Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
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इस काम को ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल डिस्कवरी प्रोजेक्ट ग्रांट (DP1801001111 से टी.पी. और एनईएस), नेशनल हेल्थ एंड मेडिकल रिसर्च काउंसिल इन्वेस्ट्रकेशन ग्रांट (GNT1175388 से N.E.S.) और रिसर्च फैलोशिप (एपी1135928 से टीपी) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक सेंटर फॉर एडवांस्ड माइक्रोस्कोपी, ऑस्ट्रेलियन नेशनल यूनिवर्सिटी में माइक्रोस्कोपी ऑस्ट्रेलिया की सुविधाओं को स्वीकार करते हैं, एक ऐसी सुविधा जो विश्वविद्यालय और संघीय सरकार द्वारा वित्तपोषित है ।

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

फॉर्मेल्डिहाइड फिक्सेशन बायोमॉलिक्यूल्स10,36, 46 , 46 ,47,48के वीवो क्रॉसलिंकिंग में तेजी से प्राप्त करने की एक सुविधाजनक और लोकप्रिय विधि है। अन्य संभावित बायोमॉल्यूल लक्ष्यों की तुलना में, ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के सफल कैप्चर को कोशिकाओं या अन्य सामग्री की तस्वीर द्रुतशीतन के दौरान तत्काल निर्धारण की आवश्यकता होती है। बिना किसी कमी स्थिरीकरण के बिना, विभिन्न अनुवाद से संबंधित प्रक्रियाओं को जारी रखने की क्षमता है, जटिल वितरण को वीवो राज्य49में बेफिक्र से दूर स्थानांतरित कर रहा है। अनुवादात्मक गिरफ्तारी और रिबोसोमल जटिल स्थिरीकरण के अन्य तरीकों की तुलना में, कोशिका झिल्ली में फॉर्मलडिहाइड कार्रवाई की तेज़ी और क्रॉसलिंक की अंधाधुंध प्रकृति अनुवाद परिसर की अधिकतम विविधता के संरक्षण का वादा करतीहै।
यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण को खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं दोनों में स्थापित और अनुकूलित किया गया है, और अब अन्य समूहों द्वारा अधिक विविध जैविक सामग्री में उपयोग के लिए तरीके प्राप्त किए गए हैं, जैसे कि पूरे कशेरुकी (जैसे, जेब्राफिश भ्रूण)10,38,39,49,51,52 . यद्यपि ये काम सामूहिक रूप से दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा और व्यापक प्रयोज्यता को आश्वस्त करते हैं, लेकिन अनुकूलन और समायोजन की आवश्यकता के कारण ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के तेजी से फॉर्मलडिहाइड क्रॉसलिंकिंग को नए प्रकार की जैविक सामग्री में स्थानांतरित करना कुछ हद तक मुश्किल माना जा सकता है।
विधि की सफलता के लिए एक सबसे महत्वपूर्ण आवश्यकता फॉर्मेल्डिहाइड और सेल संग्रह और व्यवधान तकनीक की एकाग्रता का पुनः अनुकूलन है। कम पारगम्य, छोटे और गोल खमीर कोशिकाओं को बहुत अधिक (कम से कम, 10 गुना) फॉर्मलडिहाइड एकाग्रता और निश्चित कोशिकाओं के शारीरिक व्यवधान की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, संस्कृति में बड़े और चपटे अनुयायी स्तनधारी कोशिकाओं को आसानी से अधिक तय किया जा सकता है और निर्धारण