Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione Australian Research Council Discovery Project (DP180100111 a T.P. e N.E.S),National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 a N.E.S.) e Research Fellowship (APP1135928 a T.P.). Gli autori riconoscono le strutture di Microscopy Australia presso il Centre for Advanced Microscopy, Australian National University, una struttura finanziata dall'Università e dal governo federale.

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

La fissazione della formaldeide è un metodo conveniente e popolare per ottenere una rapida reticolazione in vivo delle biomolecole10,36,45,46,47,48. Rispetto agli altri potenziali bersagli della biomolecola, la cattura di successo dei complessi traslazionali richiede una fissazione immediata durante il raffreddamento istantaneo delle cellule o di altro materiale. Senza la stabilizzazione non ritardata, c'è un potenziale per i diversi processi relativi alla traduzione di continuare, spostando la distribuzione complessa lontano dallo stato in vivo imperturbabile 49. Rispetto agli altri metodi di arresto traslazionale e stabilizzazione del complesso ribosomiale, la rapidità dell'azione della formaldeide attraverso le membrane cellulari e la natura indiscriminata dei legami incrociati promettono la conservazione della massima diversità degli intermedi complessi di traduzione più vicini ai loro stati nativamente distribuiti50.
L'approccio qui presentato è stato stabilito e ottimizzato sia nel lievito che nelle cellule di mammifero, e i metodi sono stati ora derivati da altri gruppi per l'uso su materiale biologico più diversificato, come in vertebrati interi (ad esempio, embrioni di zebrafish)10,38,39,49,51,52 . Sebbene questi lavori rafforzino collettivamente la versatilità e l'ampia applicabilità dell'approccio, la rapida reticolazione formaldeide dei complessi traslazionali può essere considerata alquanto difficile da trasporre in nuovi tipi di materiale biologico a causa della necessità di ottimizzazioni e aggiustamenti.
Un requisito fondamentale per il successo del metodo è la ri-ottimizzazione della concentrazione della formaldeide e la tecnica di raccolta e distruzione cellulare. Le cellule di lievito meno permeabili, piccole e rotonde richiedono una concentrazione di formaldeide molto più alta (almeno 10 volte) e l'interruzione fisica delle cellule fisse. Al contrario, le cellule di mammifero aderenti grandi e appiattite in coltura possono essere facilmente sovra-fissate e richiedono una manipolazione delicata al momento della fissazione, mentre l'estrazione dei complessi fissi può essere eseguita chimicamente con interruzione della membrana utilizzando detergenti. La reticolazione insufficiente può consentire agli intermedi meno stabili o più di breve durata di dissociarsi o di fuoriuscire in uno stato successivo. L'over-crosslinking può influenzare negativamente la capacità di isolare e studiare le frazioni ribosomiali e può creare pregiudizi selettivi come l'esaurimento più profondo di complessi pesanti. Nella nostra osservazione, anche piccole alterazioni, come il tipo di cellule umane aderenti utilizzate, possono influenzare la resa dei complessi reticolati recuperati e possono richiedere una ri-ottimizzazione del regime di reticolazione. Possiamo anche anticipare che le cellule con proprietà di permeabilità sostanzialmente diverse, come le cellule vegetali, richiederanno un'ulteriore ottimizzazione estesa delle condizioni di fissazione52. Tuttavia, è difficile immaginare un tipo di materiale biologico che sarebbe del tutto incompatibile con l'approccio.
Una considerazione pertinente al protocollo di fissazione dei mammiferi è la densità e la quantità di materiale cellulare utilizzato come input. Si raccomanda di far crescere continuamente le cellule senza riseminare o altre perturbazioni per almeno 2 giorni per evitare influenze esterne sulle dinamiche di traduzione cellulare. Applicabile per la maggior parte dei tipi di cellule, ma per la maggior parte delle cellule aderenti costantemente raggiunti livelli di confluenza non superiori al 70% garantirà l'assenza di importanti effetti di inibizione del contatto che possono influenzare negativamente e imprevedibilmente i tassi di traduzione.
