Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
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この研究は、オーストラリア研究評議会ディスカバリープロジェクト助成金(T.P.とN.E.S.へのDP180100111)、国立保健医療研究評議会調査官グラント(GNT1175388 to N.E.S.)、研究フェローシップ(APP1135928からT.P.)によって支援されました。著者らは、オーストラリア国立大学先端顕微鏡センター(大学と連邦政府が資金を提供する施設)の顕微鏡検査施設を認めている。

著者らは利益相反を宣言しない。

ホルムアルデヒド固定は生体分子10、36、45、46、47、48の急速な生体架橋を達成する便利で一般的な方法である。他の潜在的な生体分子標的と比較して、翻訳複合体の捕獲に成功すると、細胞または他の物質のスナップ冷却中に即時固定が必要となる。遅延のない安定化がなければ、異なる翻訳関連プロセスが継続する可能性があり、複雑な分布をインビボ状態49の非摂動から遠ざける。翻訳的逮捕およびリボソーム複合体安定化の他の方法と比較して、細胞膜を横切るホルムアルデヒド作用の迅速性および架橋の無差別な性質は、それらのネイティブ分布状態50に近い翻訳複合体中間体の最大多様性の最大の多様性の保存を約束する。
ここで提示されるアプローチは、酵母細胞と哺乳類細胞の両方で確立され、最適化されており、脊椎動物全体(例えば、ゼブラフィッシュ胚)10、38、39、49、51、52など、より多様な生物学的材料にわたって使用するための他のグループによって得られた方法が現在あります.これらの作品は、アプローチの汎用性と幅広い適用性を一括して安心させるが、翻訳複合体の急速ホルムアルデヒド架橋は、最適化と調整の必要性のために新しいタイプの生物学的材料に転置することがやや困難であると考えることができる。
この方法の成功に対する最も重要な要件は、ホルムアルデヒドの濃度と細胞の収集と破壊技術の再最適化です。より少ない透過性、小および丸い酵母細胞は、固定細胞のホルムアルデヒド濃度および物理的破壊をはるかに高く(少なくとも10倍)必要とする。対照的に、培養中の大きく平坦化された付着性哺乳類細胞は、容易に過固定することができ、固定時に穏やかな取り扱いを必要とし、固定複合体の抽出は、洗剤を使用して膜破壊で化学的に行うことができる。架橋の下で、安定性が低い、または短命の中間体が解別したり、後の状態に漏れたりすることがあります。オーバー架橋は、リボソーム分画を分離して研究する能力に悪影響を及ぼし、重い複合体のより深い枯渇などの選択的バイアスを作成することができます。我々の観察では、使用される付着性ヒト細胞の種類のようなわずかな変化でさえ、回収された架橋複合体の収量に影響を与え、架橋レジメンの再最適化を必要とする可能性がある。また、植物細胞のような透過性特性が大きく異なる細胞は、固定条件52の追加の広範な最適化を必要とすることを予想することができます。しかし、このアプローチと完全に相容れない生物学的材料の一種を想像することは困難です。
哺乳類固定プロトコルに関連する1つの考慮事項は、入力として使用される細胞材料の密度および量である。細胞翻訳力学に対する外部の影響を避けるために、少なくとも2日間、再播種やその他の摂動を行うことなく、細胞を継続的に増殖させることが推奨されます。ほとんどの細胞タイプに適用されますが、接着細胞の大半は一貫して70%以下の合流レベルを達成することで、翻訳速度に悪影響を及ぼし、予測不可能な影響を及ぼす可能性のある主要な接触阻害効果がないことが保証されます。
