Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Australian Research Council Discovery Project grant (DP180100111 til T.P. and N.E.S), National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 til N.E.S.) og Research Fellowship (APP1135928 til T.P.). Forfatterne anerkjenner fasilitetene til Microscopy Australia ved Centre for Advanced Microscopy, Australian National University, et anlegg som er finansiert av Universitetet og den føderale regjeringen.

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Formaldehydfiksering er en praktisk og populær metode for å oppnå rask in vivo-krysskobling av biomolekyler10,36,45,46,47,48. Sammenlignet med de andre potensielle biomolekylmålene, krever vellykket fangst av translasjonskomplekser en umiddelbar fiksering under snap-kjøling av cellene eller annet materiale. Uten den ubelagte stabiliseringen er det et potensial for at forskjellige oversettelsesrelaterte prosesser kan fortsette, og flytte den komplekse fordelingen bort fra den uforstyrrede in vivo-tilstanden 49. Sammenlignet med de andre metodene for translasjonell arrestasjon og ribosomal kompleks stabilisering, lover hurtigheten av formaldehydvirkning på tvers av cellemembraner og krysskoblingenes ukritiske natur bevaring av det maksimale mangfoldet av oversettelseskompleksets mellomprodukter nærmere deres opprinnelig distribuerte tilstander50.
Tilnærmingen som presenteres her er etablert og optimalisert i både gjær og pattedyrceller, og metoder er nå avledet av andre grupper for bruk på tvers av mer mangfoldig biologisk materiale, for eksempel i hele vertebrater (f.eks. sebrafiskembryoer)10,38,39,49,51,52 . Selv om disse verkene samlet beroliger allsidigheten og den brede anvendbarheten av tilnærmingen, kan rask formaldehyd krysskobling av oversettelseskomplekser betraktes som noe vanskelig å transponere til nye typer biologisk materiale på grunn av behovet for optimaliseringer og justeringer.
Et fremst krav til metodens suksess er reoptimalisering av konsentrasjonen av formaldehyd og cellesamlings- og forstyrrelsesteknikken. Mindre gjennomtrengelige, små og runde gjærceller krever mye høyere (minst 10 ganger) formaldehydkonsentrasjon og fysisk forstyrrelse av de faste cellene. I kontrast kan store og flate tilhengerpattedyrceller i kulturen lett overfaste og kreve skånsom håndtering ved fiksering, mens utvinningen av de faste kompleksene kan utføres kjemisk med membranforstyrrelser ved hjelp av vaskemidler. Under-crosslinking kan tillate mindre stabile eller mer kortvarige mellomprodukter å dissosiere eller lekke inn i en senere tilstand. Over-crosslinking kan påvirke evnen til å isolere og studere ribosomale fraksjoner negativt og kan skape selektive fordommer som dypere uttømming av tunge komplekser. I vår observasjon kan selv mindre endringer, for eksempel typen tilhenger av menneskelige celler som brukes, påvirke utbyttet av de gjenopprettede krysskoblede kompleksene og kan kreve reoptimalisering av krysskoblingsregimet. Vi kan også forutse at celler med vesentlig forskjellige permeabilitetsegenskaper, for eksempel planteceller, vil kreve ytterligere omfattende optimalisering av fikseringsbetingelsene52. Likevel er det vanskelig å forestille seg en type biologisk materiale som ville være helt uforenlig med tilnærmingen.
En vurdering som er relevant for pattedyrfikseringsprotokollen er tettheten og mengden cellemateriale som brukes som inngang. Det anbefales å la cellene kontinuerlig vokse uten re-seeding eller andre perturbasjoner i minst 2 dager for å unngå ytre påvirkninger på cellulær oversettelsesdynamikk. Gjelder for de fleste celletyper, men for de fleste tilhengerceller som konsekvent oppnås samløpsnivåer på ikke mer enn 70%, vil det sikre fravær av store kontakthemmingseffekter som kan påvirke oversettelsesraten negativt og uforutsigbart.
