Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
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Este trabalho foi apoiado pela bolsa do Australian Research Council Discovery Project (DP18010111 a T.P. e N.E.S), National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 para N.E.S.) e Research Fellowship (APP1135928 a T.P.). Os autores reconhecem as instalações da Microscopia Austrália no Centro de Microscopia Avançada, Universidade Nacional Australiana, uma instalação que é financiada pela Universidade e pelo Governo Federal.

Os autores não declaram conflitos de interesse.

A fixação do formaldeído é um método conveniente e popular de alcançar o cruzamento rápido in vivo de biomoléculas10,36,45,46,47,48. Em comparação com os outros potenciais alvos de biomolécula, a captura bem sucedida de complexos translacionais requer uma fixação imediata durante o snap chilling das células ou outro material. Sem a estabilização inexperiente, há um potencial para que diferentes processos relacionados à tradução continuem, afastando a complexa distribuição do estado in vivo 49não perturbado . Em comparação com os outros métodos de apreensão translacional e estabilização do complexo ribossômico, a rapidez da ação formaldeída entre as membranas celulares e a natureza indiscriminada dos crosslinks prometem a preservação da diversidade máxima dos intermediários do complexo de tradução mais próximos de seus estados nativamente distribuídos50.
A abordagem aqui apresentada foi estabelecida e otimizada em células de levedura e mamíferos, e os métodos foram agora derivados por outros grupos para uso em materiais biológicos mais diversos, como em vertebrados inteiros (por exemplo, embriões de zebrafish)10,38,39,49,51,52 . Embora esses trabalhos tranquilizem coletivamente a versatilidade e a ampla aplicabilidade da abordagem, o cruzamento rápido de formaldeídos de complexos translacionais pode ser considerado um pouco difícil de transpor para novos tipos de material biológico devido à necessidade de otimizações e ajustes.
Um dos principais requisitos para o sucesso do método é a ree otimização da concentração do formaldeído e da técnica de coleta e ruptura celular. Células de leveduras menos permeáveis, pequenas e redondas requerem concentração de formaldeído muito maior (pelo menos, 10 vezes) e interrupção física das células fixas. Em contraste, grandes e achatadas células de mamíferos adeptos na cultura podem ser facilmente superfixadas e requerem manuseio suave após a fixação, enquanto a extração dos complexos fixos pode ser realizada quimicamente com a interrupção da membrana usando detergentes. A sub-ligação pode permitir que intermediários menos estáveis ou mais de curta duração se dissociem ou vazem para um estado posterior. O excesso de ligação pode afetar negativamente a capacidade de isolar e estudar frações ribossômicas e pode criar vieses seletivos, como o esgotamento mais profundo de complexos pesados. Em nossa observação, mesmo pequenas alterações, como o tipo de células humanas aderentes utilizadas, podem afetar o rendimento dos complexos cruzados recuperados e podem exigir a ree otimização do regime de crosslinking. Também podemos prever que células com propriedades de permeabilidade substancialmente diferentes, como células vegetais, exigirão otimização extensiva adicional das condições de fixação52. No entanto, é difícil imaginar um tipo de material biológico que seria totalmente incompatível com a abordagem.
Uma consideração pertinente ao protocolo de fixação de mamíferos é a densidade e quantidade de material celular usado como insumo. Recomenda-se que as células cresçam continuamente sem re-semeadura ou outras perturbações por pelo menos 2 dias para evitar influências externas na dinâmica de tradução celular. Aplicável para a maioria dos tipos de células, mas para a maioria das células aderentes consistentemente alcançou níveis de confluência de não mais de 70% garantirá a ausência de grandes efeitos de inibição de contato que podem afetar negativamente e imprevisívelmente as taxas de tradução.
Outra característica interessante, e potencialmente conveniente, da fixação do formaldeído decorrente de sua reatividade indiscriminada é o efeito de estabilização sobre complexos translacionais em sistemas de taxonomia mista. Os complexos bacterianos, e ainda mais translacionais de mitocôndrias, cloroplastos e diferentes parasitas intracelulares, têm sido notoriamente difíceis de atingir com inibidores específicos de tradução. Em contraste, nos dados TCP-seq, as pegadas mapeando o mitotranscriptome são prontamente observáveis nos dados38,39,50. Um desenvolvimento subsequente interessante poderia ser o uso da abordagem para investigar a tradução em microcommunidades inteiras, como no solo, água ou amostras de intestino, onde a prisão rápida e estabilização complexa confiável com qualquer outro meio seria problemática.