無差別反応性に起因するホルムアルデヒド固定のもう一つの興味深く、潜在的にユニークな便利な特徴は、混合分類の系における翻訳複合体に対する安定化効果である。細菌、さらにミトコンドリア、葉芽細胞および異なる細胞内寄生虫の翻訳複合体は、特定の翻訳阻害剤で標的にすることは悪名高い困難であった。これに対し、TCP-seqデータでは、マイトトランスクリプトームへのフットプリントマッピングは、データ38、39、50で容易に観察可能である。興味深いその後の開発は、信頼性の高い迅速な翻訳逮捕と他の手段との複雑な安定化が問題となる土壌、水または腸のサンプルなど、マイクロコミュニティ全体の翻訳を調査するアプローチの使用である可能性があります。
また、最も複雑な材料(硬質組織やかさばる組織など)では、細胞破壊や材料の均質化時にすぐにホルムアルデヒド安定化の使用を妨げるものは何もないことも言及する必要があります。このアプローチは、特定の低分子阻害剤33、53、54、55で翻訳複合体を安定化させる場合の細胞の進入遅延を除去するために既に頻繁に採用されている。ホルムアルデヒド固定は、電子顕微鏡法45、56、57、58などの用途におけるex vivo/in vitroサンプル安定化に優れた結果を従来使用されてきたことを考えると、この場合、特に完全に固定された細胞からの翻訳複合体の抽出不良に関連するものは、さらに少ない負の影響が期待できます。
我々の知見は、eIF4Aを含むような非常に一過性の複合体を安定化させる急速ホルムアルデヒド固定のユーザビリティを確認する。哺乳類とは対照的に、酵母eIF4Aはキャップ結合複合体eIF4Fとはるかに弱く関連しており、その結果、一般的に翻訳複合体が関連していることは注目に値する。eIF4Aは、通常、酵母29、59、60、61、62、63のリボソーム材料の広範な精製中に失われます。しかし、生体内固定酵母材料では、その存在が予想される翻訳複合体のすべての画分においてeIF4Aの信頼性の高い濃縮を達成することが可能である。以前に公開されたSel-TCP-seqデータは、リボソームとより強く関連するeIF2およびeIF3の濃縮を実証した(しかし、一過性に発生する共翻訳タンパク質複合体集合体も明らかにした)39。したがって、この方法は、両方の、翻訳複合体の結合された成分の強く、弱いの両方の検出に適している。
要約すると、翻訳開始段階で起こる変化や、mRNA上でのリボソーム分布が最小限に摂動される場合に、主に洞察を得るのに役立つアプローチを提示しました。重要なことに、このアプローチは、eIF4Aのようなトランスレーショナル複合体の比較的不安定で動的な成分の安定化に適しており、必要な最適化に広く使用することができます。また、翻訳の急速な動的変化のシナリオにおけるホルムアルデヒド固定の有用性の証拠を提供し、環境変化やストレス状態に対するペースの速い細胞応答などの調査領域を開いた。

生物は寿命を通じて動的な細胞内および細胞外の変化を受け、恒常性を維持し生存を確保するために迅速な応答を必要とする。環境適応を可能にするために、真核細胞は遺伝子発現制御を通じて代謝を調節する。遺伝子発現制御は、転写および/または翻訳中に行うことができます。一般に、1、2、3、4が急速に発生する翻訳応答を伴う。例えば、トランスレーショナル変化は通常、ストレス発症から1〜30分以内に起こり、転写レベルの変化はストレス暴露3、4、5の数時間後に続く。翻訳出力への変化は、細胞質におけるメッセンジャー(m)RNA分子の持続性の可用性により、より迅速に達成される。逆に、転写レベルでは、新しいmRNA分子を合成する必要があり、真核生物では、処理および核からの輸出、応答時間2、4、6、7、8に広範な遅延を生じさせる。
ストレスに対する急性翻訳応答は、一般的に、細胞生存に必要なタンパク質の選択的アップレギュレーションを伴う、翻訳出力の全体的な減少によって特徴付けられる1,3,4,9.タンパク質の生産量を減らすことは、プロセスの高いエネルギー費のために重要であると考えられています3,7.選択的阻害およびアップレギュレーションを促進するために、翻訳応答は複雑な調節メカニズムの範囲によって提供される。翻訳のすべての段階で規制を発揮することができます:開始、伸長、ポリペプチド生合成の終了およびリボソームリサイクル10,11,12,13が、開始段階で最も強く示されるが、5,7,9,10,13.