Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
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Este trabajo fue apoyado por la subvención del Proyecto de Descubrimiento del Consejo Australiano de Investigación (DP180100111 a T.P. y N.E.S), la Subvención para Investigadores del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (GNT1175388 a N.E.S.) y la Beca de Investigación (APP1135928 a T.P.). Los autores reconocen las instalaciones de Microscopy Australia en el Centro de Microscopía Avanzada de la Universidad Nacional de Australia, una instalación financiada por la Universidad y el Gobierno Federal.

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

La fijación de formaldehído es un método conveniente y popular para lograr una reticulación rápida in vivo de biomoléculas10,36,45,46,47,48. En comparación con los otros objetivos potenciales de biomoléculas, la captura exitosa de complejos traslacionales requiere una fijación inmediata durante el enfriamiento por instantáneas de las células u otro material. Sin la estabilización no retardada, existe la posibilidad de que continúen los diferentes procesos relacionados con la traducción, desplazando la distribución compleja lejos del estado in vivo imperturbable49. En comparación con los otros métodos de detención traslacional y estabilización del complejo ribosómico, la rapidez de la acción del formaldehído a través de las membranas celulares y la naturaleza indiscriminada de los enlaces cruzados prometen la preservación de la máxima diversidad de los intermedios complejos de traducción más cercanos a sus estados distribuidos nativamente50.
El enfoque presentado aquí se ha establecido y optimizado tanto en células de levadura como de mamíferos, y otros grupos han derivado métodos para su uso en material biológico más diverso, como en vertebrados enteros (por ejemplo, embriones de pez cebra)10,38,39,49,51,52 . Aunque estos trabajos aseguran colectivamente la versatilidad y la amplia aplicabilidad del enfoque, la reticulación rápida de formaldehído de complejos traslacionales puede considerarse algo difícil de transponer a nuevos tipos de material biológico debido a la necesidad de optimizaciones y ajustes.
Un requisito principal para el éxito del método es la reoptimización de la concentración del formaldehído y la técnica de recolección y disrupción celular. Las células de levadura menos permeables, pequeñas y redondas requieren una concentración de formaldehído mucho mayor (al menos, 10 veces) y la interrupción física de las células fijas. Por el contrario, las células de mamíferos adherentes grandes y aplanadas en cultivo pueden fijarse en exceso fácilmente y requieren un manejo suave tras la fijación, mientras que la extracción de los complejos fijos se puede realizar químicamente con interrupción de la membrana utilizando detergentes. La reticulación insuficiente puede permitir que los intermedios menos estables o de vida más corta se disocien o se filtren a un estado posterior. El reticulamiento excesivo puede afectar negativamente la capacidad de aislar y estudiar fracciones ribosómicas y puede crear sesgos selectivos, como un agotamiento más profundo de complejos pesados. En nuestra observación, incluso alteraciones menores, como el tipo de células humanas adherentes utilizadas, pueden afectar el rendimiento de los complejos reticulados recuperados y pueden requerir una reoptimización del régimen de reticulación. También podemos anticipar que las células con propiedades de permeabilidad sustancialmente diferentes, como las células vegetales, requerirán una optimización extensa adicional de las condiciones de fijación52. Sin embargo, es difícil imaginar un tipo de material biológico que sea totalmente incompatible con el enfoque.
Una consideración pertinente al protocolo de fijación de mamíferos es la densidad y la cantidad de material celular utilizado como entrada. Se recomienda que las células crezcan continuamente sin volver a sembrar u otras perturbaciones durante al menos 2 días para evitar influencias externas en la dinámica de traducción celular. Aplicable para la mayoría de los tipos de células, pero para la mayoría de las células adherentes, los niveles de confluencia alcanzados consistentemente de no más del 70% asegurarán la ausencia de efectos importantes de inhibición del contacto que pueden afectar negativa e impredeciblemente las tasas de traducción.
Otra característica interesante, y potencialmente excepcionalmente conveniente, de la fijación de formaldehído derivada de su reactividad indiscriminada es el efecto de estabilización sobre los complejos traslacionales en sistemas de taxonomía mixta. Los complejos bacterianos, y aún más traslacionales de mitocondrias, cloroplastos y diferentes parásitos intracelulares, han sido notoriamente difíciles de atacar con inhibidores de traducción específicos. En contraste, en los datos TCP-seq, las huellas que se asignan al mitotranscriptoma son fácilmente observables en los datos38,39,50. Un desarrollo posterior interesante podría ser el uso del enfoque para investigar la traducción en microcomunidades enteras, como en muestras de suelo, agua o intestino, donde la detención traslacional rápida confiable y la estabilización compleja con cualquier otro medio serían problemáticas.