En annen interessant, og potensielt unikt praktisk, funksjon av formaldehydfiksering som stammer fra dens ukritiske reaktivitet, er stabiliseringseffekten på translasjonskomplekser i systemer med blandet taksonomi. Bakterielle, og enda mer så translasjonelle komplekser av mitokondrier, kloroplaster og forskjellige intracellulære parasitter, har vært notorisk vanskelig å målrette mot med spesifikke oversettelseshemmere. I TCP-seq-dataene er derimot fotavtrykk som tilordnes mitotranscriptomet, lett observerbare i dataene38,39,50. En interessant påfølgende utvikling kan være bruken av tilnærmingen til å undersøke oversettelse i hele mikrokommuniteter, for eksempel i jord-, vann- eller tarmprøver, der pålitelig rask translasjonell arrestasjon og kompleks stabilisering med andre midler ville være problematisk.
Det bør også nevnes at for det mest kompliserte materialet (som hardt og / eller klumpete vev), forhindrer ingenting bruk av formaldehydstabilisering umiddelbart ved celleforstyrrelser og materiell homogenisering. Denne tilnærmingen brukes allerede ofte for å fjerne celleinngangsforsinkelsen når du stabiliserer translasjonskomplekser med spesifikke små molekylhemmere33,53,54,55. Gitt at formaldehydfiksering tradisjonelt har blitt brukt med gode resultater for ex vivo / in vitro prøvestabilisering i applikasjoner som elektronmikroskopi45,56,57,58, kan vi forvente enda mindre negative effekter i dette tilfellet, spesielt de som er forbundet med dårlig utvinning av translasjonskompleksene fra de grundig faste cellene.
Våre funn bekrefter brukervennligheten til rask formaldehydfiksering for å stabilisere svært forbigående komplekser, for eksempel de som inkluderer eIF4A. Det er bemerkelsesverdig at gjær eIF4A i motsetning til pattedyr er mye mer svakt forbundet med hettebindingskomplekset eIF4F og som et resultat oversettelseskomplekser generelt. eIF4A går vanligvis tapt under omfattende rensing av ribosomalt materiale i gjær29,59,60,61,62,63. Likevel, i det in vivo-fastegjærmaterialet, er det mulig å oppnå pålitelig berikelse av eIF4A i alle brøkdeler av oversettelseskomplekser der dets tilstedeværelse ville forventes. De tidligere publiserte Sel-TCP-seq-dataene har vist berikelsen av eIF2 og eIF3 som sterkere forbinder med ribosomene (men også avslørt forbigående forekommende co-translational protein kompleks montering)39. Dermed er metoden egnet for påvisning av både sterkere og svakere tilknyttede bestanddeler av oversettelseskompleksene.
For å oppsummere har vi presentert en tilnærming som er nyttig for å få innsikt først og fremst i endringene som skjer i startfasen av oversettelsen, og når minimalt perturbert ribosomal distribusjon over mRNA er nødvendig. Det er viktig at tilnærmingen er egnet for stabilisering av relativt labile og dynamiske komponenter av translasjonskomplekser, for eksempel eIF4A, og kan brukes bredt utsatt for nødvendige optimaliseringer. Vi har også gitt bevis på nytten av formaldehydfiksering i scenariene for rask dynamisk oversettelsesendring, og åpner opp undersøkelsesområder som raske cellulære responser på miljøendringer eller stressforhold.

Levende organismer er utsatt for dynamiske intra- og ekstracellulære endringer gjennom hele levetiden, noe som krever raske svar for å opprettholde homeostase og sikre overlevelse. For å tillate miljøtilpasning justerer eukaryote celler stoffskiftet via genuttrykkskontroll. Genuttrykkskontroll kan utøves under transkripsjon og/eller oversettelse; oversettelsessvar som vanligvis forekommerraskere 1,2,3,4. For eksempel oppstår translasjonsendringer vanligvis innen 1-30 minutter etter stressde begynnelse, mens endringer på transkripsjonsnivå følger timer etter stresseksponering3,4,5. Endringer i oversettelsesutgangen oppnås raskere på grunn av vedvarende tilgjengelighet av messenger (m) RNA-molekyler i cytoplasma. Omvendt, på transkripsjonsnivå, må nye mRNA-molekyler syntetiseres, og i eukaryoter, behandles og eksporteres fra kjernen, og produserer omfattende forsinkelser i responstiden2,4,6,7,8.