Deve-se mencionar também que para o material mais complicado (como tecidos duros e/ou volumosos), nada impede o uso de estabilização de formaldeído imediatamente após interrupção celular e homogeneização de materiais. Esta abordagem já é frequentemente empregada para remover o atraso de entrada celular ao estabilizar complexos translacionais com inibidores específicos de pequenas moléculas33,53,54,55. Dado que a fixação do formaldeído tem sido tradicionalmente utilizada com excelentes resultados para estabilização de amostras ex vivo/in vitro em aplicações como microscopia eletrônica45,56,57,58, podemos esperar efeitos ainda menos negativos neste caso, particularmente aqueles associados à má extração dos complexos translacionais das células completamente fixas.
Nossos achados confirmam a usabilidade da fixação rápida de formaldeído para estabilizar complexos altamente transitórios, como os que incluem o eIF4A. Vale ressaltar que, ao contrário dos mamíferos, a levedura eIF4A está muito mais fracamente associada com o complexo de ligação de tampa eIF4F e, como resultado, complexos translacionais em geral. eIF4A é geralmente perdido durante qualquer purificação extensiva do material ribossômico na levedura29,59,60,61,62,63. No entanto, no material de levedura in vivofixo, é possível obter enriquecimento confiável do eIF4A em todas as frações de complexos translacionais onde sua presença seria antecipada. Os dados sel-TCP-seq publicados anteriormente demonstraram o enriquecimento do eIF2 e eIF3 que associam mais fortemente com os ribossomos (mas também revelaram o conjunto complexo de proteína co-translacional que ocorre transitoriamente)39. Assim, o método é adequado para a detecção de ambos, constituintes mais fortes e mais fracos ligados dos complexos translacionais.
Resumindo, apresentamos uma abordagem útil para obter insights principalmente sobre as mudanças que ocorrem na fase de início da tradução e quando a distribuição ribossômica minimamente perturbada sobre o mRNA é necessária. É importante ressaltar que a abordagem é adequada para a estabilização de componentes relativamente labíteis e dinâmicos de complexos translacionais, como o eIF4A, e pode ser amplamente submetida às otimizações necessárias. Também fornecemos evidências da utilidade da fixação do formaldeído nos cenários de rápida mudança dinâmica de tradução, abrindo áreas de investigação, como respostas celulares rápidas a mudanças ambientais ou condições de estresse.

Os organismos vivos estão sujeitos a mudanças dinâmicas intra e extracelulares ao longo de suas vidas, que requerem respostas rápidas para manter a homeostase e garantir a sobrevivência. Para permitir a adaptação ambiental, as células eucarióticas ajustam seu metabolismo através do controle da expressão genética. O controle da expressão genética pode ser exercido durante a transcrição e/ou tradução; com respostas translacionais geralmente ocorrendo mais rapidamente1,2,3,4. Por exemplo, as alterações translacionais geralmente surgem dentro de 1-30 minutos do início do estresse, enquanto alterações no nível de transcrição seguem horas após a exposição ao estresse3,4,5. Alterações na produção de tradução são obtidas mais rapidamente devido à persistente disponibilidade de moléculas de mensageiro (m)RNA no citoplasma. Por outro lado, no nível de transcrição, novas moléculas de mRNA devem ser sintetizadas, e em eucariotes, processadas e exportadas do núcleo, produzindo extensos atrasos no tempo de resposta2,4,6,7,8.