También debe mencionarse que para el material más complicado (como tejidos duros y / o voluminosos), nada impide el uso de la estabilización de formaldehído inmediatamente después de la interrupción celular y la homogeneización del material. Este enfoque ya se emplea con frecuencia para eliminar el retraso de entrada celular al estabilizar complejos traslacionales con inhibidores específicos de moléculas pequeñas33,53,54,55. Dado que la fijación de formaldehído se ha utilizado tradicionalmente con excelentes resultados para la estabilización de muestras ex vivo/in vitro en aplicaciones como la microscopía electrónica45,56,57,58,podemos esperar efectos aún menos negativos en este caso, particularmente aquellos asociados con la mala extracción de los complejos traslacionales de las células completamente fijadas.
Nuestros hallazgos confirman la usabilidad de la fijación rápida de formaldehído para estabilizar complejos altamente transitorios, como los que incluyen eIF4A. Cabe destacar que, a diferencia de los mamíferos, la levadura eIF4A se asocia mucho más débilmente con el complejo de unión a la tapa eIF4F y, como resultado, con los complejos traslacionales en general. eIF4A generalmente se pierde durante cualquier purificación extensa del material ribosómico enlevaduras 29,59,60,61,62,63. Sin embargo, en el material de levadura fija in vivo,es posible lograr un enriquecimiento confiable de eIF4A en todas las fracciones de complejos traslacionales donde se anticiparía su presencia. Los datos de Sel-TCP-seq publicados anteriormente han demostrado el enriquecimiento de eIF2 y eIF3 que se asocian más fuertemente con los ribosomas (pero también revelaron un ensamblaje transitorio del complejo proteico co-traduccional)39. Por lo tanto, el método es adecuado para la detección de constituyentes unidos más fuertes y débiles de los complejos traslacionales.
Para resumir, hemos presentado un enfoque útil para obtener información principalmente sobre los cambios que ocurren en la fase de inicio de la traducción y cuando se requiere una distribución ribosómica mínimamente perturbada sobre el ARNm. Es importante destacar que el enfoque es adecuado para la estabilización de componentes relativamente lábiles y dinámicos de complejos traslacionales, como eIF4A, y puede utilizarse ampliamente sujeto a las optimizaciones necesarias. También hemos proporcionado evidencia de la utilidad de la fijación de formaldehído en los escenarios de cambio dinámico rápido de la traducción, abriendo áreas de investigación como las respuestas celulares de ritmo rápido a los cambios ambientales o las condiciones de estrés.

Los organismos vivos están sujetos a cambios dinámicos intra y extracelulares a lo largo de su vida útil, que requieren respuestas rápidas para mantener la homeostasis y garantizar la supervivencia. Para permitir la adaptación ambiental, las células eucariotas ajustan su metabolismo a través del control de la expresión génica. El control de la expresión génica puede ejercerse durante la transcripción y/o traducción; con respuestas traslacionales que generalmente ocurren más rápidamente1,2,3,4. Por ejemplo, los cambios traslacionales generalmente surgen dentro de 1-30 minutos del inicio del estrés, mientras que las alteraciones a nivel de transcripción siguen horas después de la exposición al estrés3,4,5. Las alteraciones en la salida de la traducción se logran más rápidamente debido a la disponibilidad persistente de moléculas de ARN mensajero (m) en el citoplasma. Por el contrario, a nivel de transcripción, se deben sintetizar nuevas moléculas de ARNm, y en eucariotas, procesadas y exportadas desde el núcleo, produciendo grandes retrasos en el tiempo de respuesta2,4,6,7,8.