Akutt translasjonell respons på stress er generelt preget av en generell reduksjon i oversettelsesproduksjonen, med selektiv oppregulering av proteiner som er nødvendige for celleoverlevelse1,3,4,9. Å redusere proteinproduksjonsproduksjonen antas å være avgjørende på grunn av den høye energikostnaden i prosessen.3,7. For å lette selektiv hemming og oppregulering, serveres translasjonsresponser av en rekke komplekse regulatoriske mekanismer. Regulering kan utøves på tvers av alle faser av oversettelsen: initiering, forlengelse, avslutning av polypeptidbiosyntese og ribosomal resirkulering10,11,12,13, men er utstilt sterkest i initieringsfasen5,7,9,10,13. Under initiering binder den lille ribosomale underenheten (SSU), assistert av eukaryote initieringsfaktorer (eIFer), til og skanner 5' uoversatt region (UTR) av mRNA til en startkodon gjenkjennes2,5,6,8,11,12,13. Forskriftsmessige mekanismer retter seg ofte mot e-filer som påvirker vedlegg, skanning og start kodongjenkjenning. For eksempel initieringsfaktoren eIF2, en viktig oversettelsesfaktor som hjelper til med rekruttering av en initiativtaker Met-tRNAiMet SSU, er ofte målrettet i eukaryoter under stressforhold4,6,11. I gjær kan fosforylering av denne faktoren induseres under næringsmangel og osmotisk stress1,4,11,14,15, og i pattedyrceller kan aminosyre sult, endoplasmatisk retikulum (ER) stress, UV-stress, virusinfeksjon og endret oksygennivå utløse denne responsen8,9,11. Rask oppregulering av spesifikk mRNA-oversettelse er tydelig i pattedyrcelleresponsen på hypoksi, som viser en global rask oversettelseshemming og selektiv oppregulering av hypoksi-induserbare faktorer (HIFs) biosyntese. HIFer er transkripsjonsfaktorer, som deretter fremkaller langsiktig cellulær omprogrammering på DNA-transkripsjonsnivå8,9,16. Lignende responser har blitt observert i gjær under varmestress, med raskt translasjonsuttrykk av varmesjokkproteiner (HSP-er) etterfulgt av forsinkede transkripsjonsnivåresponser17,18. I tillegg til næringsmangel og varmesjokk har translasjonsresponser i gjær blitt studert under varierende oksygen8,19salinitet5, fosfat, svovel20,21 og nitrogen22,23 Nivåer. Denne forskningen har utbredte implikasjoner for industriell bruk av gjær, som baking og gjæring.24,25. Translasjonelle responser kan også være medvirkende til å fremme forståelse av sykdommer som nevrodegenerative lidelser og hjertesykdom, som er preget av intracellulære påkjenninger som oksidativt stress. Samlet sett er translasjonsresponser integrert i genuttrykkskontrollen og legger til rette for rask tilpasning til et bredt spekter av stressforhold i eukaryote organismer.