開始中、真核開始因子(eIF)に助け子の小さなリボソームサブユニット(SSU)が結合し、開始コドンが認識されるまでmRNAの5'未翻訳領域(UTR)をスキャンする2,5,6,8,11,12,13.規制メカニズムは、アタッチメント、スキャン、コドン認識の開始に影響を及ぼす eIF をターゲットにすることが多い。例えば、開始因子eIF2は、開始者Met-tRNAの採用を支援する必須の翻訳因子であるiMet SSUに、しばしばストレス状態下で真核生物の標的にされる4,6,11.酵母では、この因子のリン酸化は、栄養欠乏と浸透ストレスの下で誘発され得る1,4,11,14,15、哺乳動物細胞では、アミノ酸飢餓、小胞体(ER)ストレス、UVストレス、ウイルス感染、および酸素レベルの変化がこの応答を引き起こす可能性がある8,9,11.特定のmRNA翻訳の急速なアップレギュレーションは、低酸素症に対する哺乳類細胞応答において明らかであり、これは低酸素誘導因子(IIF)生合成の世界的な急速な翻訳阻害および選択的アップレギュレーションを示す。IIFは転写因子であり、DNA転写レベルで長期的な細胞リプログラミングを引き出す8,9,16.熱ストレス下の酵母でも同様の反応が観察されており、熱ショックタンパク質(HSP)の迅速な翻訳発現に続いて転写レベルの応答が遅れている17,18.栄養不足や熱ショックに加えて、酵母の翻訳応答は様々な酸素の下で研究されています8,19塩分5、リン酸、硫黄20,21 と窒素22,23 レベル。この研究は、ベーキングや発酵などの酵母の産業用途に広く影響を及ぼします。24,25.翻訳応答は、酸化ストレスなどの細胞内ストレスを特徴とする神経変性疾患や心臓病などの疾患の理解を深めるのにも役立つ可能性があります。全体として、翻訳応答は遺伝子発現制御に不可欠であり、真核生物の幅広いストレス状態への迅速な適応を促進します。
翻訳応答を研究するためには、翻訳ランドスケープの歪みが最小限のスナップショットを提供する方法が必要です。ポリソームプロファイリングは、mRNA間の翻訳の研究で使用される古典的なアプローチであり、ショ糖勾配26、27を介した超遠心分離によるmRNAのポリ(リボ)ソマル分画の分離を含む。このアプローチは、個々のmRNA(逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応、RT-PCR26などの検出方法を用いた)またはハイスループット技術(マイクロアレイまたはRNA-seq28,29)と組み合わせて、全体的に翻訳のレベルを探索するために使用することができる。より進化したアプローチはリボソームプロファイリングであり、ゲノムワイドスケールでmRNA分子に沿ってリボソームを細長くする位置の研究と、トランスクリプトーム全体の翻訳の効率の推論と、主要および代替開始部位30、31の利用を可能にする。リボソームプロファイリングは、それらの上にリボソーム存在によって保護されたmRNA断片の分離およびシーケンシングを伴う。リボソームプロファイリングは、低酸素ストレス、熱ショックおよび酸化ストレス31、32を含む多くの条件にわたる翻訳力学に関するかなりの洞察を提供してきた。この技術は、酵母および哺乳類細胞を含む複数のソース物質タイプに適応されている。
ポリソームおよびリボソームプロファイリングは翻訳研究の能力を拡張する上で基本的なものであり、翻訳のプロセスには、これらの方法11,13では捕捉が困難な様々な翻訳中間体および複合体が含まれる。その他の制限は、翻訳複合体が特定の翻訳阻害剤(抗生物質)の添加によって生体内で安定化されるか、特定のリボソーム分布アーティファクト、または細胞リシス(抗生物質)または非特異的(高塩またはマグネシウムイオン)に対するex vivoに至るまで、迅速な応答タイプを研究する能力の欠如に起因し、短命またはより安定でない中間体の剥奪につながる。 34、35。