Un'altra caratteristica interessante, e potenzialmente conveniente, della fissazione della formaldeide derivante dalla sua reattività indiscriminata è l'effetto di stabilizzazione sui complessi traslazionali nei sistemi di tassonomia mista. I complessi batterici, e ancor più traslazionali di mitocondri, cloroplasti e diversi parassiti intracellulari, sono stati notoriamente difficili da colpire con specifici inibitori della traduzione. Al contrario, nei dati TCP-seq, le impronte mappate al mitotranscriptome sono facilmente osservabili nei dati38,39,50. Un interessante sviluppo successivo potrebbe essere l'uso dell'approccio per studiare la traduzione in intere microcomunità, come nel suolo, nell'acqua o nei campioni di intestino, dove un arresto traslazionale rapido affidabile e una stabilizzazione complessa con qualsiasi altro mezzo sarebbero problematici.
Va anche detto che per il materiale più complicato (come i tessuti duri e / o voluminosi), nulla impedisce l'uso della stabilizzazione della formaldeide immediatamente dopo la distruzione cellulare e l'omogeneizzazione del materiale. Questo approccio è già frequentemente impiegato per rimuovere il ritardo di ingresso cellulare quando si stabilizzano complessi traslazionali con specifici inibitori di piccole molecole33, 53,54,55. Dato che la fissazione della formaldeide è stata tradizionalmente utilizzata con ottimi risultati per la stabilizzazione di campioni ex vivo/in vitro in applicazioni come la microscopia elettronica45,56,57,58,possiamo aspettarci effetti ancora meno negativi in questo caso, in particolare quelli associati alla scarsa estrazione dei complessi traslazionali dalle cellule accuratamente fissate.
I nostri risultati confermano l'usabilità della rapida fissazione della formaldeide per stabilizzare complessi altamente transitori, come quelli che includono eIF4A. È interessante notare che, a differenza dei mammiferi, il lievito eIF4A è molto più debolmente associato al complesso legante il cappuccio eIF4F e, di conseguenza, ai complessi traslazionali in generale. eIF4A viene solitamente perso durante qualsiasi purificazione estensiva del materiale ribosomiale nel lievito29,59,60,61,62,63. Tuttavia, nel materiale di lievito fisso in vivo,è possibile ottenere un arricchimento affidabile di eIF4A in tutte le frazioni di complessi traslazionali in cui la sua presenza sarebbe prevista. I dati Sel-TCP-seq precedentemente pubblicati hanno dimostrato l'arricchimento di eIF2 ed eIF3 che si associano più fortemente ai ribosomi (ma hanno anche rivelato l'assemblaggio del complesso proteico co-traduzionale che si verifica transitoriamente)39. Pertanto, il metodo è adatto per il rilevamento di entrambi i costituenti attaccati più forti e più deboli dei complessi traslazionali.
Per riassumere, abbiamo presentato un approccio utile per ottenere informazioni principalmente sui cambiamenti che si verificano nella fase di inizio della traduzione e quando è richiesta una distribuzione ribosomiale minimamente perturbata sull'mRNA. È importante sottolineare che l'approccio è adatto per la stabilizzazione di componenti relativamente labili e dinamiche di complessi traslazionali, come eIF4A, e può essere utilizzato ampiamente soggetto alle necessarie ottimizzazioni. Abbiamo anche fornito prove dell'utilità della fissazione della formaldeide negli scenari di rapido cambiamento dinamico della traduzione, aprendo aree di indagine come le risposte cellulari veloci ai cambiamenti ambientali o alle condizioni di stress.