For å studere oversettelsessvar kreves det metoder som gir minimalt forvrengte øyeblikksbilder av oversettelseslandskapet. Polysomprofilering er en klassisk tilnærming som brukes i studiet av oversettelse på tvers av mRNA, som involverer separasjon av poly (ribo)somalfraksjoner av mRNA via ultracentrifugation gjennom sukrose gradienter26,27. Tilnærmingen kan brukes til å utforske oversettelsesnivåer for individuelle mRNAer (med deteksjonsmetoder som omvendt transkripsjon og polymerasekjedereaksjon, RT-PCR26), eller globalt i forbindelse med teknikker med høy gjennomstrømning (mikroarray eller RNA-seq28,29). En mer utviklet tilnærming er ribosomprofilering, som tillater studiet av posisjoner av forlengelse av ribosomer langs et mRNA-molekyl i genomomskala, samt inferens av effektivitet av oversettelse på tvers av transkripsjon og utnyttelse av de viktigste og alternative startstedene30,31. Ribosomprofilering innebærer isolering og sekvensering av mRNA-fragmenter beskyttet av ribosomal tilstedeværelse over dem. Ribosomprofilering har gitt betydelig innsikt i oversettelsesdynamikk på tvers av en rekke forhold, inkludert hypoksisk stress, varmesjokk og oksidativt stress31,32. Teknikken er tilpasset flere kildematerialetyper, inkludert gjær og pattedyrceller.
Mens polysom- og ribosomprofilering har vært grunnleggende for å utvide forskningens evner i oversettelse, inkluderer oversettelsesprosessen ulike oversettelsesmessige mellomprodukter og komplekser som er vanskelige å fange opp med disse metodene11,13. En ekstra begrensning stammer fra mangel på evne til å studere raske responstyper, da translasjonskomplekser enten stabiliseres in vivo ved tilsetning av spesifikke oversettelseshemmere (antibiotika), noe som fører til visse ribosomefordelingsartefakter, eller ex vivo på cellelys spesielt (antibiotika) eller uspesifisert (høyt salt eller magnesiumioner), noe som fører til deprivasjon av de kortere levde eller mindre stabile mellomprodukter33, 34,35.
Formaldehyd er mye brukt til å krysslinke nukleinsyrer og proteiner, for eksempel i kromatinimmunoprecipitation (ChIP) og crosslinking immunoprecipitation (CLIP) studier. Den lille størrelsen og utmerket cellegjennomtrengelighet gir mulighet for en rask in vivo-handling 36. Basert på den raske formaldehyd-krysskoblingen er ribosomets profileringsmetode utvidet med Translation Complex Profile Sequencing (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, som først ble utviklet i gjær, gjør det mulig å fange opp alle mellomliggende oversettelser, inkludert skanning eller SSU-komplekser etter avslutning og flere ribosomale konfigurasjoner37,38,41,42. Metoden har blitt brukt i flere studier10,38,39,41,42, hvorav noen bruker en kombinatorisk tilnærming til både oversettelseshemmere og formaldehyd krysskobling for å lette arrestasjonen av oversettelse. En ytterligere modifisert versjon av teknikken, selektiv TCP-seq39, har nylig blitt brukt til å inkludere immunopurifisering av krysskoblede komplekser, noe som utvider omfanget av TCP-seq-applikasjonene. Formaldehyd-krysskoblingens raske, effektive og reversible natur gjør disse tilnærmingene egnet for å studere forbigående mRNA:translation komplekse interaksjoner, spesielt i sammenheng med svært dynamiske responsveier på oversettelsesnivå.