A resposta translacional aguda ao estresse é geralmente caracterizada por uma diminuição geral na produção de tradução, com a regulação seletiva das proteínas necessárias para a sobrevivência celular1,3,4,9. A diminuição da produção de proteínas é considerada crucial devido ao alto gasto energético do processo3,7. Para facilitar a inibição seletiva e a regulação, as respostas translacionais são atendidas por uma série de mecanismos regulatórios complexos. A regulação pode ser exercida em todas as fases de tradução: iniciação, alongamento, término da biossíntese de polipeptídeos e reciclagem ribossômica10,11,12,13, mas é exibido mais fortemente na fase de iniciação5,7,9,10,13. Durante a iniciação, a pequena subunidade ribossômica (SSU), auxiliada por fatores de iniciação eucariótica (eIFs), liga-se e escaneia a região não traduzida (UTR) de 5' de mRNA até que um códon inicial seja reconhecido2,5,6,8,11,12,13. Os mecanismos regulatórios geralmente visam os EIFs que afetam o anexo, a digitalização e o início do reconhecimento de codon. Por exemplo, o fator de iniciação eIF2, um fator de tradução essencial que auxilia no recrutamento de um iniciador Met-tRNAiMet para a SSU, é muitas vezes alvo em eucariotes sob condições de estresse4,6,11. Na levedura, a fosforilação desse fator pode ser induzida sob privação de nutrientes e estresse osmótico1,4,11,14,15, e em células de mamíferos, fome de aminoácidos, estresse órticulo endoplasmático (ER), estresse UV, infecção viral e níveis alterados de oxigênio podem desencadear essa resposta8,9,11. A rápida regulação da tradução específica de mRNA é evidente na resposta das células mamíferas à hipóxia, que exibe uma inibição global de tradução rápida e a regulação seletiva da biossíntese de fatores indutores de hipóxia (HIFs). HIFs são fatores de transcrição, que então provocam reprogramação celular a longo prazo no nível de transcrição de DNA8,9,16. Respostas semelhantes têm sido observadas na levedura sob estresse térmico, com rápida expressão translacional de Proteínas de Choque térmico (HSPs) seguidas por respostas atrasadas do nível de transcrição17,18. Além da privação de nutrientes e choque térmico, as respostas translacionais na levedura têm sido estudadas sob oxigênio variado8,19salinidade5, fosfato, enxofre20,21 e nitrogênio22,23 Níveis. Esta pesquisa tem implicações generalizadas para os usos industriais da levedura, como cozimento e fermentação24,25. As respostas translacionais também podem ser fundamentais para promover a compreensão de doenças como distúrbios neurodegenerativos e doenças cardíacas, que são caracterizadas por estresse intracelular, como o estresse oxidativo. No geral, as respostas translacionais são parte integrante do controle da expressão genética e facilitam a rápida adaptação a uma ampla gama de condições de estresse em organismos eucarióticos.
Para estudar respostas translacionais, são necessários métodos que forneçam instantâneos minimamente distorcidos do cenário de tradução. O perfil polimento é uma abordagem clássica utilizada no estudo da tradução através do mRNA, envolvendo a separação de frações de poli(ribo)somal de mRNA via ultracentrifugação através de gradientes de sacarose26,27. A abordagem pode ser usada para explorar níveis de tradução para mRNAs individuais (com os métodos de detecção, como transcrição reversa e reação em cadeia de polimerase, RT-PCR26), ou globalmente em conjunto com técnicas de alta throughput (microarray ou RNA-seq28,29). Uma abordagem mais evoluída é o perfil ribossomo, que permite o estudo de posições de ribossomos alongados ao longo de uma molécula de mRNA em escala de genoma, bem como a inferência da eficiência da tradução através do transcriptome e utilização dos principais e alternativos locais de partida30,31. O perfil ribossomo envolve o isolamento e sequenciamento de fragmentos de mRNA protegidos pela presença ribossômica sobre eles. O perfil ribossomo forneceu considerável visão da dinâmica de tradução em várias condições, incluindo estresse hipóxico, choque térmico e estresse oxidativo31,32. A técnica foi adaptada a vários tipos de material de origem, incluindo leveduras e células mamíferas.
Embora o perfil polimento e ribossomo tenham sido fundamentais na ampliação das capacidades de pesquisa na tradução, o processo de tradução inclui vários intermediários translacionais e complexos que são difíceis de capturar com esses métodos11,13. Uma limitação adicional decorre da falta de capacidade de estudar tipos de resposta rápida, uma vez que os complexos translacionais são estabilizados in vivo pela adição de inibidores específicos de tradução (antibióticos), levando a certos artefatos de distribuição ribossosome, ou ex vivo sobre a lise celular especificamente (antibióticos) ou não (íons de sal ou magnésio elevados), levando à privação dos intermediários de menor duração ou menos estáveis33, 34,35.