Gli organismi viventi sono soggetti a cambiamenti dinamici intra ed extracellulari nel corso della loro vita, che richiedono risposte rapide per mantenere l'omeostasi e garantire la sopravvivenza. Per consentire l'adattamento ambientale, le cellule eucariotiche regolano il loro metabolismo attraverso il controllo dell'espressione genica. Il controllo dell'espressione genica può essere esercitato durante la trascrizione e/o la traduzione; con risposte traslazionali che si verificano generalmente più rapidamente1,2,3,4. Ad esempio, i cambiamenti traslazionali si verificano tipicamente entro 1-30 minuti dall'inizio dello stress, mentre le alterazioni a livello di trascrizione seguono ore dopo l'esposizione allo stress3,4,5. Le alterazioni della produzione di traduzione si ottengono più rapidamente a causa della persistente disponibilità di molecole di (m)RNA messaggero nel citoplasma. Viceversa, a livello di trascrizione, nuove molecole di mRNA devono essere sintetizzate, e negli eucarioti, elaborate ed esportate dal nucleo, producendo ampi ritardi nel tempo di risposta2,4,6,7,8.
La risposta traslazionale acuta allo stress è generalmente caratterizzata da una diminuzione complessiva della produzione di traduzione, con l'upregulation selettiva delle proteine necessarie per la sopravvivenza cellulare1,3,4,9. Si ritiene che la riduzione della produzione di proteine sia cruciale a causa dell'elevato costo energetico del processo3,7. Per facilitare l'inibizione selettiva e l'upregulation, le risposte traslazionali sono servite da una serie di complessi meccanismi di regolazione. La regolazione può essere esercitata in tutte le fasi della traduzione: inizio, allungamento, cessazione della biosintesi polipeptidica e riciclaggio ribosomiale10,11,12,13, ma è esposto più fortemente nella fase di iniziazione5,7,9,10,13. Durante l'inizio, la piccola subunità ribosomiale (SSU), assistita da fattori di iniziazione eucariotici (eIF), si lega e scansiona la regione 5' non tradotta (UTR) dell'mRNA fino a quando non viene riconosciuto un codone iniziale2,5,6,8,11,12,13. I meccanismi di regolamentazione spesso prendono di mira gli eIF che influiscono sull'allegato, la scansione e il riconoscimento dei codoni di avvio. Ad esempio, il fattore di iniziazione eIF2, un fattore di traduzione essenziale che aiuta nel reclutamento di un Met-tRNA iniziatoreiMet alla SSU, è spesso mirato negli eucarioti in condizioni di stress4,6,11. Nel lievito, la fosforilazione di questo fattore può essere indotta sotto deprivazione di nutrienti e stress osmotico1,4,11,14,15, e nelle cellule di mammifero, la fame di aminoacidi, lo stress del reticolo endoplasmatico (ER), lo stress UV, l'infezione virale e i livelli di ossigeno alterati possono innescare questa risposta8,9,11. La rapida sovraregolazione della traduzione specifica dell'mRNA è evidente nella risposta delle cellule di mammifero all'ipossia, che presenta un'inibizione globale della traduzione rapida e una sovraregolazione selettiva della biosintesi dei fattori inducibili dall'ipossia (HIF). Gli HIF sono fattori di trascrizione, che poi suscitano una riprogrammazione cellulare a lungo termine a livello di trascrizione del DNA8,9,16. Risposte simili sono state osservate nel lievito sotto stress termico, con rapida espressione traslazionale di heat shock proteins (HSP) seguita da risposte ritardate a livello di trascrizione17,18. Oltre alla privazione di nutrienti e allo shock termico, le risposte traslazionali nel lievito sono state studiate sotto ossigeno variabile.8,19salinità5, fosfato, zolfo20,21 e azoto22,23 Livelli. Questa ricerca ha implicazioni diffuse per gli usi industriali del lievito, come la cottura e la fermentazione24,25. Le risposte traslazionali possono anche essere strumentali nel promuovere la comprensione di malattie come i disturbi neurodegenerativi e le malattie cardiache, che sono caratterizzate da stress intracellulari come lo stress ossidativo. Nel complesso, le risposte traslazionali sono parte integrante del controllo dell'espressione genica e facilitano un rapido adattamento a una vasta gamma di condizioni di stress negli organismi eucariotici.