Her beskriver vi prosessene med in vivo formaldehyd crosslinking med det formål å omfattende oversettelseskompleksstabilisering og isolasjon. Vi tilbyr separate protokoller nyansert for gjær og pattedyrceller (Figur 1). Vi skisserer videre eksempler på etterfølgende bruk av krysskoblingstabilisert materiale (figur 1), for eksempel for korenset proteinfaktordeteksjon ved hjelp av immunoblotting (western-blotting), immunassistert rensing (eller 'immunrecipitation'; IP) og berikelse av translasjonskomplekser som inneholder spesifikke faktorer av interesse, elektronmikroskopi og RNA-sekvensering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk som viser en oversikt over det vanlige eksperimentelle oppsettet. Hovedtrinnene i in vivo formaldehydstabilisering av translasjonskomplekser er avbildet som et flytskjema, supplert med informasjon om de viktigste nødvendige instrumentene. Potensielle nedstrømsapplikasjoner av det krysskoblede materialet er skissert, inkludert eksempler som har blitt brukt, men ikke direkte dekket i denne protokollen, for eksempel SPRI-perlerensing av RNA, RNA-sekvensering og massespektrometri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

Raske svar som involverer rask omfordeling av messenger(m)RNA og endringer av mRNA-oversettelse er relevante for pågående homeostatiske justeringer av cellene. Disse justeringene er avgjørende for eukaryotisk celleoverlevelse og "skadekontroll" under varierende nærings- og saltholdighetsnivåer, temperatur og ulike kjemiske og strålingsspenninger. På grunn av den svært dynamiske naturen til RNA-nivåresponsene, og ustabiliteten til mange av RNA: RNA og RNA: protein mellomprodukter, er det bare mulig å oppnå et meningsfullt øyeblikksbilde av den cytoplasmatiske RNA-tilstanden med et begrenset antall metoder. Transkripsjonsomfattende, RNA-seq-baserte ribosomeprofilerings-type eksperimenter er blant de mest informative datakildene for kontroll av oversettelse. Imidlertid kan fravær av en jevn RNA og RNA: protein mellomliggende stabilisering føre til forskjellige skjevheter, spesielt i de fartsfylte cellulære responsveiene. I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll for rask fiksering som gjelder for eukaryote celler med forskjellig permeabilitet, for å hjelpe til med RNA og RNA: protein mellomliggende stabilisering. Vi gir videre eksempler på isolasjon av de stabiliserte RNA:proteinkompleksene basert på deres co-sedimentering med ribosomale og poly (ribo)somale fraksjoner. Det separerte stabiliserte materialet kan senere brukes som en del av ribosomets profilerings-type eksperimenter, for eksempel i Translation Complex Profile sekvensering (TCP-seq) tilnærming og dets derivater. Allsidigheten til TCP-seq-stilmetodene er nå demonstrert av applikasjonene i en rekke organismer og celletyper. De stabiliserte kompleksene kan også i tillegg affinitetsrenses og avbildes ved hjelp av elektronmikroskopi, separert i forskjellige poly(ribo)somale fraksjoner og utsatt for RNA-sekvensering, på grunn av enkel krysskoblings reversering. Derfor kan metoder basert på snap-chilling og formaldehydfiksering, etterfulgt av sedimenteringsbasert eller annen type RNA: proteinkompleksberikelse, være av spesiell interesse i å undersøke finere detaljer om rask RNA: proteinkompleksdynamikk i levende celler.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Vi presenterer en teknikk for raskt å stabilisere translasjonelle (proteinbiosyntese) komplekser med formaldehyd krysskobling i levende gjær og pattedyrceller. Tilnærmingen muliggjør dissekering av forbigående mellomprodukter og dynamiske RNA:proteininteraksjoner. De krysskoblede kompleksene kan brukes i flere nedstrømsapplikasjoner, for eksempel i dype sekvenseringsbaserte profileringsmetoder, mikroskopi og massespektrometri.

