Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Австралийского исследовательского совета Discovery Project (DP180100111 для T.P. и N.E.S),грантом Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (GNT1175388 to N.E.S.) и исследовательской стипендией (APP1135928 to T.P.). Авторы признают возможности Microscopy Australia в Центре передовой микроскопии Австралийского национального университета, который финансируется Университетом и федеральным правительством.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Фиксация формальдегида является удобным и популярным методом достижения быстрого in vivo сшивания биомолекул10,36,45,46,47,48. По сравнению с другими потенциальными мишенями биомолекул, успешный захват трансляционных комплексов требует немедленной фиксации во время мгновенного охлаждения клеток или другого материала. Без неустановленной стабилизации существует вероятность продолжения различных процессов, связанных с трансляцией, смещения сложного распределения от невозмущенного состояния in vivo 49. По сравнению с другими методами трансляционной остановки и стабилизации рибосомного комплекса, быстрота действия формальдегида через клеточные мембраны и неизбирательный характер сшивок обещают сохранение максимального разнообразия промежуточных продуктов трансляционного комплекса ближе к их изначально распределенным состояниям50.
Представленный здесь подход был установлен и оптимизирован как в дрожжевых, так и в клетках млекопитающих, и в настоящее время методы были получены другими группами для использования в более разнообразном биологическом материале, например, у целых позвоночных (например, эмбрионов рыбок данио)10,38,39,49,51,52 . Хотя эти работы в совокупности убеждают в универсальности и широкой применимости подхода, быстрое сшивание формальдегида трансляционных комплексов можно считать несколько трудным для переноса на новые типы биологического материала из-за необходимости оптимизации и корректировки.
Главным требованием к успеху метода является повторная оптимизация концентрации формальдегида и метода сбора и разрушения клеток. Менее проницаемые, мелкие и круглые дрожжевые клетки требуют гораздо более высокой (по крайней мере, в 10 раз) концентрации формальдегида и физического разрушения фиксированных клеток. Напротив, крупные и уплощенные адгезивные клетки млекопитающих в культуре могут быть легко перефиксированы и требуют бережного обращения при фиксации, в то время как извлечение фиксированных комплексов может быть выполнено химическим путем с разрушением мембраны с использованием моющих средств. Недостаточное сшивание может позволить менее стабильным или более короткоживущим промежуточным продуктам диссоциировать или просачиваться в более позднее состояние. Чрезмерное сшивание может негативно повлиять на способность выделять и изучать рибосомные фракции и может создавать селективные смещения, такие как более глубокое истощение тяжелых комплексов. По нашим наблюдениям, даже незначительные изменения, такие как тип используемых адгезивных клеток человека, могут повлиять на выход восстановленных сшитых комплексов и могут потребовать повторной оптимизации режима сшивания. Мы также можем ожидать, что клетки с существенно отличающимися свойствами проницаемости, такие как растительные клетки, потребуют дополнительной обширной оптимизации условий фиксации52. Тем не менее, трудно представить себе тип биологического материала, который был бы совершенно несовместим с подходом.
Одним из соображений, относящихся к протоколу фиксации млекопитающих, является плотность и количество клеточного материала, используемого в качестве входных данных. Рекомендуется, чтобы клетки непрерывно росли без повторного посева или других возмущений в течение не менее 2 дней, чтобы избежать внешних воздействий на динамику клеточной трансляции. Применимо для большинства типов клеток, но для большинства адгезивных клеток последовательно достигнутые уровни слияния не более 70% обеспечат отсутствие серьезных эффектов ингибирования контакта, которые могут негативно и непредсказуемо влиять на скорость трансляции.
Еще одной интересной и потенциально уникально удобной особенностью фиксации формальдегида, вытекающей из его неизбирательной реакционной способности, является стабилизационное воздействие на поступательные комплексы в системах смешанной таксономии. Бактериальные, а тем более поступательные комплексы митохондрий, хлоропластов и различных внутриклеточных паразитов, как известно, трудно нацелить на специфические ингибиторы трансляции. Напротив, в данных TCP-seq следы, отображаемые с митотранскриптомом, легко наблюдаются в данных38,39,50. Интересным последующим событием могло бы стать использование подхода к исследованию трансляции в целых микросообществах, таких как образцы почвы, воды или кишечника, где надежная быстрая трансляционная остановка и комплексная стабилизация любыми другими средствами были бы проблематичными.
Следует также отметить, что для наиболее сложного материала (такого как твердые и/или громоздкие ткани) ничто не препятствует использованию стабилизации формальдегида сразу после разрушения клеток и гомогенизации материала. Этот подход уже часто используется для устранения задержки входа в клетку при стабилизации поступательных комплексов со специфическими ингибиторами малых молекул33,53,54,55. Учитывая, что фиксация формальдегида традиционно использовалась с отличными результатами для стабилизации образцов ex vivo/in vitro в таких приложениях, как электронная микроскопия45,56,57,58,мы можем ожидать еще меньших негативных эффектов в этом случае, особенно тех, которые связаны с плохим извлечением поступательных комплексов из тщательно зафиксированных клеток.
Наши результаты подтверждают удобство быстрой фиксации формальдегида для стабилизации высокопреходящих комплексов, таких как те, которые включают eIF4A. Примечательно, что в отличие от млекопитающих, дрожжи eIF4A гораздо слабее связаны с колпачковым связывающим комплексом eIF4F и, как следствие, трансляционными комплексами в целом. eIF4A обычно теряется при любой обширной очистке рибосомного материала в дрожжах29,59,60,61,62,63. Тем не менее, в in vivo-фиксированномдрожжевом материале можно добиться надежного обогащения eIF4A во всех фракциях поступательных комплексов, где ожидается его присутствие. Ранее опубликованные данные Sel-TCP-seq продемонстрировали обогащение eIF2 и eIF3, которые более прочно ассоциируются с рибосомами (но также выявили временно происходящую котрансляционную сборку белкового комплекса)39. Таким образом, метод подходит для обнаружения как более сильных, так и более слабых прикрепленных составляющих поступательных комплексов.
Подводя итог, мы представили подход, полезный для получения информации в первую очередь об изменениях, происходящих на начальной фазе трансляции и когда требуется минимально возмущенное рибосомное распределение по мРНК. Важно отметить, что подход подходит для стабилизации относительно лабильных и динамических компонентов поступательных комплексов, таких как eIF4A, и может широко использоваться при условии необходимой оптимизации. Мы также предоставили доказательства полезности фиксации формальдегида в сценариях быстрого динамического изменения трансляции, открывая области исследования, такие как быстро меняющиеся клеточные реакции на изменения окружающей среды или стрессовые условия.