Per studiare le risposte traslazionali, sono necessari metodi che forniscano istantanee minimamente distorte del panorama della traduzione. La profilazione dei polisomi è un approccio classico utilizzato nello studio della traslazione attraverso l'mRNA, che coinvolge la separazione delle frazioni poli(ribo)somali dell'mRNA tramite ultracentrifugazione attraverso gradienti di saccarosio26,27. L'approccio può essere utilizzato per esplorare i livelli di traduzione per i singoli mRNA (con i metodi di rilevamento come la trascrizione inversa e la reazione a catena della polimerasi, RT-PCR26), o globalmente in combinazione con tecniche ad alto rendimento (microarray o RNA-seq28,29). Un approccio più evoluto è la profilazione dei ribosomi, che consente lo studio delle posizioni dei ribosomi allunganti lungo una molecola di mRNA su scala genomica, nonché l'inferenza dell'efficienza della traduzione attraverso il trascrittoma e l'utilizzo dei siti di partenza principali e alternativi30,31. La profilazione dei ribosomi comporta l'isolamento e il sequenziamento di frammenti di mRNA protetti dalla presenza ribosomiale su di essi. La profilazione dei ribosomi ha fornito una notevole comprensione delle dinamiche di traduzione in una serie di condizioni, tra cui stress ipossico, shock termico e stress ossidativo31,32. La tecnica è stata adattata a più tipi di materiale di origine, tra cui lievito e cellule di mammifero.
Mentre la profilazione di polisomi e ribosomi è stata fondamentale per estendere le capacità di ricerca nella traduzione, il processo di traduzione include vari intermedi e complessi traslazionali difficili da catturare con questi metodi11,13. Un'ulteriore limitazione deriva dalla mancanza di capacità di studiare i tipi di risposta rapida, poiché i complessi traslazionali sono stabilizzati in vivo dall'aggiunta di specifici inibitori della traduzione (antibiotici), portando a determinati artefatti di distribuzione dei ribosomi, o ex vivo su lisi cellulare specificamente (antibiotici) o in modo non specifico (ioni salini o magnesio elevati), portando alla privazione degli intermedi di vita più breve o meno stabili33, 34,35.
La formaldeide è ampiamente utilizzata per reticolare acidi nucleici e proteine, come negli studi di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e immunoprecipitazione reticolante (CLIP). Le sue piccole dimensioni e l'eccellente permeabilità cellulare consentono una rapida azione in vivo 36. Basato sulla rapida reticolazione della formaldeide, l'approccio di profilazione dei ribosomi è stato esteso con il Translation Complex Profile Sequencing (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, sviluppato per la prima volta nel lievito, consente la cattura di tutti gli intermedi di traduzione, compresi i complessi SSU di scansione o post-terminazione e le configurazioni ribosomiali multiple37,38,41,42. Il metodo è stato utilizzato in diversi studi10,38,39,41,42,alcuni dei quali utilizzano un approccio combinatorio sia di inibitori della traduzione che di reticolazione della formaldeide per facilitare l'arresto della traduzione. Un'ulteriore versione modificata della tecnica, TCP-seq39selettivo, è stata recentemente impiegata per includere l'immunopurazione dei complessi reticolati, ampliando la portata delle applicazioni TCP-seq. La natura rapida, efficiente e reversibile della reticolazione della formaldeide rende questi approcci adatti allo studio di interazioni complesse transitorie tra mRNA:traduzione, in particolare nel contesto di percorsi di risposta a livello di traduzione altamente dinamici.