La respuesta traslacional aguda al estrés se caracteriza generalmente por una disminución general en la producción de traducción, con la regulación ascendente selectiva de las proteínas necesarias para la supervivencia celular.1,3,4,9. Se cree que la disminución de la producción de proteínas es crucial debido al alto gasto de energía del proceso.3,7. Para facilitar la inhibición selectiva y la regulación ascendente, las respuestas traslacionales son atendidas por una serie de mecanismos reguladores complejos. La regulación puede ejercerse en todas las fases de la traducción: iniciación, elongación, terminación de la biosíntesis de polipéptidos y reciclaje ribosómico10,11,12,13, pero se exhibe con mayor fuerza en la fase de iniciación5,7,9,10,13. Durante el inicio, la pequeña subunidad ribosómica (SSU), asistida por factores de iniciación eucariota (eIF), se une y escanea la región no traducida (UTR) de 5' de ARNm hasta que se reconoce un codón de inicio.2,5,6,8,11,12,13. Los mecanismos regulatorios a menudo se dirigen a los eIF que afectan la fijación, el escaneo y el reconocimiento de codones de inicio. Por ejemplo, el factor de iniciación eIF2, un factor de traducción esencial que ayuda en el reclutamiento de un iniciador Met-tRNAiMet a la SSU, a menudo se dirige a eucariotas en condiciones de estrés4,6,11. En la levadura, la fosforilación de este factor puede ser inducida bajo privación de nutrientes y estrés osmótico.1,4,11,14,15, y en las células de mamíferos, la inanición de aminoácidos, el estrés del retículo endoplásmico (RE), el estrés UV, la infección viral y los niveles alterados de oxígeno pueden desencadenar esta respuesta8,9,11. La rápida regulación ascendente de la traducción específica de ARNm es evidente en la respuesta de las células de mamíferos a la hipoxia, que exhibe una inhibición de la traducción rápida global y una regulación ascendente selectiva de la biosíntesis de factores inducibles por hipoxia (HID). Los HIF son factores de transcripción, que luego provocan una reprogramación celular a largo plazo a nivel de transcripción de ADN.8,9,16. Se han observado respuestas similares en levaduras bajo estrés por calor, con una rápida expresión traslacional de las proteínas de choque térmico (HSP) seguida de respuestas retardadas a nivel de transcripción17,18. Además de la privación de nutrientes y el choque térmico, las respuestas traslacionales en la levadura se han estudiado bajo oxígeno variable.8,19salinidad5, fosfato, azufre20,21 y nitrógeno22,23 Niveles. Esta investigación tiene implicaciones generalizadas para los usos industriales de la levadura, como la cocción y la fermentación.24,25. Las respuestas traslacionales también pueden ser fundamentales para promover la comprensión de enfermedades como los trastornos neurodegenerativos y las enfermedades cardíacas, que se caracterizan por tensiones intracelulares como el estrés oxidativo. En general, las respuestas traslacionales son parte integral del control de la expresión génica y facilitan la adaptación rápida a una amplia gama de condiciones de estrés en organismos eucariotas.
Para estudiar las respuestas traslacionales, se requieren métodos que proporcionen instantáneas mínimamente distorsionadas del panorama de la traducción. El perfil de polisomas es un enfoque clásico utilizado en el estudio de la traducción a través del ARNm, que implica la separación de fracciones poli(ribo)somales de ARNm mediante ultracentrifugación a través de gradientes de sacarosa26,27. El enfoque puede utilizarse para explorar los niveles de traducción de los ARNm individuales (con los métodos de detección como la transcripción inversa y la reacción en cadena de la polimerasa, RT-PCR26),o globalmente en conjunción con técnicas de alto rendimiento (microarray o RNA-seq28,29). Un enfoque más evolucionado es el perfil de ribosomas, que permite el estudio de las posiciones de los ribosomas alargados a lo largo de una molécula de ARNm a escala de todo el genoma, así como la inferencia de la eficiencia de la traducción a través del transcriptoma y la utilización de los sitios de inicio principales y alternativos30,31. El perfil de ribosomas implica el aislamiento y la secuenciación de fragmentos de ARNm protegidos por la presencia ribosómica sobre ellos. El perfil de ribosomas ha proporcionado una visión considerable de la dinámica de la traducción en una serie de afecciones, incluido el estrés hipóxico, el choque térmico y el estrés oxidativo31,32. La técnica se ha adaptado a múltiples tipos de materiales de origen, incluyendo levaduras y células de mamíferos.