Rask in Vivo-fiksering og isolering av translasjonskomplekser fra eukaryote celler

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Arbeidsflyten består av voksende celler under strengt kontrollerte miljøforhold, og kjøler dem raskt ned ved hjelp av smeltende vann / is og fiksering med forhåndsoptimalisert konsentrasjon av formaldehyd og inkubasjonstid. Fikseringsreaksjonen slukkes deretter ved hjelp av overskudd av primære aminogruppeholdige forbindelser, for eksempel glycin eller tryps. Celler samles, vaskes og kan lagres frosset.Faste celler kan være mekanisk eller kjemisk lysed, og lysatet brukes til separasjon av ribosomale fraksjoner basert på deres molekylære størrelse, sedimenteringsegenskaper eller affinitetsmarkører. Tilnærmingen resulterer i allsidig materiale som kan brukes til immunassistert rensing og deteksjon, berikelse av komplekser som inneholder spesifikke faktorer i elektronmikroskopi. Ved krysskoblet dyp blokkering blir RNA-forsterkning eller hybridiseringsbaserte analyser, RNA-sekvensering og massespektrometri mulig.Sett opp en en-liters gjærkultur i en orbital shaker med en start optisk tetthet ikke mer enn 0,05 absorbansenheter ved 600 nanometer og bruk peptone og dextrose media ved 30 grader celsius. Sett opp en forberedende sentrifuge med kompatibel rotor og sentrifugeflasker for pelleting av flytende suspensjon av gjærceller ved 5000 G ved fire grader celsius. Hold oversikt over den optiske tettheten til vekstcellene.Det må være mellom 0,6 og 0,8 absorbansenheter og 600 nanometer på innsamlingstidspunktet hvis den eksponentielle vekstfasen er av interesse. Når cellene er klare, sett opp en isboks inne i den kjemiske avtrekkshetten med en baker som inneholder 250 gram ren knust vannis og viser deg også 25 milliliter trypsin og nykjøpt metanol stabilisert 37% formaldehydløsning inne i hetten. Hell den siste cellekulturen inn i bakeren som inneholder isen.Tilsett deretter 75 milliliter 37% formaldehyd til en endelig konsentrasjon på 2,2% vekt over volum, rør blandingen intenst til isen smelter. Når isen er smeltet, sett opp en timer i 10 minutter Etter inkubering i 10 minutter, overfør kulturen til de forhåndskjølte sentrifugeflaskene og pellet cellene ved sentrifugering ved fire grader celsius, 5000 G i fem minutter. Mens spinnet er, på forkjøl et 50 milliliterrør og hold nylaget buffer A som inneholder glycin for å nøytralisere gjenværende formaldehyd på is.Etter sentrifugering plasserer du sentrifugerørene på isen med pelletssiden i kontakt med isen. Før rørene inn i avtrekkshetten og kast supernatanten i en formaldehydavfallsbeholder. Re-suspendere cellepellet fra gamle rør i 20 milliliter buffer A ved hjelp av en 25 milliliter stripette og overføre til en 50 milliliter rør.Utgjør volumet til 40 milliliter med buffer A og samle vaskecellene ved sentrifugering av fire grader celsius, 5000 G i fem minutter. Kast supernatanten og suspender cellepelletet i 40 milliliterbuffer A, som er buffer A som ikke inneholder glycin for å fjerne glycinforurensning. Pellet cellene igjen ved sentrifugering ved fire grader celsius, 5000 G fem minutter.Gjenta vaskene med buffer A en, en gang til. Kast supernatanten og legg cellepelleten på is. Vei røret med pellets, den våte cellemassen skal være omtrent ett gram per en liter cellekultur.Fyll opp polystyren fra esken foret med aluminiumsfolie med flytende nitrogen til en dybde på omtrent tre centimeter. Plasser på 50 milliliterrør oppreist i esken. Re-suspendere pellet i 550 mikroliter buffer A to ved pipettering og virvel i 10 sekunder.Tilsett 10 mikroliter med 40 enheter per mikroliter RNase-hemmer og virvel igjen i 10 sekunder. Bruk en en milliliter pipette, drypp cellefjæringen inn i 50 milliliter to som inneholder flytende nitrogen. For å forberede seg på neste trinn, forkjøl 1,5 milliliter kjernefrie rør på tørris og 10 milliliter slipeglass i rustfritt stål.Overfør de frosne