ホルムアルデヒドは、クロマチン免疫沈降(ChIP)や架橋免疫沈降(CLIP)研究などで核酸やタンパク質を架橋するために広く使用されています。その小さなサイズと優れた細胞透過性は、迅速なin vivoアクション36を可能にします。急速ホルムアルデヒド架橋に基づいて、リボソームプロファイリングアプローチは、変換複合体プロファイルシーケンシング(TCP-seq)10、36、37、38、39、40で拡張されました。酵母で最初に開発されたTCP-seqは、走査または終了後のSSU複合体および複数のリボソーム構成37、38、41、42を含むすべての翻訳中間体の捕獲を可能にする。この方法は、翻訳阻害剤とホルムアルデヒド架橋の両方の組み合わせアプローチを使用して翻訳の逮捕を容易にするために、いくつかの研究10、38、39、41、42で利用されています。更なる修飾バージョンの技術である選択的TCP-seq39は、架橋複合体の免疫精製を含む、TCP-seqアプリケーションの範囲を広げるため最近採用されている。ホルムアルデヒド架橋の迅速で効率的で可逆的な性質により、これらのアプローチは、特に非常に動的な翻訳レベルの応答経路の文脈において、一過性のmRNA:翻訳複雑な相互作用を研究するのに適しています。
包括的な翻訳複合体安定化と分離を目的とした in vivo ホルムアルデヒド架橋のプロセスを詳述する。酵母細胞と哺乳類細胞に対して、別々のプロトコルを提供しています(図1)。我々はさらに、その後の架橋安定化材料(図1)の使用例を概説し、免疫ブロット法(ウェスタンブロッティング)を用いた共精製タンパク質因子検出、免疫支援精製(または「免疫沈降」)IP)と、対象とする特定の因子を含む翻訳複合体の濃縮、電子顕微鏡およびRNAシーケンシング。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> 図1: 一般的な実験用セットアップの概要を示す回路図。in vivoのホルムアルデヒド安定化の主なステップは、主要な必要な機器に関する情報によって補足されたフローチャートとして描かれています。RNAのSPRIビーズ精製、RNAシーケンシング、質量分析など、このプロトコルでは採用に成功したが直接カバーされていない例を含む、架橋材料の潜在的な下流用途が概説されている。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

メッセンジャーRNAの迅速な再分配とmRNA翻訳の変化を伴う迅速な応答は、細胞の継続的なホメオスタティック調整に関連しています。これらの調整は、真核細胞の生存性と栄養素や塩分濃度、温度、および様々な化学的および放射線ストレスの変動中に「ダメージコントロール」に不可欠です。RNAレベル応答の非常に動的な性質と、RNA:RNAおよびRNA:タンパク質中間体の多くの不安定性のために、細胞質RNA状態の有意義なスナップショットを得ることは、限られた数の方法でのみ可能です。トランスクリプトーム全体のRNA-seqベースのリボソームプロファイリング型実験は、翻訳制御のための最も有益なデータ源の一つです。しかし、均一なRNAとRNA:タンパク質の中間安定化の欠如は、特にテンポの速い細胞応答経路において異なるバイアスを引き起こす可能性があります。本稿では、RNAとRNA:タンパク質の中間安定化を助けるために、異なる透過性の真核生物細胞に適用可能な迅速な固定の詳細なプロトコルを提供します。さらに、リボソームとポリ(リボ)ソマル画分との共沈下に基づく安定化RNA:タンパク質複合体の分離例を提供します。分離された安定化材料は、その後、翻訳複素プロファイルシーケンシング(TCP-seq)アプローチおよびその誘導体など、リボソームプロファイリング型実験の一部として使用することができます。TCP-seqスタイルの方法の汎用性は、様々な生物および細胞タイプのアプリケーションによって実証されています。安定化された複合体は、架橋反転の容易さのために、電子顕微鏡法を用いてさらに親和性精製および画像化を行い、異なるポリ(リボ)ソマル分画に分離し、RNAシーケンシングを行う。したがって、スナップ冷却およびホルムアルデヒド固定に基づく方法、続いて沈積物ベースまたは他のタイプのRNA:タンパク質複合体濃縮に基づく方法は、生細胞における急速なRNA:タンパク質複合体のダイナミクスのより細かい詳細を調査することに特に関心を持つことができます。