Si bien el perfil de polisomas y ribosomas ha sido fundamental para ampliar las capacidades de investigación en traducción, el proceso de traducción incluye varios intermedios y complejos traslacionales que son difíciles de capturar con estos métodos11,13. Una limitación adicional se deriva de la falta de capacidad para estudiar tipos de respuesta rápida, ya que los complejos traslacionales se estabilizan in vivo mediante la adición de inhibidores de traducción específicos (antibióticos), lo que lleva a ciertos artefactos de distribución de ribosomas, o ex vivo en la lisis celular específicamente (antibióticos) o inespecíficamente (iones altos en sal o magnesio), lo que lleva a la privación de los intermedios de vida más corta o menos estables33, 34,35.
El formaldehído se usa ampliamente para reticular ácidos nucleicos y proteínas, como en los estudios de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) e inmunoprecipitación de reticulación (CLIP). Su pequeño tamaño y excelente permeabilidad celular permiten una rápida acción in vivo 36. Basado en la rápida reticulación de formaldehído, el enfoque de perfilación de ribosomas se ha ampliado con la Secuenciación de Perfiles Complejos de Traducción (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, desarrollado por primera vez en levaduras, permite la captura de todos los intermedios de traducción, incluidos los complejos SSU de escaneo o post-terminación y las múltiples configuraciones ribosómicas37,38,41,42. El método se ha utilizado en varios estudios10,38,39,41,42,algunos de los cuales utilizan un enfoque combinatorio tanto de inhibidores de la traducción como de reticulación de formaldehído para facilitar la detención de la traducción. Una versión modificada adicional de la técnica, TCP-seq39selectivo, se ha empleado recientemente para incluir la inmunopurificación de los complejos reticulados, ampliando el alcance de las aplicaciones TCP-seq. La naturaleza rápida, eficiente y reversible de la reticulación de formaldehído hace que estos enfoques sean adecuados para estudiar interacciones complejas transitorias de ARNm:traducción, particularmente en el contexto de vías de respuesta a nivel de traducción altamente dinámicas.
Aquí detallamos los procesos de reticulación de formaldehído in vivo con el propósito de la estabilización y aislamiento complejo de traducción integral. Proporcionamos protocolos separados matizados para levaduras y células de mamíferos(Figura 1). Además, describimos ejemplos del uso posterior del material estabilizado por reticulación(Figura 1),como para la detección del factor de proteína copurificado mediante inmunoblotting (western-blotting), purificación inmunoasistida (o "inmunoprecipitación"; IP) y enriquecimiento de complejos traslacionales que contienen factores específicos de interés, microscopía electrónica y secuenciación de ARN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> Figura 1: Esquema que representa una visión general de la configuración experimental típica. Los pasos principales de la estabilización de formaldehído in vivo de complejos traslacionales se representan como un diagrama de flujo, complementado con información sobre los instrumentos clave necesarios. Se describen las posibles aplicaciones posteriores del material reticulado, incluidos ejemplos que se han empleado con éxito pero que no se cubren directamente en este protocolo, como la purificación de cuentas SPRI del ARN, la secuenciación del ARN y la espectrometría de masas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

Las respuestas rápidas que implican una rápida redistribución del ARN mensajero (m) y alteraciones de la traducción del ARNm son pertinentes para los ajustes homeostáticos en curso de las células. Estos ajustes son críticos para la supervivencia de las células eucariotas y el "control de daños" durante los niveles fluctuantes de nutrientes y salinidad, la temperatura y diversas tensiones químicas y de radiación. Debido a la naturaleza altamente dinámica de las respuestas a nivel de ARN y la inestabilidad de muchos de los intermedios ARN:ARN y ARN:proteína, la obtención de una instantánea significativa del estado del ARN citoplasmático solo es posible con un número limitado de métodos. Los experimentos de perfil de ribosoma basados en ARN-seq en todo el transcriptoma se encuentran entre las fuentes de datos más informativas para el control de la traducción. Sin embargo, la ausencia de una estabilización intermedia uniforme de ARN y ARN:proteína puede conducir a diferentes sesgos, particularmente en las vías de respuesta celular de ritmo rápido. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado de fijación rápida aplicable a las células eucariotas de diferente permeabilidad, para ayudar en la estabilización intermedia de ARN y ARN: proteína. Además, proporcionamos ejemplos de aislamiento de los complejos estabilizados de ARN:proteína en función de su co-sedimentación con fracciones ribosómicas y poli(ribo)somales. El material estabilizado separado se puede utilizar posteriormente como parte de experimentos de tipo perfilado de ribosomas, como en el enfoque de secuenciación de perfiles complejos de traducción (TCP-seq) y sus derivados. La versatilidad de los métodos de estilo TCP-seq ahora ha sido demostrada por las aplicaciones en una variedad de organismos y tipos de células. Los complejos estabilizados también pueden ser purificados por afinidad y fotografiados utilizando microscopía electrónica, separados en diferentes fracciones poli(ribo)somales y sometidos a secuenciación de ARN, debido a la facilidad de la inversión de reticulación. Por lo tanto, los métodos basados en el enfriamiento por instantáneas y la fijación de formaldehído, seguidos por el enriquecimiento del complejo ARN:proteína basado en sedimentación u otro tipo, pueden ser de particular interés en la investigación de detalles más finos de la dinámica rápida del complejo ARN:proteína en células vivas.