Qui descriviamo in dettaglio i processi di reticolazione della formaldeide in vivo ai fini della stabilizzazione e dell'isolamento completi del complesso di traduzione. Forniamo protocolli separati sfumati per le cellule di lievito e mammifero (Figura 1). Descriviamo inoltre esempi del successivo utilizzo del materiale stabilizzato con reticolazione (Figura 1), ad esempio per il rilevamento di fattori proteici co-purificati mediante immunoblotting (western-blotting), purificazione immuno-assistita (o "immunoprecipitazione"; IP) e arricchimento di complessi traslazionali contenenti specifici fattori di interesse, microscopia elettronica e sequenziamento dell'RNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> Figura 1: Schema che illustra una panoramica della configurazione sperimentale tipica. Le fasi principali della stabilizzazione in vivo della formaldeide dei complessi traslazionali sono rappresentate come un diagramma di flusso, integrato da informazioni sugli strumenti chiave necessari. Vengono delineate le potenziali applicazioni a valle del materiale reticolato, inclusi esempi che sono stati impiegati con successo ma non direttamente coperti in questo protocollo, come la purificazione del tallone SPRI dell'RNA, il sequenziamento dell'RNA e la spettrometria di massa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

Le risposte rapide che coinvolgono una rapida ridistribuzione del messaggero (m) RNA e le alterazioni della traduzione dell'mRNA sono pertinenti agli aggiustamenti omeostatici in corso delle cellule. Questi aggiustamenti sono fondamentali per la sopravvivenza delle cellule eucariotiche e il "controllo dei danni" durante i livelli fluttuanti di nutrienti e salinità, la temperatura e vari stress chimici e di radiazione. A causa della natura altamente dinamica delle risposte a livello di RNA e dell'instabilità di molti degli intermedi RNA:RNA e RNA:proteina, ottenere un'istantanea significativa dello stato dell'RNA citoplasmatico è possibile solo con un numero limitato di metodi. Gli esperimenti di tipo ribosoma a livello di trascrittoma e basati su RNA-seq sono tra le fonti di dati più informative per il controllo della traduzione. Tuttavia, l'assenza di una stabilizzazione intermedia uniforme di RNA e RNA:proteina può portare a diversi pregiudizi, in particolare nelle vie di risposta cellulare frenetiche. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato di fissazione rapida applicabile alle cellule eucariotiche di diversa permeabilità, per aiutare nella stabilizzazione intermedia di RNA e RNA: proteina. Forniamo inoltre esempi di isolamento dei complessi RNA:proteina stabilizzati in base alla loro co-sedimentazione con frazioni ribosomiali e poli(ribo)somali. Il materiale stabilizzato separato può essere successivamente utilizzato come parte di esperimenti di tipo ribosoma, come nell'approccio tcp-seq (Translation Complex Profile sequencing) e nei suoi derivati. La versatilità dei metodi in stile TCP-seq è stata ora dimostrata dalle applicazioni in una varietà di organismi e tipi di cellule. I complessi stabilizzati possono anche essere ulteriormente purificati per affinità e ripresi utilizzando la microscopia elettronica, separati in diverse frazioni poli(ribo)somali e sottoposti a sequenziamento dell'RNA, grazie alla facilità dell'inversione del reticolo. Pertanto, i metodi basati sullo snap-chilling e sulla fissazione della formaldeide, seguiti dall'arricchimento del complesso RNA:protein basato sulla sedimentazione o su un altro tipo di arricchimento del complesso RNA:protein, possono essere di particolare interesse nello studio di dettagli più fini della dinamica rapida del complesso RNA:protein nelle cellule vive.

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Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Presentiamo una tecnica per stabilizzare rapidamente complessi traslazionali (biosintesi proteica) con reticolazione di formaldeide in cellule di lievito vivo e di mammifero. L'approccio consente di sezionare intermedi transitori e interazioni dinamiche RNA:proteina. I complessi reticolati possono essere utilizzati in molteplici applicazioni a valle come nei metodi di profilazione basati sul sequenziamento profondo, nella microscopia e nella spettrometria di massa.