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Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

生きた酵母や哺乳動物細胞におけるホルムアルデヒド架橋を用いた翻訳(タンパク質生合成)複合体を迅速に安定化させる技術を紹介する。このアプローチにより、一過性の中間体と動的RNA:タンパク質相互作用の解剖が可能になります。架橋された複合体は、深いシーケンシングベースのプロファイリング方法、顕微鏡、質量分析など、複数のダウンストリームアプリケーションで使用できます。

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

ワークフローは、厳密に制御された環境条件で細胞を成長させ、融解水/氷を使用して急速に冷却し、ホルムアルデヒドとインキュベーション時間の事前に最適化された濃度で固定します。次いで、グリシンやトリプスなどの過剰な一次アミノ基含有化合物を用いて固定反応を消光する。細胞は回収され、洗浄され、凍結して保存することができる。固定細胞は機械的または化学的に分解することができ、リゾースは分子サイズ、沈積特性または親和性マーカーに基づいてリボソーム画分の分離に使用されます。このアプローチにより、免疫支援精製および検出に使用できる汎用性の高い材料が得られ、電子顕微鏡検査において特定の因子を含む複合体の濃縮が可能になります。架橋深いブロッキング、RNA増幅、ハイブリダイゼーションに基づく分析、RNAシーケンシング、質量分析が可能になります。600ナノメートルで0.05吸光度単位以下の開始光学密度を持つ軌道シェーカーに1リットル酵母培養を設定し、30°Cでペプトンとデキストロース培地を使用します。5000 G の酵母細胞の液体懸濁液を摂氏 4 度でペレット化するための、互換性のあるローターと遠心分離ボトルを備えた先入遠心分離機を設置します。増殖する細胞の光学密度を記録します。指数成長フェーズが目的である場合、収集時には0.6~0.8の吸光度単位と600ナノメートルの間でなければなりません。細胞の準備ができたら、250グラムのきれいな砕いた水氷を含むパン屋と化学煙フードの中にアイスボックスを設置し、25ミリリットルのトリプシンと購入したばかりのメタノール安定37%ホルムアルデヒド溶液をフード内に表示します。氷を含むパン屋に1つの最新の細胞培養物を注ぎます。その後、37%ホルムアルデヒドの75ミリリットルを体積比2.2%重量の最終濃度に加え、氷が溶けるまで混合物を激しくかき混ぜます。氷が溶けたら、10分間タイマーを設定し、10分間インキュベートした後、培養液を予め冷却された遠心分離器瓶に移し、細胞を摂氏4度、5000Gで遠心分離してペレット化する。スピンは、50ミリリットルチューブを事前に冷却し、氷上の残りのホルムアルデヒドを中和するためにグリシンを含む新鮮なバッファーAを維持します。遠心分離機の後、遠心管を氷に接触したペレット側の氷の上に置きます。チューブをヒュームフードに入れ、上清をホルムアルデヒド廃棄物容器に捨てます。25ミリリットルのストリッパーを使用して、50ミリリットルのチューブに移すバッファーAの20ミリリットルで古いチューブから細胞ペレットを再中断します。バッファーAで体積を40ミリリットルにし、摂氏4度、5000Gの摂氏5000Gの遠心分離により洗浄細胞を5分間回収する。上清を捨てて40ミリリットルのバッファーA1に細胞ペレットを再び懸濁させ、グリシン汚染を除去するためにグリシンを含まない緩衝Aである。ペレットは、摂氏4度で遠心分離により再び細胞を、5000G5分。