पर कोमल हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, जबकि निश्चित परिसरों की निकासी को डिटर्जेंट का उपयोग करके झिल्ली व्यवधान के साथ रासायनिक रूप से किया जा सकता है। अंडर-क्रॉसलिंकिंग कम स्थिर या अधिक अल्पकालिक मध्यवर्ती को बाद की स्थिति में अलग या रिसाव करने की अनुमति दे सकता है। ओवर-क्रॉसलिंकिंग राइबोसोमल अंशों को अलग करने और अध्ययन करने की क्षमता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है और भारी परिसरों की गहरी कमी जैसे चयनात्मक पूर्वाग्रह पैदा कर सकता है। हमारे अवलोकन में, यहां तक कि मामूली परिवर्तन, जैसे कि उपयोग की जाने वाली अनुयायी मानव कोशिकाओं के प्रकार, बरामद क्रॉसलिंक्ड परिसरों की उपज को प्रभावित कर सकते हैं और क्रॉसलिंकिंग रेजिमेन के पुनः अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। हम यह भी आशा कर सकते हैं कि पौधों की कोशिकाओं जैसे काफी अलग पारमीयता गुणों वाली कोशिकाओं को निर्धारण शर्तों52के अतिरिक्त व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता होगी। फिर भी, एक प्रकार की जैविक सामग्री की कल्पना करना मुश्किल है जो दृष्टिकोण के साथ पूरी तरह से असंगत होगा।
स्तनधारी निर्धारण प्रोटोकॉल के लिए प्रासंगिक एक विचार घनत्व और इनपुट के रूप में उपयोग की जाने वाली सेल सामग्री की मात्रा है। सेलुलर अनुवाद गतिशीलता पर बाहरी प्रभावों से बचने के लिए कम से कम 2 दिनों के लिए कोशिकाओं को फिर से बोने या अन्य क्षोभ के बिना लगातार बढ़ने की सिफारिश की जाती है। अधिकांश सेल प्रकारों के लिए लागू है, लेकिन अधिकांश अनुयायी कोशिकाओं के लिए लगातार 70% से अधिक के संगम स्तर प्राप्त करने से प्रमुख संपर्क अवरोध प्रभावों की अनुपस्थिति सुनिश्चित होगी जो अनुवाद दरों को नकारात्मक और अप्रत्याशित रूप से प्रभावित कर सकते हैं।
एक और दिलचस्प, और संभावित रूप से विशिष्ट सुविधाजनक, इसकी अंधाधुंध प्रतिक्रियाशीलता से उपजी फॉर्मलडिहाइड फिक्सेशन की विशेषता मिश्रित वर्गीकरण की प्रणालियों में ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स पर स्थिरीकरण प्रभाव है। बैक्टीरियल, और माइटोकॉन्ड्रिया, क्लोरोप्लास्ट और विभिन्न इंट्रासेलर परजीवी के और भी अधिक अनुवादात्मक परिसरों, विशिष्ट अनुवाद अवरोधकों के साथ लक्षित करना बेहद मुश्किल रहा है। इसके विपरीत, टीसीपी-एसईक्यू डेटा में, माइटोट्रान्रिप्टोम के पैरों के निशान38,39,50के आंकड़ों में आसानी से नमूदार हैं। एक दिलचस्प बाद में विकास इस तरह के मिट्टी, पानी या आंत के नमूनों में, जहां विश्वसनीय तेजी से अनुवाद गिरफ्तारी और किसी भी अंय साधनों के साथ जटिल स्थिरीकरण के रूप में पूरे microcommunities में अनुवाद की जांच करने के लिए दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है समस्याग्रस्त होगा ।