celleopphengsdråpene i krukkene ved hjelp av en ren steril spatel. Senk slipeglassene ned i flytende nitrogen i ett minutt, og sørg for at væskefasen forblir over krysset. Sett opp en Cryo miksefabrikk på 27 Hertz for agitasjon i ett minutt.Rør de forseglede slipeglassene på 27 Hertz i ett minutt i mikserfabrikken. Avkjøl glassene i flytende nitrogen som før og rist i ett minutt til. Overfør glassene til isboksen som inneholder tørris sammen med de 1,5 milliliterkjernefrie rørene.Ved hjelp av en liten stålspatel overføres resultatene i polstret slipedato inn i rørene. Lagre deretter rørene på minus 80 grader celsius. I to T175 kolber vokser HEK 293 celler til 60 til 70% samløp og Dalbekos modifiserte Eagle medium og 10% foster bovin serum ved 37 grader og 5% karbondioksid.Minst tre timer før ønsket fikseringstid, bytt ut T175-kolben med nøyaktig 30 milliliter forvarmede komplette medier. Forbered en isboks til randen med knust vannis og hold i avtrekkshetten sammen med nødvendige buffere, også en is. For å slå av cellene, fjern T175-kolben fra inkubatoren og trykk den formelt mot isen og sørg for maksimal overflatekontakt.Inne i en kjemisk avtrekkshette vipper du kolben på siden slik at mediet samler seg på siden motsatt av cellene. Pipette 168 mikroliter på 37% veid av volum formaldehyd direkte inn i de samlede mediene. Gir en endelig konsentrasjon på 0,2% formaldehyd.Bland umiddelbart. Inkuber kolbe på is i 10 minutter videre. Hell av mediet i en passende avfallsbeholder gjennom kolbesiden motsatt av cellene.Ved hjelp av en flenta, pipette i 30 milliliter av Dalbekos fosfat bufret saltvann uten kalsium og magnesiumioner og i tillegg inneholder 50 millimolar glycin forsiktig på siden motsatt av cellene. Bland ved å gynge kolben, returner blitsen til horisontal posisjon og inkuber i 10 minutter mer på is. Hell av løsningen gjennom kolbesiden motsatt av cellen og tilsett forsiktig syv milliliter standard 0,25% trypsin EDTA-løsning for å løsne og suspendere cellene på nytt.Inkuber kolben ved romtemperatur i fem, maksimalt 10 minutter. Finn kolben vertikalt og bruk en flåktur, samle de frittliggende cellene ved å forsiktig vaske eventuelle gjenværende fra kolbeveggene og overfør suspensjonen til et 50 milliliterrør satt på is. Suppler straks den oppsamlede fjæringsløsningen med 20 milliliter komplette medier og bland ved å snu røret forsiktig.Pellet cellene ved å sentrifugere røret ved 100 G i fem minutter og fire grader celsius. Cellepellet må være tydelig synlig. Hell av media og re-suspendere pellets forsiktig i 10 milliliter av Dalbekos fosfat bufret saltvann uten glycin.Sentrifuger røret igjen ved 100 G i fem minutter og ved fire grader celsius Hell av vaskebufferen og re-suspender pellet i 800 mikroliter av iskald Dalbekos fosfatbufret saltvann uten glycin, men inneholder magnesium og kalsiumioner. Overfør de re-suspenderte cellene til et nytt lavproteinbindingsrør på 1,5 milliliter mikro sentrifuger. Sentrifuger røret ved 100 G i tre minutter ved fire grader celsius.Kast forsiktig supernatanten ved å bruke en milliliter pipetter. På dette stadiet kan cellepellet fryses ved minus 80 grader celsius eller fortsette til cellelystrinnet. I et biosikkerhetsskap tilsettes 300 mikroliter lysisbuffer basert på ikke-ionisk, ikke-denaturing vaskemiddel, og syv mikroliter arginasehemmer og bland godt ved pipettering ved hjelp av en milliliterspiss.Fest forsiktig en 25 gauge nål til en en til tre milliliter sprøyte og rør blandingen kraftig ved hjelp av minst syv sakte oppadgående inntak og raske nedadgående eksosslag. Kast sprøyten og kanylen i den skarpe beholderen og gjenta prosedyren med en 31 gauge nål og 0,3 milliliter sprøyte. Kast sprøyten og kanylen i den skarpe beholderen.Sentrifuger røret ved 12.000 G i fem minutter ved fire grader for å fjerne celleavfallet. Overfør supernatanten til et nytt lavproteinbindingsrør på 1,5 milliliter mikro