O formaldeído é amplamente utilizado para cruzar ácidos e proteínas nucleicas, como em estudos de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) e imunoprecipitação transligada (CLIP). Seu pequeno tamanho e excelente permeabilidade celular permitem uma rápida ação in vivo 36. Com base no cruzamento rápido do formaldeído, a abordagem de perfil ribossomo foi estendida com o Sequenciamento de Perfil do Complexo de Tradução (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. O TCP-seq, desenvolvido pela primeira vez em levedura, permite a captura de todos os intermediários de tradução, incluindo complexos SSU de digitalização ou pós-término e múltiplas configurações ribossômicas37,38,41,42. O método tem sido utilizado em diversos estudos10,38,39,41,42, alguns dos quais utilizam uma abordagem combinatória tanto dos inibidores de tradução quanto do crosslinking formaldeído para facilitar a prisão da tradução. Uma versão mais modificada da técnica, a seletiva TCP-seq39,foi recentemente empregada para incluir a imunopurificação dos complexos interligados, ampliando o escopo das aplicações TCP-seq. A natureza rápida, eficiente e reversível do crosslinking formaldeído torna essas abordagens adequadas para estudar interações complexas transitórias de mRNA:tradução, particularmente no contexto de caminhos de resposta em nível de tradução altamente dinâmicos.
Aqui detalhamos os processos de crosslinking in vivo formaldeído com o propósito de estabilização e isolamento complexos de tradução abrangentes. Fornecemos protocolos separados nuances para leveduras e células mamíferas(Figura 1). Delineamos ainda exemplos do uso subsequente do material estabilizado por crosslink(Figura 1),como para detecção de fatores proteicos co-purificados usando imunoblotting (mancha ocidental), purificação assistida por imuno-assistuo (ou 'imunoprecipitação'; IP) e enriquecimento de complexos translacionais contendo fatores específicos de interesse, microscopia eletrônica e sequenciamento de RNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> Figura 1: Esquema representando uma visão geral da configuração experimental típica. Os principais passos da estabilização in vivo formaldeído dos complexos translacionais são retratados como um fluxograma, complementado por informações sobre os principais instrumentos necessários. Potenciais aplicações a jusante do material interligado são delineadas, incluindo exemplos que foram empregados com sucesso, mas não diretamente cobertos neste protocolo, como a purificação de contas SPRI do RNA, sequenciamento de RNA e espectrometria em massa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

Respostas rápidas envolvendo rápida redistribuição do mensageiro(m)RNA e alterações da tradução de mRNA são pertinentes aos ajustes homeostáticos contínuos das células. Esses ajustes são fundamentais para a sobrevivência das células eucarióticas e o "controle de danos" durante os níveis flutuantes de nutrientes e salinidade, temperatura e vários estresses químicos e de radiação. Devido à natureza altamente dinâmica das respostas de nível RNA, e à instabilidade de muitos dos intermediários RNA:RNA e RNA:protein, obter um instantâneo significativo do estado rna citoplasmado só é possível com um número limitado de métodos. Experimentos do tipo de perfil ribossomo baseados em RNA e RNA estão entre as fontes de dados mais informativas para o controle da tradução. No entanto, a ausência de um RNA uniforme e estabilização intermediária de RNA:proteínas pode levar a diferentes vieses, particularmente nas vias de resposta celular em ritmo acelerado. Neste artigo, fornecemos um protocolo detalhado de fixação rápida aplicável às células eucarióticas de diferentes permeabilidade, para auxiliar na estabilização intermediária do RNA e RNA:proteína. Fornecemos ainda exemplos de isolamento dos complexos estabilizados de RNA:proteínas com base em sua co-sedimentação com frações ribossômicas e poli(ribo)somal. O material estabilizado separado pode ser posteriormente usado como parte de experimentos do tipo de perfil ribossomo, como na abordagem de sequenciamento do perfil do complexo de tradução (TCP-seq) e seus derivados. A versatilidade dos métodos estilo TCP-seq foi agora demonstrada pelas aplicações em uma variedade de organismos e tipos de células. Os complexos estabilizados também podem ser adicionalmente purificados e imageados usando microscopia eletrônica, separados em diferentes frações poli(ribo)somal e submetidos ao sequenciamento de RNA, devido à facilidade da reversão do crosslink. Portanto, métodos baseados na fixação de snap-chilling e formaldeído, seguidos pelo tipo de enriquecimento complexo de RNA ou outro tipo de RNA:protein complex, podem ser de particular interesse em investigar detalhes mais finos da dinâmica complexa rápida do RNA:protein complex em células vivas.