यह भी उल्लेख किया जाना चाहिए कि सबसे जटिल सामग्री (जैसे कठिन और/या भारी ऊतकों) के लिए, कुछ भी कोशिका व्यवधान और सामग्री समरूपता पर तुरंत फॉर्मलडिहाइड स्थिरीकरण के उपयोग को रोकता है । विशिष्ट छोटे अणु अवरोधक33 , 53, 54,55के साथ ट्रांसलेशनल परिसरों को स्थिर करते समय सेल प्रवेश में देरी को दूर करने के लिए यह दृष्टिकोण पहले से ही अक्सर नियोजित कियाजाताहै । यह देखते हुए कि फॉर्मलडिहाइड निर्धारण पारंपरिक रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी४५, ५६, ५७,५८जैसे अनुप्रयोगों में पूर्व वीवो/इन विट्रो नमूना स्थिरीकरण के लिए उत्कृष्ट परिणामों के साथ इस्तेमाल किया गया है, हम इस मामले में और भी कम नकारात्मक प्रभाव की उम्मीद कर सकते हैं, विशेष रूप से पूरी तरह से तय कोशिकाओं से ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के खराब निष्कर्षण से जुड़े लोग ।
हमारे निष्कर्ष अत्यधिक क्षणिक परिसरों को स्थिर करने के लिए तेजी से फॉर्मलडिहाइड निर्धारण की उपयोगिता की पुष्टि करते हैं, जैसे कि उनमें eIF4A शामिल हैं। यह उल्लेखनीय है कि स्तनधारियों के विपरीत, खमीर eIF4A कैप बाध्यकारी जटिल eIF4F के साथ बहुत अधिक कमजोर रूप से जुड़ा हुआ है और नतीजतन, सामान्य रूप से अनुवादात्मक परिसर। खमीर29,59, 60 , 62 , 62,63में राइबोसोमल सामग्री के किसी भी व्यापक शुद्धिकरणके दौरानआमतौर पर eIF4A खोजाताहै। फिर भी, वीवो-फिक्स्ड यीस्ट सामग्री में,ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के सभी अंशों में eIF4A के विश्वसनीय संवर्धन को प्राप्त करना संभव है जहां इसकी उपस्थिति का अनुमान लगाया जाएगा। पहले प्रकाशित सेल-टीसीपी-एसईक्यू डेटा ने eIF2 और eIF3 के संवर्धन का प्रदर्शन किया है जो राइबोसोम्स के साथ अधिक दृढ़ता से संबद्ध है (लेकिन यह भी पता चला कि क्षणिक रूप से होने वाले सह-ट्रांसलेशनल प्रोटीन कॉम्प्लेक्स असेंबली)39। इस प्रकार, विधि ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के मजबूत और कमजोर संलग्न दोनों घटकों का पता लगाने के लिए उपयुक्त है।
संक्षेप में, हमने मुख्य रूप से अनुवाद के दीक्षा चरण में होने वाले परिवर्तनों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए उपयोगी दृष्टिकोण प्रस्तुत किया है और जब एमआरएनए पर न्यूनतम रूप से बेफिक्र रिबोसोमल वितरण की आवश्यकता होती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह दृष्टिकोण ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के अपेक्षाकृत लैबिल और गतिशील घटकों जैसे eIF4A के स्थिरीकरण के लिए उपयुक्त है, और इसका उपयोग मोटे तौर पर आवश्यक अनुकूलन के अधीन किया जा सकता है। हमने अनुवाद के तेजी से गतिशील परिवर्तन के परिदृश्यों में फॉर्मलडिहाइड निर्धारण की उपयोगिता के सबूत भी प्रदान किए हैं, जो पर्यावरणीय परिवर्तनों या तनाव की स्थिति के लिए तेजी से पुस्तक सेलुलर प्रतिक्रियाओं जैसे जांच के क्षेत्रों को खोल रहे हैं ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