バッファA1で、もう一度、このス述を繰り返します。上清を捨て、細胞ペレットを氷の上に置きます。ペレットでチューブを秤量すると、湿細胞塊は細胞培養の1リットル当たり約1グラムであるべきである。アルミホイルに液体窒素を並べたボックスから約3センチメートルの深さまでポリスチレンを充填します。箱の中に直立して50ミリリットルのチューブに置きます。ペレットを550マイクロリットルのバッファーA2に再懸濁し、10秒間ピペット化し、ボルテックスする。1マイクロリットルRNase阻害剤あたり40単位の10マイクロリットルを加え、再び10秒間ボルテックスを加えます。1ミリリットルのピペットを使用して、液体窒素を含む2つの50ミリリットルに細胞懸濁液を滴下する。次のステップに備えて、ドライアイス上の1.5ミリリットル核フリーチューブと10ミリリットルのステンレススチール研削瓶を事前に冷却します。凍結した細胞懸濁液を清潔な生殖不能ヘラを使用して瓶に移します。粉砕瓶を液体窒素に1分間沈め、液相がジャンクションの上にとどまることを確認します。1分間攪拌のために27ヘルツでクライオミキシングミルを設定します。密封された研削瓶を27ヘルツでミキサーミルで1分間攪拌します。前のように液体窒素で瓶を再冷却し、さらに1分間振ります。1.5ミリリットルの核フリーチューブと一緒にドライアイスを含む氷箱に瓶を移します。小さなスチールスパチュラを使用して、パッド入りのグラインド日付でチューブに結果を移します。その後、マイナス80度でチューブを保存します。2つのT175フラスコでは、HEK 293細胞を60〜70%合流させ、ダルベコの改変イーグル培地と10%の牛血清を37度および5%の二酸化炭素で増殖させる。所望の固定時間の少なくとも3時間前に、T175フラスコの培地を正確に30ミリリットルの完全な媒体を加温して交換する。砕いた水氷で満ちたっまでアイスボックスを準備し、必要なバッファ、また氷と一緒にヒュームフードに保管してください。細胞を冷却するために、インキュベーターからT175フラスコを取り出し、氷に対して正式に押して最大表面接触を確保します。化学煙フードの内側で、フラスコを横に傾け、メディアが細胞の反対側に集まるようにします。ピペット168マイクロリットルの37%は、体積ホルムアルデヒドによってプールされた媒体に直接計量した。0.2%ホルムアルデヒドの最終濃度を与える。すぐに混ぜます。さらに10分間氷の上にフラスコをインキュベートします。細胞とは反対側のフラスコ側を通して適切な廃棄物容器に媒体を注ぎ出す。ストリップピートを使用して、カルシウムとマグネシウムイオンなしでダルベコのリン酸緩衝生理食塩水の30ミリリットルのピペットと、さらに細胞と反対側の側に50ミリモルグリシンを静かに含む。フラスコを揺らすことで混ぜ、フラッシュを水平位置に戻し、氷の上でさらに10分間インキュベートします。細胞の反対側のフラスコ側から溶液を注ぎ、標準的な0.25%トリプシンEDTA溶液の7ミリリットルを静かに加えて、細胞を取り外して再中断します。フラスコを室温で5分間、最大10分間インキュベートします。フラスコを垂直に見つけてストリップピートを使用し、フラスコの壁から残った部分を静かに洗って取り外した細胞を採取し、懸濁液を氷上にセットした50ミリリットルのチューブに移します。回収した懸濁液を20ミリリットルの完全な培地ですぐに補い、チューブを軽くひっくり返して混ぜます。100Gでチューブを5分4度の摂氏で遠心して細胞をペレットにする。細胞ペレットははっきりと見える必要があります。培地を注ぎ、グリシンなしでダルベコのリン酸緩衝生理食塩水の10ミリリットルでペレットを穏やかに再中断します。チューブを再び100 Gで5分間、摂氏4度で洗浄バッファーを注ぎ、氷冷ダルベコのリン酸緩衝生理食塩水の800マイクロリットルにグリシンを含むがマグネシウムとカルシウムイオンを含むペレットを再中断します。