Живые организмы подвержены динамическим внутри- и внеклеточным изменениям на протяжении всей своей жизни, которые требуют быстрых реакций для поддержания гомеостаза и обеспечения выживания. Чтобы обеспечить адаптацию к окружающей среде, эукариотические клетки регулируют свой метаболизм с помощью контроля экспрессии генов. Контроль экспрессии генов может осуществляться во время транскрипции и/или трансляции; с трансляционными ответами, как правило, происходящими быстрее1,2,3,4. Например, трансляционные изменения обычно возникают в течение 1-30 минут после начала стресса, в то время как изменения уровня транскрипции следуют черезнесколькочасов после воздействия стресса3,4,5. Изменения в трансляционном выходе достигаются быстрее благодаря постоянной доступности молекул матричной (м)РНК в цитоплазме. И наоборот, на уровне транскрипции новые молекулы мРНК должны синтезироваться, а у эукариот обрабатываться и экспортироваться из ядра, вызывая обширные задержки во времени отклика2,4,6,7,8.
Острая трансляционная реакция на стресс обычно характеризуется общим снижением трансляционного выхода с селективной регуляцией белков, необходимых для выживания клеток.1,3,4,9. Считается, что снижение производства белка имеет решающее значение из-за высоких энергетических затрат процесса.3,7. Для облегчения селективного торможения и повышения регуляции трансляционные реакции обслуживаются целым рядом сложных регуляторных механизмов. Регуляция может осуществляться на всех этапах трансляции: инициация, удлинение, прекращение биосинтеза полипептидов и рециркуляция рибосомы10,11,12,13, но наиболее сильно проявляется на этапе инициации5,7,9,10,13. Во время инициации малая рибосомная субъединица (SSU), поддерживаемая эукариотическими факторами инициации (eIF), связывается и сканирует 5' нетранслированную область (UTR) мРНК до тех пор, пока не будет распознан стартовый кодон.2,5,6,8,11,12,13. Регулирующие механизмы часто нацелены на eIF, влияющие на прикрепление, сканирование и распознавание кодонов. Например, фактор инициации eIF2, существенный фактор трансляции, который помогает в наборе инициатора Met-tRNAiMet в СБУ, часто нацеливается на эукариот в стрессовых условиях4,6,11. В дрожжах фосфорилирование этого фактора может быть вызвано депривацией питательных веществ и осмотическим стрессом.1,4,11,14,15, а в клетках млекопитающих аминокислотное голодание, стресс эндоплазматического ретикулума (ER), УФ-стресс, вирусная инфекция и измененный уровень кислорода могут вызвать этот ответ8,9,11. Быстрое повышение регуляции специфической трансляции мРНК проявляется в реакции клеток млекопитающих на гипоксию, которая демонстрирует глобальное быстрое ингибирование трансляции и селективное повышение регуляции биосинтеза гипоксий-индуцируемых факторов (HIFs). HIF являются факторами транскрипции, которые затем вызывают долгосрочное клеточное перепрограммирование на уровне транскрипции ДНК.8,9,16. Аналогичные реакции наблюдались у дрожжей при тепловом стрессе, с быстрой трансляционной экспрессией белков теплового шока (HSP), за которой следовали замедленные реакции на уровне транскрипции.17,18. В дополнение к депривации питательных веществ и тепловому шоку, поступательные реакции в дрожжах были изучены при различном кислороде.8,19солёность5, фосфат, сера20,21 и азот22,23 Уровней. Это исследование имеет широкие последствия для промышленного использования дрожжей, таких как выпечка и ферментация.24,25. Трансляционные реакции также могут играть важную роль в углублении понимания таких заболеваний, как нейродегенеративные расстройства и болезни сердца, которые характеризуются внутриклеточными стрессами, такими как окислительный стресс. В целом, трансляционные реакции являются неотъемлемой частью контроля экспрессии генов и способствуют быстрой адаптации к широкому спектру стрессовых состояний в эукариотических организмах.