मैसेंजर (एम) आरएनए के तेजी से पुनर्वितरण और एमआरएनए अनुवाद के परिवर्तनों से जुड़ी त्वरित प्रतिक्रियाएं कोशिकाओं के चल रहे होम्योस्टिटिक समायोजन के लिए प्रासंगिक हैं। ये समायोजन यूकेरियोटिक सेल सर्वाइविटी और 'क्षति नियंत्रण' के लिए महत्वपूर्ण हैं, जो पोषक तत्वों और लवणता के स्तर, तापमान और विभिन्न रासायनिक और विकिरण तनावों में उतार-चढ़ाव के दौरान होते हैं। आरएनए स्तर की प्रतिक्रियाओं की अत्यधिक गतिशील प्रकृति के कारण, और आरएनए के कई की अस्थिरता: आरएनए और आरएनए: प्रोटीन मध्यवर्ती, साइटोप्लाज्मिक आरएनए राज्य का एक सार्थक स्नैपशॉट प्राप्त करना केवल सीमित संख्या में तरीकों के साथ संभव है। ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड, आरएनए-सेक-आधारित राइबोसोम प्रोफाइलिंग-प्रकार के प्रयोग अनुवाद के नियंत्रण के लिए डेटा के सबसे सूचनात्मक स्रोतों में से हैं। हालांकि, एक समान आरएनए और आरएनए की अनुपस्थिति: प्रोटीन मध्यवर्ती स्थिरीकरण विशेष रूप से तेज गति वाले सेलुलर प्रतिक्रिया मार्गों में विभिन्न पूर्वाग्रहों का कारण बन सकता है। इस लेख में, हम आरएनए और आरएनए: प्रोटीन मध्यवर्ती स्थिरीकरण में सहायता करने के लिए, विभिन्न पारमशीलता की यूकेरियोटिक कोशिकाओं पर लागू तेजी से निर्धारण का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम स्थिर आरएनए के अलगाव के उदाहरण प्रदान करते हैं: राइबोसोमल और पॉली (रिबो) सोमल अंशों के साथ उनके सह-तलछट के आधार पर प्रोटीन परिसर। अलग स्थिर सामग्री का उपयोग बाद में राइबोसोम प्रोफाइलिंग-प्रकार के प्रयोगों के हिस्से के रूप में किया जा सकता है, जैसे अनुवाद जटिल प्रोफाइल अनुक्रमण (टीसीपी-एसईक्यू) दृष्टिकोण और इसके डेरिवेटिव में। टीसीपी-सेक्यू-शैली विधियों की बहुमुखी प्रतिभा अब विभिन्न प्रकार के जीवों और कोशिका प्रकारों में अनुप्रयोगों द्वारा प्रदर्शित की गई है। क्रॉसलिंक उत्क्रमण की आसानी के कारण स्थिर परिसरों को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अतिरिक्त रूप से आत्मीयता-शुद्ध और चित्रित किया जा सकता है, जो विभिन्न पॉली (रिबो) सोमल अंशों में अलग हो जाते हैं और आरएनए अनुक्रमण के अधीन होते हैं। इसलिए, स्नैप-चिलिंग और फॉर्मलडिहाइड निर्धारण के आधार पर विधियां, इसके बाद तलछट-आधारित या अन्य प्रकार के आरएनए: प्रोटीन जटिल संवर्धन, तेजी से आरएनए के बेहतर विवरणों की जांच करने में विशेष रुचि हो सकती है: लाइव कोशिकाओं में प्रोटीन जटिल गतिशीलता।

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Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

हम लाइव खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में फॉर्मलडिहाइड क्रॉसलिंकिंग के साथ ट्रांसलेशनल (प्रोटीन बायोसिंथेसिस) परिसरों को तेजी से स्थिर करने के लिए एक तकनीक पेश करते हैं। यह दृष्टिकोण क्षणिक मध्यवर्ती और गतिशील आरएनए: प्रोटीन इंटरैक्शन को विच्छेदन करने में सक्षम बनाता है। क्रॉसलिंक किए गए परिसरों का उपयोग कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में किया जा सकता है जैसे कि गहरे अनुक्रमण-आधारित प्रोफाइलिंग विधियों, माइक्रोस्कोपी और मास-स्पेक्ट्रोमेट्री में।

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अलगाव और माउस महाधमनी endothelial कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृति

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

कोशिकाओं से Extrachromosomal परिपत्र डीएनए के जीनोम चौड़ा शोधन

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

न्यूक्लिक एसिड की छानने का अलगाव: एक सरल और तेजी डीएनए निष्कर्षण विधि

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...