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Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Presentamos una técnica para estabilizar rápidamente complejos traslacionales (biosíntesis de proteínas) con reticulación de formaldehído en levaduras vivas y células de mamíferos. El enfoque permite diseccionar intermedios transitorios e interacciones dinámicas ARN:proteína. Los complejos reticulados se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores, como en métodos de perfiles basados en secuenciación profunda, microscopía y espectrometría de masas.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

El flujo de trabajo consiste en cultivar células en condiciones ambientales estrictamente controladas, enfriarlas rápidamente utilizando agua de fusión / hielo y fijarlas con una concentración preoptimizada de formaldehído y tiempo de incubación. La reacción de fijación se apaga utilizando el exceso de compuestos que contienen grupos amino primarios, como la glicina o los tryps. Las células se recogen, se lavan y se pueden almacenar congeladas.Las células fijas se pueden lisar mecánica o químicamente, y el lisado se utiliza para la separación de las fracciones ribosómicas en función de su tamaño molecular, propiedades de sedimentación o marcadores de afinidad. El enfoque da como resultado un material versátil utilizable para la purificación y detección inmunoasistida, el enriquecimiento de complejos que contienen factores específicos en microscopía electrónica. Tras el bloqueo profundo reticulado, la amplificación de ARN o los análisis basados en hibridación, la secuenciación de ARN y la espectrometría de masas se vuelven posibles.Configure un cultivo de levadura de un litro en un agitador orbital con una densidad óptica inicial de no más de 0,05 unidades de absorbancia a 600 nanómetros y use medios de peptona y dextrosa a 30 grados centígrados. Instale una centrífuga preparativa con botellas de rotor y centrífuga compatibles para peletizar la suspensión líquida de las células de levadura a 5000 G a cuatro grados centígrados. Mantenga un registro de la densidad óptica de las células en crecimiento.Debe estar entre 0,6 a 0,8 unidades de absorbancia y 600 nanómetros en el momento de la recolección si la fase de crecimiento exponencial es de interés. Una vez que las células estén listas, coloque una caja de hielo dentro de la campana de humos químicos con un panadero que contenga 250 gramos de hielo de agua triturada limpia y muéstrele también 25 mililitros de tripsina y solución de metanol estabilizado al 37% formaldehído recién comprado dentro de la campana. Vierta el último cultivo celular en el panadero que contiene el hielo.Luego agregue 75 mililitros de formaldehído al 37% a una concentración final de 2.2% de peso sobre el volumen, revuelva intensamente la mezcla hasta que el hielo se derrita. Una vez que el hielo se derrita, configure un temporizador durante 10 minutos Después de incubar durante 10 minutos, transfiera el cultivo a las botellas de centrífuga preenfriadas y gine las células por centrifugación a cuatro grados centígrados, 5000 G durante cinco minutos. Mientras está el centrifugado, enfríe previamente un tubo de 50 mililitros y mantenga el tampón A recién preparado que contiene glicina para neutralizar cualquier formaldehído restante en el hielo.Después de centrifugar, coloque los tubos de la centrífuga sobre hielo con el lado del pellet en contacto con el hielo. Lleve los tubos a la campana extractora de humos y deseche el sobrenadante en un contenedor de residuos de formaldehído. Vuelva a suspender el pellet celular de tubos viejos en 20 mililitros de tampón A usando una stripette de 25 mililitros y transfiriéndolo a un tubo de 50 mililitros.Suba el volumen a 40 mililitros con tampón A y recoja las celdas de lavado por centrifugación de cuatro grados centígrados, 5000 G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en un tampón A de 40 mililitros, que es el tampón A que no contiene glicina para eliminar la contaminación por glicina. Pellet las células de nuevo por centrifugación a cuatro grados centígrados, 5000 G cinco minutos.Repetir los lavados con tampón A uno, una vez más. Deseche el sobrenadante y coloque el gránulo celular sobre hielo. Pesar el tubo con el pellet, la masa celular húmeda debe ser de aproximadamente un gramo por un