Rapida fissazione in vivo e isolamento dei complessi traslazionali dalle cellule eucariotiche

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Il flusso di lavoro consiste nella crescita di cellule in condizioni ambientali rigorosamente controllate, raffreddandole rapidamente utilizzando acqua di fusione / ghiaccio e fissandole con concentrazione pre-ottimizzata di formaldeide e tempo di incubazione. La reazione di fissazione viene quindi estinta utilizzando l'eccesso di composti contenenti gruppi amminici primari, come glicina o tripsi. Le cellule vengono raccolte, lavate e possono essere conservate congelate.Le cellule fisse possono essere lisate meccanicamente o chimicamente e il lisato viene utilizzato per la separazione delle frazioni ribosomiali in base alle loro dimensioni molecolari, proprietà di sedimentazione o marcatori di affinità. L'approccio si traduce in materiale versatile utilizzabile per la purificazione e il rilevamento immunoassistituzione, l'arricchimento di complessi contenenti fattori specifici in microscopia elettronica. Dopo il blocco profondo reticolato, l'amplificazione dell'RNA o le analisi basate sull'ibridazione, il sequenziamento dell'RNA e la spettrometria di massa diventano possibili.Impostare una coltura di lievito da un litro in uno shaker orbitale con una densità ottica iniziale non superiore a 0,05 unità di assorbanza a 600 nanometri e utilizzare peptone e destrosio a 30 gradi Celsius. Impostare una centrifuga preparativa con rotore compatibile e bottiglie centrifughe per pellettizzare la sospensione liquida di cellule di lievito a 5000 G a quattro gradi Celsius. Tenere traccia della densità ottica delle cellule in crescita.Deve essere compreso tra 0,6 e 0,8 unità di assorbanza e 600 nanometri al momento della raccolta se la fase di crescita esponenziale è di interesse. Una volta che le celle sono pronte, installa una ghiacciaia all'interno della cappa dei fumi chimici con un fornaio contenente 250 grammi di ghiaccio d'acqua tritato pulito e mostra anche 25 millilitri di tripsina e soluzione di metanolo stabilizzato al 37% di formaldeide all'interno della cappa. Versare l'ultima coltura cellulare nel fornaio contenente il ghiaccio.Quindi aggiungere 75 millilitri di formaldeide al 37% a una concentrazione finale del 2,2% di peso sul volume mescolare intensamente la miscela fino a quando il ghiaccio si scioglie. Una volta sciolto il ghiaccio, impostare un timer per 10 minuti Dopo l'incubazione per 10 minuti, trasferire la coltura nelle bottiglie della centrifuga pre-raffreddate e pellettizzare le celle mediante centrifugazione a quattro gradi Celsius, 5000 G per cinque minuti. Mentre lo spin è, pre-raffreddare un tubo da 50 millilitri e mantenere il tampone A appena preparato contenente glicina per neutralizzare l'eventuale formaldeide rimanente sul ghiaccio.Dopo la centrifugazione, posizionare i tubi della centrifuga sul ghiaccio con il lato pellet a contatto con il ghiaccio. Portare i tubi nella cappa aspirante e gettare il surnatante in un contenitore per rifiuti di formaldeide. Sospendere nuovamente il pellet di cella da vecchi tubi in 20 millilitri di tampone A utilizzando una stripette da 25 millilitri e trasferendolo in un tubo da 50 millilitri.Portare il volume a 40 millilitri con tampone A e raccogliere le celle di lavaggio mediante centrifugazione di quattro gradi Celsius, 5000 G per cinque minuti. Scartare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in un tampone da 40 millilitri A, che è il tampone A non contenente glicina per rimuovere la contaminazione da glicina. Pellet le celle di nuovo per centrifugazione a quattro gradi Celsius, 5000 G cinque minuti.Ripetere i lavaggi con buffer A uno, ancora una volta. Scartare il surnatante e posizionare il pellet cellulare sul ghiaccio. Pesare il tubo con il pellet, la massa delle cellule umide dovrebbe essere di circa un grammo per un litro della coltura cellulare.Riempire il polistirolo dalla scatola rivestita con un foglio di alluminio con azoto liquido ad una profondità di circa tre centimetri. Posizionare a 50 millilitri tubo in posizione verticale nella scatola. Sospendere nuovamente il pellet in 550 microlitri di tampone A