר פוליזומלי מהתאים הקבועים מדגים הבחנה גבוהה בין התאים הרעבים והלא מורעבים המצביעים על התאמת קיבוע פורמלדהיד כדי לשמר הבדלים בתהליכים תרגומיים דינמיים. בגישות כגון tacy paysake, זה עשוי להיות תובנה נוספת כדי להסיר subunits ריבוזומלי קטן שאינם להתיישב היטב עם קנה שורש מלא שעבורם השתמשנו ultracentrifugation דו שלבי, המאפשר בידוד של SSU, LSU, RS, דיאזומים עמידים RNase, DS, ו polysomesomes בסדר גבוה שאושרו על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים של השברים הקבועים.בהשוואה לתאים הלא קבועים, חומר מהתאים הקבועים הדגים נוכחות גבוהה של eIF4A מעבדה בשברים ריבוזומליים משקעים המהירים ביותר. באמצעות חומר קבוע מזן eIF4A tapi כדי ללכוד ולהעשיר eIF4A המכיל מתחמים עם חרוזי IDG מגנטיים, הצלחנו לצפות העשרה סלקטיבית של eIF4A לעומת בטא-אטין ב- SSU ו- RS, אך לא שברי LSU מהשיפוע השני על RNase אחד פירוק. בהשוואה לשיטות אחרות של מנוחה תרגומית, המהירות של פעולת פורמלדהיד על פני קרום התא והאופי חסר ההשערה של קישורים צולבים מבטיחים שימור המגוון המרבי של מתווכים מורכבים תרגום.הממצאים שלנו תואמים את השימושיות של קיבוע פורמלדהיד מהיר לייצב מתחמים ארעיים מאוד ואת התועלת של עדויות בתרחישים של תגובות תאיות מהירות לשינויים סביבתיים או לתנאי לחץ.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

הקמת מיקרוביאלית תרבויות העשרה האיקריוטים מ שכבתית כימית אנטארקטיקה אגם והערכת פוטנציאל קיבוע פחמן

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

טיהור הגנום כולו של DNA המעגל extrachromosomal מתאי איקריוטיים

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...