sentrifuger. Oppbevar både cellerester og lysat ved minus 80 grader celsius.Translasjonskomplekser er følsomme for bufferens ioniske sammensetning. Utelatthet av magnesiumklorid og tilsetning av EDTA abrogerte høye sedimenteringsegenskaper, og mens kalsiumklorid resulterte i bedre resultattopper, var forbedringen marginal. Vi valgte dermed buffer 1.2,2% vekt etter volum formaldehyd utmerket bevart polysomene og reduserte ikke det totale utbyttet sammenlignet med 4% vekt etter volum formaldehyd. I pattedyrceller ble det brukt en mye lavere konsentrasjon av formaldehyd på 0,2% vekt etter volum. Ettersom høyere konsentrasjoner resulterte i betydelig polyribosomalt materialtap.15 millimolar EDTA lagt til lysatet og alle påfølgende buffere viste karakteristisk mindre destabiliseringseffekt på polysomale fraksjoner, avledet fra de faste cellene. Og denne effekten ble delvis replikert med 50 millimolar EDTA med materiale fra 4% faste celler, motstår, utfolder seg bedre. Glukoseuttømming fremkaller en av de mest dramatiske og raske translasjonshemmende effektene på gjær.Både nerve tilsatt og lokalt forårsake forhold indusert polysom demontering var litt, men tydeligvis flere polysomer beholdt i lav tilsatt glukose. Det er viktig at polysomalt materiale fra de faste cellene viser et høyt skille mellom de sultne og ikke-sultne cellene som indikerer egnetheten til formaldehydfiksering for å bevare forskjeller i dynamiske oversettelsesprosesser. I tilnærminger som tacy paysake, kan det i tillegg være innsiktsfullt å fjerne små ribosomale underenheter som ikke samvirker godt med de komplette rhizomene som vi brukte en to-trinns ultracentrifugation, slik at isolasjonen av SSU, LSU, RS, RNase-resistente diazomer, DS og høy ordens polysomer bekreftet av elektronmikroskopi av de faste fraksjonene.Sammenlignet med de ikke-faste cellene, viste materiale fra de faste cellene forhøyet tilstedeværelse av labile eIF4A i de raskeste sedimenterende ribosomale fraksjonene. Ved hjelp av fast materiale fra eIF4A tapi-stammen for å fange og berike eIF4A som inneholder komplekser med magnetiske IDG-perler, kunne vi observere selektiv berikelse av eIF4A sammenlignet med beta-aktin i SSU og RS, men ikke LSU-fraksjoner fra den andre gradienten på RNase en demontering. Sammenlignet med andre metoder for translasjonell hvile, lover hurtigheten av formaldehydvirkning på tvers av cellemembraner og den ukritiske karakteren av krysskoblinger bevaring av det maksimale mangfoldet av oversettelseskomplekser.Våre funn samsvarer med brukervennligheten til rask formaldehydfiksering for å stabilisere svært forbigående komplekser og beviss nytte i scenariene for raske cellulære responser på miljøendringer eller stressforhold.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Etablering av Mikrobielle Eukaryote berikelse kulturer fra en kjemisk Stratifisert Antarktis Lake og vurdering av Carbon Fiksering Potential

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosome Innbundne begynnende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; For å identifisere translasjonelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv og Rapid Isolering av tidlig stadium embryo fra<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frø

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifisering av Post-translasjonell Modifikasjoner av Plant Protein komplekser

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

En In vivo Crosslinking Approach å isolere protein komplekser Fra Drosophila Embryo

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolasjon og Funksjonell analyse av Mitokondrier fra dyrkede celler og mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Genome-wide Rensing av ekstrakromosomalt sirkulært DNA fra eukaryote celler

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering av nukleinsyrer: En enkel og Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...