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Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Apresentamos uma técnica para estabilizar rapidamente complexos translacionais (biossíntese de proteínas) com formaldeído interligando em leveduras vivas e células mamíferas. A abordagem permite dissecar intermediários transitórios e interações dinâmicas de RNA:protein. Os complexos interligados podem ser usados em vários aplicativos a jusante, como em métodos de perfil baseados em sequenciamento profundo, microscopia e espectrometria de massa.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

O fluxo de trabalho consiste em cultivar células em condições ambientais estritamente controladas, resfriando-as rapidamente usando água derretida/gelo e fixação com concentração pré-otimizada de formaldeído e tempo de incubação. A reação de fixação é então saciada usando o excesso de compostos primários contendo grupo de amino, como glicina ou tryps. As células são coletadas, lavadas e podem ser armazenadas congeladas.As células fixas podem ser mecanicamente ou quimicamente lísedas, e o liseto é usado para separação das frações ribossômicas com base em seu tamanho molecular, propriedades de sedimentação ou marcadores de afinidade. A abordagem resulta em material versátil utilizável para purificação e detecção imuno assistida, enriquecimento de complexos contendo fatores específicos na microscopia eletrônica. Após bloqueio profundo interligado, análises baseadas em amplificação de RNA ou hibridização, sequenciamento de RNA e espectrometria de massa tornam-se possíveis.Configure uma cultura de levedura de um litro em um agitador orbital com uma densidade óptica inicial não mais do que 0,05 unidades de absorção a 600 nanômetros e use peptone e mídia dextrose a 30 graus celsius. Configure uma centrífuga preparatória com rotor compatível e garrafas de centrífuga para pelotizar a suspensão líquida de células de levedura a 5000 G a quatro graus celsius. Mantenha registro da densidade óptica das células em crescimento.Deve ser entre 0,6 a 0,8 unidades de absorção e 600 nanômetros no momento da coleta se a fase de crescimento exponencial for de interesse. Uma vez que as células estejam prontas, configure uma geladeira dentro do capô de fumaça química com um padeiro contendo 250 gramas de gelo de água esmagada limpa e mostre-lhe também 25 mililitros trypsin e metanol recém-adquirido estabilizado 37% solução de formaldeído dentro do capô. Despeje a última cultura celular no padeiro contendo o gelo.Em seguida, adicione 75 mililitros de 37% de formaldeído a uma concentração final de 2,2% de peso sobre o volume agitar intensamente a mistura até que o gelo derreta. Uma vez que o gelo seja derretido, configure um temporizador por 10 minutos Depois de incubar por 10 minutos, transfira a cultura para as garrafas de centrífugas pré-resfriadas e pelota as células por centrifugação a quatro graus celsius, 5000 G por cinco minutos. Enquanto o giro é, em pré-esfriar um tubo de 50 mililitros e manter o tampão recém-preparado A contendo glicina para neutralizar qualquer formaldeído restante no gelo.Após a centrifugação, coloque os tubos de centrífugas no gelo com o lado da pelota em contato com o gelo. Leve os tubos para dentro do capô da fumaça e descarte o sobrenatante em um recipiente de resíduos de formaldeído. Suspenda a cápsula celular de tubos antigos em 20 mililitros de tampão A usando uma stripette de 25 mililitros e transferindo para um tubo de 50 mililitros.Coma o volume até 40 mililitros com tampão A e colete as células de lavagem por centrifugação de quatro graus celsius, 5000 G por cinco minutos. Descarte o supernatante e suspenda a pelota celular em um tampão de 40 mililitros, que é o tampão A que não contém glicina para remover a contaminação da glicina. Pelotar as células novamente por centrifugação a quatro graus celsius, 5000 G cinco minutos.Repita as lavagens com tampão A, mais uma vez. Descarte o supernasce e coloque a pelota no gelo. Pesar o tubo com a pelota, a massa celular molhada deve ser de aproximadamente