Для изучения трансляционных ответов требуются методы, обеспечивающие минимально искаженные снимки переводческого ландшафта. Полисомное профилирование — классический подход, используемый при изучении трансляции через мРНК, включающий разделение поли(рибо)сомальных фракций мРНК посредством ультрацентрифугирования через градиенты сахарозы26,27. Этот подход может быть использован для изучения уровней трансляции для отдельных мРНК (с помощью методов обнаружения, таких как обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция,ОТ-ПЦР 26),или глобально в сочетании с высокопроизводительными методами (микрочипы или РНК-seq28,29). Более развитым подходом является профилирование рибосом, позволяющее изучать положения удлиняющихся рибосом вдоль молекулы мРНК в общегеномном масштабе, а также делать вывод об эффективности трансляции через транскриптом и использовании основного и альтернативного стартовых участков30,31. Профилирование рибосом включает в себя выделение и секвенирование фрагментов мРНК, защищенных рибосомным присутствием над ними. Профилирование рибосом обеспечило значительное понимание динамики трансляции в ряде состояний, включая гипоксический стресс, тепловой шок и окислительный стресс31,32. Метод был адаптирован к нескольким типам исходного материала, включая дрожжи и клетки млекопитающих.
В то время как профилирование полисом и рибосом было фундаментальным в расширении возможностей исследований в переводе, процесс перевода включает в себя различные трансляционные промежуточные продукты и комплексы, которые трудно охватить с помощью этих методов11,13. Дополнительное ограничение связано с отсутствием способности изучать типы быстрого ответа, поскольку трансляционные комплексы либо стабилизируются in vivo путем добавления специфических ингибиторов трансляции (антибиотиков), что приводит к определенным артефактам распределения рибосом, либо ex vivo при клеточном лизисе конкретно (антибиотики) или неспецифично (с высоким содержанием соли или ионов магния), что приводит к лишению более короткоживущих или менее стабильных промежуточных продуктов33, 34,35.
Формальдегид широко используется для сшивания нуклеиновых кислот и белков, например, в исследованиях иммунопреципитации хроматина (ChIP) и сшивки иммунопреципитации (CLIP). Его небольшие размеры и отличная проницаемость клеток позволяют осуществлять быстрое in vivo действие36. Основываясь на быстром сшивке формальдегида, подход профилирования рибосом был расширен с помощью секвенирования профиля translation Complex (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, впервые разработанный в дрожжах, позволяет захватывать все промежуточные трансляции, включая сканирующие или пост-терминальные комплексы SSU и множественные рибосомные конфигурации37,38,41,42. Метод был использован в нескольких исследованиях10,38, 39,41,42,некоторые из которых используют комбинаторный подход как ингибиторов трансляции, так и сшивки формальдегида для облегчения остановки трансляции. Еще одна модифицированная версия метода, селективный TCP-seq39,недавно была использована для включения иммуноочищения сшитых комплексов, расширяя сферу применения TCP-seq. Быстрый, эффективный и обратимый характер сшивки формальдегида делает эти подходы подходящими для изучения переходных сложных взаимодействий мРНК:трансляции, особенно в контексте высокодинамичных путей ответа на уровне трансляции.
Здесь мы подробно описываем процессы сшивки формальдегида in vivo с целью комплексной стабилизации и изоляции комплекса переводов. Мы предоставляем отдельные протоколы, нюансированные для дрожжей и клеток млекопитающих(рисунок 1). Далее мы приводим примеры последующего использования стабилизированного сшиванием материала(рисунок 1),например, для обнаружения коочищенного белкового фактора с использованием иммуноблоттинга (вестерн-блоттинг), иммуноассистированной очистки (или «иммунопреципитации»; IP) и обогащение трансляционных комплексов, содержащих специфические интересующие факторы, электронная микроскопия и секвенирование РНК.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> Рисунок 1:Схема, изображающая обзор типичной экспериментальной установки. Основные этапы стабилизации in vivo формальдегида трансляционных комплексов изображены в виде блок-схемы, дополненной информацией о ключевых необходимых инструментах. Описаны потенциальные последующие применения сшитого материала, включая примеры, которые были успешно использованы, но непосредственно не охвачены в этом протоколе, такие как очистка шариков SPRI РНК, секвенирование РНК и масс-спектрометрия. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