再懸濁した細胞を新しい低タンパク質結合1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移す。チューブを摂氏4度で3分間100Gで遠心分離します。1ミリリットルのピペッタを使用して上清を慎重に捨てます。この段階では、細胞ペレットをマイナス80°Cで凍結するか、細胞のリシスステップに進むことができる。バイオセーフティキャビネットでは、非イオン性、非変性洗剤、および7マイクロリットルのアルギネーゼ阻害剤に基づいて300マイクロリットルのライシスバッファーを追加し、1ミリリットルのチップを使用してピペット処理することによってよく混合します。慎重に1〜3ミリリットルの注射器に25ゲージの針を取り付け、少なくとも7つの遅い上向きの摂取量と速い下向きの排気ストロークを使用して混合物を激しくピペットします。注射器と針をシャープのビンに捨て、31ゲージ針と0.3ミリリットルの注射器で手順を繰り返します。注射器と針をシャープのビンに捨てます。チューブを12,000 Gで4度で5分間遠心分離し、細胞の破片を取り除く。上清を新しい低タンパク質結合1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。細胞の破片とライセートの両方をマイナス80°Cで保存します。翻訳複合体は、バッファーのイオン組成に敏感です。塩化マグネシウムの省略とEDTAの添加は高い沈殿特性を示し、塩化カルシウムはより良い結果ピークをもたらしたが、改善は限界であった。こうしてバッファ1を選択しました。2.2%重量分量ホルムアルデヒドは、ポリソームを優れた保存し、体積ホルムアルデヒドによる4%重量と比較して全体的な収率を低下させなかった。哺乳類細胞では、体積で0.2%重量のホルムアルデヒドのはるかに低い濃度が使用された。より高い濃度として、実質的なポリボソーム物質損失をもたらした。15ミリモルEDTAをライセートに添加し、その後のすべての緩衝液は、固定細胞に由来する多染色体画分に対して顕著に少ない不安定化効果を示した。そして、この効果は、4%固定細胞からの材料で50ミリモルEDTAで部分的に複製され、抵抗し、より良く展開した。グルコース枯渇は、酵母に対する最も劇的かつ迅速な翻訳阻害効果の1つを引き出します。神経の追加および局所的に引き起こす状態の両方がわずかにポリソーム分解を誘発したが、明らかに低添加グルコースに保持されるより多いポリソームである。重要なことに、固定細胞からの多染色体物質は、動的移動過程の違いを維持するためのホルムアルデヒド固定の適合性を示す飢餓細胞と非飢餓細胞の間の高い区別を示している。粘着性の支払いなどのアプローチでは、2段階の超遠心分離を採用した完全な根茎とうまく一緒に沈着しない小さなリボソームサブユニットを除去し、SSU、LSU、RS、RNase耐性ジアゾメ、DS、および電子分画によって確認された高次ポリソームの分離を可能にする、さらに洞察力があるかもしれません。非固定細胞と比較して、固定細胞からの物質は、最も速い沈み込みリボソーム画分における不安定性eIF4Aの上昇存在を示した。eIF4Aタピ株の固定材料を使用して、磁気IDGビーズを含む複合体を含むeIF4Aを捕捉し、濃縮し、RNase1分解時の第2勾配からのLSU画分ではなく、SSUおよびRSのβ-actinと比較してeIF4Aの選択的濃縮を観察することができました。他の翻訳残りの方法と比較して、細胞膜を越えたホルムアルデヒド作用の迅速性とクロスリンクの無差別な性質は、翻訳複合体中間体の最大の多様性の保全を約束する。我々の知見は、環境変化やストレス状態に対する急速な細胞応答のシナリオにおける非常に一過性の複合体および証拠の有用性を安定させるために、急速なホルムアルデヒド固定の有用性に適合する。

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Translation: RNA to Protein

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