um grama por um litro da cultura celular.Encha o poliestireno da caixa forrada com papel alumínio com nitrogênio líquido a uma profundidade de aproximadamente três centímetros. Coloque em tubo de 50 mililitros ereto na caixa. Suspenda a pelota em 550 microliters de tampão A dois por pipetação e vórtice por 10 segundos.Adicione 10 microliters de 40 unidades por inibidor de microliter RNase e vórtice novamente por 10 segundos. Usando uma pipeta de um mililitro, escorra a suspensão celular para os 50 mililitros dois contendo o nitrogênio líquido. Para se preparar para o próximo passo, tubos livres de núcleo de 1,5 mililitros pré-refrigerados em gelo seco e 10 mililitros de aço inoxidável.Transfira as gotículas de suspensão de células congeladas para os frascos usando uma espátula estéril limpa. Submergir os frascos de moagem em nitrogênio líquido por um minuto, garantindo que a fase líquida permaneça acima da junção. Coloque uma fábrica de mistura cryo em 27 Hertz para agitação por um minuto.Agitar os potes de moagem selados em 27 Hertz por um minuto no moinho de mistura. Resfrie os frascos em nitrogênio líquido como antes e agite por um minuto a mais. Transfira os frascos para a caixa de gelo contendo gelo seco junto com os tubos livres de núcleo de 1,5 mililitro.Usando uma pequena espátula de aço, transfira os resultados em data de moagem acolchoado para os tubos. Em seguida, armazene os tubos a menos 80 graus celsius. Em dois Frascos T175, os frascos crescem hek 293 células para 60 a 70% de confluência e o soro bovino águia modificado de Dalbeko e 10% soro bovino fetal a 37 graus e 5% de dióxido de carbono.Pelo menos três horas antes do tempo de fixação desejado, substitua a mídia do frasco T175 por precisamente 30 mililitros de mídia completa pré aquecida. Prepare uma geladeira até a borda com gelo de água esmagada e mantenha no capô da fumaça junto com os buffers necessários, também um gelo. Para esfriar as células, remova o frasco T175 da incubadora e pressione-o formalmente contra o gelo, garantindo o máximo de contato com a superfície.Dentro de um capô de fumaça química, incline o frasco para o lado para que a mídia se colete no lado oposto às células. Pipetas 168 microliters de 37% pesaram por formaldeído de volume diretamente na mídia agrupada. Dando uma concentração final de 0,2% de formaldeído.Misture imediatamente. Incubar os frascos no gelo por mais 10 minutos. Despeje a mídia em um recipiente de resíduos apropriado através do lado do frasco em frente às células.Usando um stripete, pipeta em 30 mililitros da solução salina tamponada de fosfato de Dalbeko sem íons de cálcio e magnésio e, adicionalmente, contendo 50 milimolars de glicina suavemente ao lado oposto das células. Misture balançando o frasco, devolva o flash à posição horizontal e incubar por mais 10 minutos no gelo. Despeje a solução através do lado do frasco em frente à célula e adicione suavemente sete mililitros da solução EDTA padrão de 0,25% de trippsina para desapegar e suspender as células.Incubar o frasco à temperatura ambiente por cinco, no máximo 10 minutos. Localize o frasco verticalmente e usando um stripete, colete as células separadas lavando suavemente qualquer restante das paredes do frasco e transfira a suspensão para um tubo de 50 mililitros no gelo. Suplemente imediatamente a solução de suspensão coletada com 20 mililitros de mídia completa e misture girando suavemente o tubo.Pellule as células centrifugando o tubo a 100 G por cinco minutos e quatro graus celsius. A pelota de célula deve ser claramente visível. Despeje a mídia e suspenda suavemente a pelota em 10 mililitros do soro fisco tamponado de fosfato de Dalbeko sem glicina.Centrifugar o tubo novamente a 100 G por cinco minutos e a quatro graus celsius Despeje o tampão de lavagem e suspenda novamente a pelota em 800 microliters de salina tamponada de fosfato de Dalbeko sem glicina, mas contendo magnésio e íons de cálcio. Transfira as células re-suspensas para um novo tubo de micro centrífuga de baixa proteína de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 