litro del cultivo celular.Llene el poliestireno de la caja forrada con papel de aluminio con nitrógeno líquido a una profundidad de aproximadamente tres centímetros. Coloque en el tubo de 50 mililitros en posición vertical en la caja. Vuelva a suspender el pellet en 550 microlitros de tampón A dos mediante pipeteo y vórtice durante 10 segundos.Agregue 10 microlitros de 40 unidades por inhibidor de la RNasa de microlitro y vórtice nuevamente durante 10 segundos. Usando una pipeta de un mililitro, gotee la suspensión celular en el dos de 50 mililitros que contiene el nitrógeno líquido. Para prepararse para el siguiente paso, preenfríe tubos libres de núcleo de 1,5 mililitros en hielo seco y frascos de molienda de acero inoxidable de 10 mililitros.Transfiera las gotas de suspensión de células congeladas a los frascos usando una espátula estéril limpia. Sumerja los frascos de molienda en nitrógeno líquido durante un minuto, asegurando que la fase líquida permanezca por encima de la unión. Instale un molino mezclador Cryo a 27 Hertz para agitar durante un minuto.Agite los frascos de molienda sellados a 27 Hertz durante un minuto en el molino mezclador. Vuelva a enfriar los frascos en nitrógeno líquido como antes y agite durante un minuto más. Transfiera los frascos a la caja de hielo que contiene hielo seco junto con los tubos libres de núcleo de 1,5 mililitros.Usando una pequeña espátula de acero, transfiera los resultados en la fecha de molienda acolchada en los tubos. Luego guarde los tubos a menos 80 grados centígrados. En dos matraces T175 crecen células HEK 293 a 60 a 70% de confluencia y el medio Eagle modificado de Dalbeko y el suero bovino fetal de 10% a 37 grados y 5% de dióxido de carbono.Al menos tres horas antes del tiempo de fijación deseado, reemplace el soporte del matraz T175 con exactamente 30 mililitros de medios completos precalentados. Prepare una caja de hielo hasta el borde con hielo de agua triturada y manténgala en la campana de humos junto con los amortiguadores requeridos, también un hielo. Para enfriar las células, retire el matraz T175 de la incubadora y presiónelo formalmente contra el hielo asegurando el máximo contacto con la superficie.Dentro de una campana de humos químicos, incline el matraz hacia un lado para que el medio se acumule en el lado opuesto a las células. Pipete 168 microlitros de 37% pesados por volumen formaldehído directamente en el medio agrupado. Dando una concentración final de 0,2% de formaldehído.Mezclar inmediatamente. Incubar los matraces en hielo durante 10 minutos más. Vierta el medio en un recipiente de desechos apropiado a través del lado del matraz opuesto a las celdas.Usando un strippete, pipete en 30 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dalbeko sin iones de calcio y magnesio y que además contiene 50 milimolares de glicina suavemente en el lado opuesto a las células. Mezclar meciendo el matraz, devolver el destello a posición horizontal e incubar durante 10 minutos más sobre hielo. Vierta la solución a través del lado del matraz opuesto a la celda y agregue suavemente siete mililitros de solución estándar de EDTA de tripsina al 0,25% para separar y volver a suspender las células.Incubar el matraz a temperatura ambiente durante cinco, máximo 10 minutos. Ubique el matraz verticalmente y con un strippete, recoja las celdas desprendidas lavando suavemente los restos de las paredes del matraz y transfiera la suspensión a un tubo de 50 mililitros sobre hielo. Complemente inmediatamente la solución de suspensión recolectada con 20 mililitros de medios completos y mezcle volteando suavemente el tubo.Granular las células centrifugando el tubo a 100 G durante cinco minutos y cuatro grados centígrados. El pellet celular debe ser claramente visible. Vierta el medio y vuelva a suspender suavemente el pellet en 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dalbeko sin glicina.Centrifugar el tubo de nuevo a 100 G durante cinco minutos y a cuatro grados centígrados Verter el tampón de lavado y volver a suspender el pellet en 800 microlitros de solución salina tamponada con fosfato de Dalbeko helada sin glicina, pero que contiene iones de magnesio y calcio. Transfiera las células resuspendidas a un nuevo tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros de baja unión a proteínas. Centrifugar el tubo a 100 G