Быстрые ответы, включающие быстрое перераспределение матричной(м)РНК и изменения трансляции мРНК, имеют отношение к текущим гомеостатическим корректировкам клеток. Эти корректировки имеют решающее значение для выживаемости эукариотических клеток и «контроля повреждений» во время колебаний уровня питательных веществ и солености, температуры и различных химических и радиационных стрессов. Из-за высокодинамического характера ответов на уровне РНК и нестабильности многих промежуточных продуктов РНК:РНК и РНК:белок получение значимого снимка состояния цитоплазматической РНК возможно только при ограниченном числе методов. Эксперименты по профилированию рибосом на основе транскриптома на основе РНК-seq являются одними из наиболее информативных источников данных для контроля трансляции. Однако отсутствие равномерной промежуточной стабилизации РНК и РНК:белок может привести к различным смещениям, особенно в быстро меняющихся путях клеточного ответа. В этой статье мы предоставляем подробный протокол быстрой фиксации, применимый к эукариотическим клеткам различной проницаемости, чтобы помочь в промежуточной стабилизации РНК и РНК:белок. Далее приведены примеры выделения стабилизированных комплексов РНК:белок на основе их совместного осаждения с рибосомными и поли(рибо)сомальными фракциями. Отделенный стабилизированный материал может быть впоследствии использован в рамках экспериментов типа профилирования рибосом, таких как подход секвенирования трансляционного комплексного профиля (TCP-seq) и его производных. Универсальность методов в стиле TCP-seq в настоящее время продемонстрирована приложениями в различных организмах и типах клеток. Стабилизированные комплексы также могут быть дополнительно очищены сродством и визуализированы с помощью электронной микроскопии, разделены на различные поли(рибо)сомальные фракции и подвергнуты секвенированию РНК, благодаря легкости разворота сшивки. Поэтому методы, основанные на охлаждении и фиксации формальдегида с последующим осаждением или другим типом обогащения комплекса РНК:белок, могут представлять особый интерес для исследования более тонких деталей быстрой динамики комплекса РНК:белок в живых клетках.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Представлена методика быстрой стабилизации поступательных (белковый биосинтез) комплексов со сшиванием формальдегида в живых дрожжевых и млекопитающих клетках. Этот подход позволяет препарировать переходные промежуточные продукты и динамические взаимодействия РНК:белок. Сшитые комплексы могут использоваться в нескольких последующих приложениях, таких как методы профилирования на основе глубокого секвенирования, микроскопия и масс-спектрометрия.

Быстрая фиксация in vivo и выделение трансляционных комплексов из эукариотических клеток

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Выделение лабильной Multi-белковые комплексы по В естественных условиях Контролируемые Сотовая сшивания и иммуно-магнитного аффинной хроматографии

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Создание микробных культур эукариотических обогащения от химически стратифицированных озер Антарктики и оценки углеродного потенциала фиксации

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Выделение Рибосома связанных стадии становления Полипептиды<em&gt; В пробирке</em&gt;, Чтобы определить Поступательное сайтов Пауза Наряду мРНК

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Эффективной и быстрой изоляции на ранней стадии эмбрионы из<em&gt; Arabidopsis THALIANA</em&gt; Семена

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Идентификация пост-трансляционных модификаций растительных белковых комплексов

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

В естественных условиях Сшивание подход к Изолировать белковых комплексов С Дрозофилы Эмбрионы

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Выделение и функциональный анализ митохондрий из культивируемых клеток и мышь ткани

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Генома Очистка экстрахромосомального кольцевой ДНК из эукариотических клеток

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Фильтрация Выделение нуклеиновых кислот: Простой и быстрый ДНК Метод экстракции

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...