100 G por três minutos a quatro graus celsius.Descarte cuidadosamente o supernatante usando uma pipetter mililitro. Nesta fase, a pelota celular pode ser congelada a menos 80 graus celsius ou seguir para a etapa de lise celular. Em um gabinete de biossegurança adicione 300 microliters de tampão de lise à base de detergente não iônico, não desnaturador, e sete microliters de inibidor de arginase e misture bem por pipetar usando uma ponta mililitro.Conecte cuidadosamente uma agulha de calibre 25 a uma seringa de um a três mililitros e enconte vigorosamente a mistura usando pelo menos sete ingestão lenta para cima e traços rápidos de escape para baixo. Descarte a seringa e a agulha na caixa afiada e repita o procedimento com uma agulha de calibre 31 e uma seringa de 0,3 mililitro. Descarte a seringa e a agulha na caixa afiada.Centrifugar o tubo a 12.000 G por cinco minutos a quatro graus para remover os detritos celulares. Transfira o supernatante para um novo tubo de micro centrífuga de baixa proteína de 1,5 mililitro. Armazene os detritos celulares e lise a menos 80 graus celsius.Os complexos translacionais são sensíveis à composição iônica dos buffers. A omissão do cloreto de magnésio e a adição de propriedades de alta sedimentação revogadas do EDTA, e enquanto o cloreto de cálcio resultou em melhores picos de resultado, a melhora foi marginal. Assim, selecionamos tampão um.O peso de 2,2% por volume formaldeído preservou excelentemente os polimentos e não diminuiu o rendimento geral em comparação com 4% de peso por formaldeído de volume. Nas células mamíferas, utilizou-se uma concentração muito menor de formaldeído de 0,2% de peso em volume. Como concentrações mais elevadas resultaram em perda substancial de material poliribosomal.15 milimães EDTA adicionados ao liseto e todos os buffers subsequentes apresentaram efeito de desestabilização distintamente menor nas frações polissômicas, derivadas das células fixas. E esse efeito foi parcialmente replicado com 50 milimães EDTA com material de células 4% fixas, resistindo, desdobrando-se melhor. O esgotamento da glicose provoca um dos efeitos inibitórios translacionais mais dramáticos e rápidos na levedura.Tanto o nervo adicionado quanto as condições locais de desmontagem induzidas por polisso foi ligeiramente, mas evidentemente mais polisomos retidos em glicose de baixa adição. É importante ressaltar que o material polissomo das células fixas demonstra uma alta distinção entre as células famintas e não-famintas indicando a adequação da fixação do formaldeído para preservar diferenças nos processos de tradução dinâmica. Em abordagens como tacy paysake, pode ser adicionalmente perspicaz remover pequenas subunidades ribossômicas que não se acomodam bem com os rizomas completos para os quais empregamos uma ultracentrifugação de dois estágios, permitindo o isolamento de SSU, LSU, RS, diazomes resistentes rnase, DS e poliscópicos de alta ordem confirmados por microscopia eletrônica das frações fixas.Em comparação com as células não fixas, o material das células fixas demonstrou presença elevada de labile eIF4A nas frações ribossômicas de sedimentação mais rápidas. Usando material fixo da cepa eIF4A tapi para capturar e enriquecer eIF4A contendo complexos com contas de IDG magnético, pudemos observar o enriquecimento seletivo do eIF4A em comparação com beta-actina em SSU e RS, mas não frações de LSU do segundo gradiente sobre rnase uma desmontagem. Em comparação com outros métodos de descanso translacional, a rapidez da ação formaldeída entre as membranas celulares e a natureza indiscriminada dos cross-links promete a preservação da máxima diversidade de intermediários complexos de tradução.Nossos achados conformam a usabilidade da rápida fixação do formaldeído para estabilizar complexos altamente transitórios e a utilidade das evidências nos cenários de respostas celulares rápidas a mudanças ambientais ou condições de estresse.

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Unit 1

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