durante tres minutos a cuatro grados centígrados.Deseche cuidadosamente el sobrenadante usando una pipeta de mililitros. En esta etapa, el pellet celular se puede congelar a menos 80 grados centígrados o proceder a la etapa de lisis celular. En un gabinete de bioseguridad agregue 300 microlitros de tampón de lisis a base de detergente no iónico, no desnaturalizante y siete microlitros de inhibidor de arginasa y mezcle bien mediante pipeteo con una punta de mililitro.Conecte cuidadosamente una aguja de calibre 25 a una jeringa de uno a tres mililitros y pipetee vigorosamente la mezcla utilizando al menos siete golpes de admisión lenta hacia arriba y rápido hacia abajo. Deseche la jeringa y la aguja en el contenedor del afilador y repita el procedimiento con una aguja de calibre 31 y una jeringa de 0,3 mililitros. Deseche la jeringa y la aguja en el contenedor del afilado.Centrifugar el tubo a 12. 000 G durante cinco minutos a cuatro grados para eliminar los restos celulares. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 mililitros. Almacene tanto los restos celulares como el lisado a menos 80 grados centígrados.Los complejos traslacionales son sensibles a la composición iónica de los tampones. La omisión de cloruro de magnesio y la adición de EDTA abrogaron altas propiedades de sedimentación, y aunque el cloruro de calcio dio lugar a mejores picos de resultados, la mejora fue marginal. Por lo tanto, seleccionamos el búfer uno.El 2,2% en peso por volumen formaldehído preservó excelentemente los polisomas y no disminuyó el rendimiento general en comparación con el 4% en peso por volumen formaldehído. En las células de mamíferos, se utilizó una concentración mucho menor de formaldehído de 0,2% en peso por volumen. A medida que las concentraciones más altas resultaron en una pérdida sustancial de material poliribosomal.15 milimolares EDTA añadidos al lisado y todos los tampones posteriores exhibieron un efecto de desestabilización distintivamente menor en las fracciones polisomales, derivadas de las células fijas. Y este efecto se replicó parcialmente con EDTA 50 milimolares con material de células fijas al 4%, resistiendo, desplegándose mejor. El agotamiento de la glucosa provoca uno de los efectos inhibitorios de traducción más dramáticos y rápidos sobre la levadura.Tanto el nervio añadido como las condiciones de causa local inducidas por el desmontaje de polisomas fue leve, pero evidentemente más polisomas retenidos en la glucosa agregada baja. Es importante destacar que el material polisomal de las células fijas demuestra una alta distinción entre las células hambrientas y las no hambrientas, lo que indica la idoneidad de la fijación de formaldehído para preservar las diferencias en los procesos de traslación dinámicos. En enfoques como el paysake tacy, también puede ser perspicaz eliminar pequeñas subunidades ribosómicas que no se asientan bien con los rizomas completos para los que empleamos una ultracentrifugación de dos etapas, lo que permite el aislamiento de SSU, LSU, RS, diazomas resistentes a la RNasa, DS y polisomas de alto orden confirmados por microscopía electrónica de las fracciones fijas.En comparación con las células no fijas, el material de las células fijas demostró una presencia elevada de eIF4A lábil en las fracciones ribosómicas de sedimentación más rápidas. Utilizando material fijo de la cepa eIF4A tapi para capturar y enriquecer eIF4A que contiene complejos con perlas magnéticas IDG, pudimos observar un enriquecimiento selectivo de la eIF4A en comparación con la beta-actina en SSU y RS, pero no fracciones LSU del segundo gradiente en el desmontaje de RNase one. En comparación con otros métodos de reposo traslacional, la rapidez de la acción del formaldehído a través de las membranas celulares y la naturaleza indiscriminada de los enlaces cruzados prometen la preservación de la máxima diversidad de los intermedios complejos de traducción.Nuestros hallazgos conforman la usabilidad de la fijación rápida de formaldehído para estabilizar complejos altamente transitorios y evidencian la utilidad en los escenarios de respuestas celulares rápidas a cambios ambientales o condiciones de estrés.

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Biology

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

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