due mediante pipettaggio e vortice per 10 secondi.Aggiungere 10 microlitri di 40 unità per microlitro inibitore della RNasi e vortice di nuovo per 10 secondi. Utilizzando una pipetta da un millilitro, gocciolare la sospensione cellulare nei due 50 millilitri contenenti l'azoto liquido. Per prepararsi al passo successivo, pre-raffreddare tubi liberi da nucleo da 1,5 millilitri su ghiaccio secco e barattoli di macinazione in acciaio inossidabile da 10 millilitri.Trasferire le goccioline di sospensione cellulare congelate nei barattoli utilizzando una spatola sterile pulita. Immergere i barattoli di macinazione in azoto liquido per un minuto, assicurandosi che la fase liquida rimanga sopra la giunzione. Installare un mulino di miscelazione Cryo a 27 Hertz per l'agitazione per un minuto.Agitare i barattoli di macinazione sigillati a 27 Hertz per un minuto nel mulino miscelatore. Raffreddare nuovamente i barattoli in azoto liquido come prima e agitare ulteriormente per un minuto. Trasferire i barattoli nella ghiacciaia contenente ghiaccio secco insieme ai tubi liberi dal nucleo da 1,5 millilitri.Utilizzando una piccola spatola in acciaio trasferire i risultati in data di macinazione imbottita nei tubi. Quindi conservare i tubi a meno 80 gradi Celsius. In due palloni T175 crescono 293 cellule HEK al 60-70% di confluenza e il mezzo Eagle modificato di Dalbeko e il siero bovino fetale al 10% a 37 gradi e il 5% di anidride carbonica.Almeno tre ore prima del tempo di fissaggio desiderato, sostituire il supporto del pallone T175 con esattamente 30 millilitri di supporti completi preriscaldati. Preparare una ghiacciaia fino all'orlo con ghiaccio d'acqua frantumato e tenere nella cappa aspirante insieme ai buffer richiesti, anche un ghiaccio. Per raffreddare a scatto le celle, rimuovere il pallone T175 dall'incubatore e premerlo formalmente contro il ghiaccio assicurando il massimo contatto superficiale.All'interno di una cappa chimica, inclinare il pallone su un lato in modo che il supporto si raccolga sul lato opposto alle celle. Pipetta 168 microlitri del 37% pesati in volume formaldeide direttamente nel mezzo in pool. Dando una concentrazione finale di 0,2% di formaldeide.Mescolare immediatamente. Incubare i palloni su ghiaccio per altri 10 minuti. Versare il supporto in un contenitore di rifiuti appropriato attraverso il lato del pallone opposto alle celle.Usando uno strippete, pipetta in 30 millilitri di fosfato di Dalbeko tamponato soluzione salina senza ioni calcio e magnesio e contenente inoltre 50 millimolari glicina delicatamente sul lato opposto alle cellule. Mescolare dondolando il pallone, riportare il flash in posizione orizzontale e incubare per altri 10 minuti sul ghiaccio. Versare la soluzione attraverso il lato del matraccio opposto alla cella e aggiungere delicatamente sette millilitri di soluzione standard di TRIPSINA EDTA allo 0,25% per staccare e sospendere nuovamente le cellule.Incubare il pallone a temperatura ambiente per cinque, al massimo 10 minuti. Posizionare il pallone verticalmente e utilizzando uno strippete, raccogliere le celle staccate lavando delicatamente eventuali residui dalle pareti del pallone e trasferire la sospensione in un tubo da 50 millilitri posto sul ghiaccio. Integrare immediatamente la soluzione di sospensione raccolta con 20 millilitri di materiale completo e mescolare capovolgendo delicatamente il tubo.Pellet le celle centrifugando il tubo a 100 G per cinque minuti e quattro gradi Celsius. Il pellet cellulare deve essere chiaramente visibile. Versare il fluido e sospendere delicatamente il pellet in 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato di Dalbeko senza glicina.Centrifugare nuovamente il tubo a 100 G per cinque minuti e a quattro gradi Celsius Versare il tampone di lavaggio e risospendere il pellet in 800 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato di Dalbeko ghiacciato senza glicina, ma contenente ioni magnesio e calcio. Trasferire le cellule ri-sospese in un nuovo tubo micro centrifugo da 1,5 millilitri a basso legame proteico. Centrifugare il tubo a 100 G per tre minuti a quattro gradi Celsius.Scartare con attenzione il surnatante usando un pipetter da un millilitro. In questa fase, il pellet cellulare può essere congelato a meno 80 gradi Celsius o procedere alla fase di lisi cellulare. In un armadio di biosicurezza aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi a base di detergente non ionico e non denaturante e sette microlitri di inibitore dell'arginasi e mescolare bene mediante pipettaggio con una punta di millilitro.Fissare con attenzione un ago calibro 25 a una siringa da uno a tre millilitri e pipettare vigorosamente la miscela utilizzando almeno sette prese lente verso l'alto e corse di scarico veloci verso il basso. Gettare la siringa e l'ago nel cestino del tagliente e ripetere la procedura con un ago calibro 31 e una siringa da 0,3 millilitri. Gettare la siringa e l'ago nel cestino del tagliente.Centrifugare il tubo a 12.000 G per cinque minuti a quattro gradi per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo micro centrifugo da 1,5 millilitri a basso legame proteico. Conservare sia i detriti cellulari che il lisato a meno 80 gradi Celsius.I complessi traslazionali sono sensibili alla composizione ionica dei buffer. L'omissione di cloruro di magnesio e l'aggiunta di EDTA hanno abrogato elevate proprietà di sedimentazione e, mentre il cloruro di calcio ha portato a picchi di risultati migliori, il miglioramento è stato marginale. Abbiamo quindi selezionato il buffer uno.Il 2,2% peso per volume di formaldeide ha preservato in modo eccellente i polisomi e non ha diminuito la resa complessiva rispetto al 4% peso per volume di formaldeide. Nelle cellule di mammifero è stata utilizzata una concentrazione molto più bassa di formaldeide dello 0,2% in peso in volume. Poiché concentrazioni più elevate hanno comportato una sostanziale perdita di materiale poliribosomico.15 EDTA millimolari aggiunti al lisato e tutti i tamponi successivi hanno mostrato un effetto destabilizzante nettamente minore sulle frazioni polisomiali, derivate dalle cellule fisse. E questo effetto è stato parzialmente replicato con EDTA 50 millimolari con materiale da celle fisse al 4%, resistendo, dispiegandosi meglio. L'esaurimento del glucosio provoca uno degli effetti inibitori traslazionali più drammatici e rapidi sul lievito.Sia il nervo aggiunto che le condizioni di causa locale indotte lo smontaggio del polisoma era leggermente, ma evidentemente più polisomi trattenuti in basso glucosio aggiunto. È importante sottolineare che il materiale polisomiale delle cellule fisse dimostra un'elevata distinzione tra le cellule affamate e non affamate, indicando l'idoneità della fissazione della formaldeide a preservare le differenze nei processi traslazionali dinamici. In approcci come il tacy paysake, può essere ulteriormente perspicace rimuovere piccole subunità ribosomiali che non si integrano bene con i rizomi completi per i quali abbiamo impiegato un'ultracentrifugazione a due stadi, consentendo l'isolamento di SSU, LSU, RS, diazomi resistenti alla RNasi, DS e polisomi di alto ordine confermati dalla microscopia elettronica delle frazioni fisse.Rispetto alle cellule non fisse, il materiale delle cellule fisse ha dimostrato un'elevata presenza di eIF4A labile nelle frazioni ribosomiali a sedimentazione più rapida. Utilizzando materiale fisso dal ceppo di tapi eIF4A per catturare e arricchire eIF4A contenente complessi con perline IDG magnetiche, siamo stati in grado di osservare l'arricchimento selettivo dell'eIF4A rispetto alla beta-actina in SSU e RS, ma non le frazioni LSU dal secondo gradiente dopo RNasi uno smontaggio. Rispetto ad altri metodi di riposo traslazionale, la rapidità dell'azione della formaldeide attraverso le membrane cellulari e la natura indiscriminata dei legami incrociati promettono la conservazione della massima diversità degli intermedi complessi di traduzione.I nostri risultati conformano l'usabilità della rapida fissazione della formaldeide per stabilizzare complessi altamente transitori e dimostrano l'utilità negli scenari di risposte cellulari rapide ai cambiamenti ambientali o alle condizioni di stress.

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Biology

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

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