Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Australian Research Council Discovery Project grant (DP1801001111 till T.P. och N.E.S), National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 till N.E.S.) och Research Fellowship (APP1135928 till T.P.). Författarna erkänner faciliteterna i Microscopy Australia vid Centre for Advanced Microscopy, Australian National University, en anläggning som finansieras av universitetet och den federala regeringen.

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Formaldehydfixering är en bekväm och populär metod för att uppnå snabb in vivo-korslänkning av biomolekyler10,36,45,46,47,48. Jämfört med de andra potentiella biomolekylära målen kräver framgångsrik fångst av translationella komplex en omedelbar fixering under snapkylan av cellerna eller annat material. Utan den odelade stabiliseringen finns det en potential för olika översättningsrelaterade processer att fortsätta, vilket flyttar den komplexa fördelningen bort från det ostörda in vivo-tillståndet 49. Jämfört med de andra metoderna för translationell arrestering och ribosomal komplex stabilisering, snabbheten av formaldehydverkan över cellmembran och korslänkarnas urskillningslösa natur lovar bevarandet av den maximala mångfalden av översättningskomplexet intermediärer närmare deras infödda distribuerade tillstånd50.
Tillvägagångssättet som presenteras här har etablerats och optimerats i både jäst- och däggdjursceller, och metoder har nu härletts av andra grupper för användning över mer olika biologiska material, såsom i hela ryggradsdjur (t.ex. zebrafiskembryon)10,38,39,49,51,52 . Även om dessa verk kollektivt lugnar mångsidigheten och den breda tillämpligheten av metoden, kan snabb formaldehyd tvärbindning av translationella komplex anses vara något svårt att överföra till nya typer av biologiskt material på grund av behovet av optimeringar och justeringar.
Ett främsta krav för att metoden ska lyckas är omoptimering av koncentrationen av formaldehyden och cellinsamlings- och störningstekniken. Mindre genomsläppliga, små och runda jästceller kräver mycket högre (åtminstone 10-faldig) formaldehydkoncentration och fysisk störning av de fasta cellerna. Däremot kan stora och tillplattade vidhäftande däggdjursceller i kulturen lätt överfixeras och kräva skonsam hantering vid fixering, medan extraktionen av de fasta komplexen kan utföras kemiskt med membranstörning med tvättmedel. Underlänkning kan göra det möjligt för mindre stabila eller mer kortlivade intermediärer att separera eller läcka in i ett senare tillstånd. Överlänkning kan påverka förmågan att isolera och studera ribosomala fraktioner negativt och kan skapa selektiva fördomar såsom djupare utarmning av tunga komplex. I vår observation, även mindre förändringar, såsom den typ av vidhäftande mänskliga celler som används, kan påverka utbytet av de återvunna tvärbundna komplexen och kan kräva omoptimering av tvärbindning regim. Vi kan också förvänta oss att celler med väsentligt olika permeabilitetsegenskaper, såsom växtceller, kommer att kräva ytterligare omfattande optimering av fixeringsförhållandena52. Ändå är det svårt att föreställa sig en typ av biologiskt material som skulle vara helt oförenligt med tillvägagångssättet.
En faktor som är relevant för protokollet för fixering av däggdjur är densiteten och mängden cellmaterial som används som indata. Det rekommenderas att cellerna kontinuerligt växer utan återsådd eller andra störtdyningar i minst 2 dagar för att undvika yttre påverkan på cellulär översättningsdynamik. Tillämpligt för de flesta celltyper, men för de flesta vidhäftande celler uppnås konsekvent sammanflödesnivåer på högst 70% kommer att säkerställa avsaknad av större kontakthämningseffekter som kan påverka översättningsfrekvensen negativt och oförutsägbart.
En annan intressant, och potentiellt unikt bekväm, egenskap hos formaldehydfixering som härrör från dess urskillningslösa reaktivitet är stabiliseringseffekten på translationella komplex i system av blandad taxonomi. Bakteriella, och ännu mer translationella komplex av mitokondrier, kloroplaster och olika intracellulära parasiter, har varit notoriskt svåra att rikta in sig på med specifika översättningshämmare. I TCP-seq-data kan däremot fotavtrycksmappning till mitotranskriptom lätt observeras i data38,39,50. En intressant efterföljande utveckling skulle kunna vara användningen av metoden för att undersöka översättning i hela mikrokommuner, till exempel i jord-, vatten- eller tarmprover, där tillförlitlig snabb translationell arrestering och komplex stabilisering med andra medel skulle vara problematisk.
Det bör också nämnas att för det mest komplicerade materialet (såsom hårda och/ eller skrymmande vävnader) förhindrar ingenting användning av formaldehydstabilisering omedelbart vid cellstörning och material homogenisering. Detta tillvägagångssätt används redan ofta för att ta bort cellinträdefördröjningen vid stabilisering av translationella komplex med specifika små molekylhämmare33,53,54,55. Med tanke på att formaldehydfixering traditionellt har använts med utmärkta resultat för ex vivo/ in vitro-provstabilisering i applikationer som elektronmikroskopi45,56,57,58, kan vi förvänta oss ännu mindre negativa effekter i detta fall, särskilt de som är förknippade med dålig extraktion av translationella komplex från de noggrant fasta cellerna.
Våra resultat bekräftar användbarheten av snabb formaldehyd fixering för att stabilisera mycket övergående komplex, såsom de som inkluderar eIF4A. Det är anmärkningsvärt att jäst eIF4A, till skillnad från däggdjur, är mycket svagare förknippad med locket bindande komplex eIF4F och, som ett resultat, translationella komplex i allmänhet. eIF4A går vanligtvis förlorad under någon omfattande rening av ribosommaterialet i jäst29,59,60,61,62,63. Ändå är det i in vivo-fastjästmaterial möjligt att uppnå tillförlitlig berikning av eIF4A i alla fraktioner av translationella komplex där dess närvaro skulle förväntas. De tidigare publicerade Sel-TCP-seq-data har visat berikningen av eIF2 och eIF3 som starkare associerar med ribosomerna (men också visade övergående förekommande samöversättningsproteinkomplexsammansättning)39. Således är metoden lämplig för detektion av både, starkare och svagare bifogade beståndsdelar i translationella komplex.
Sammanfattningsvis har vi presenterat ett tillvägagångssätt som är användbart för att få insikter främst om de förändringar som sker i initieringsfasen av översättning och när minimalt störd ribosomal fördelning över mRNA krävs. Viktigt är att metoden är lämplig för stabilisering av relativt labila och dynamiska komponenter i translationella komplex, såsom eIF4A, och kan användas i stort sett föremål för nödvändiga optimeringar. Vi har också lagt fram bevis för nyttan av formaldehydfixering i scenarierna för snabb dynamisk förändring av översättningen, vilket öppnar upp undersökningsområden som snabba cellulära svar på miljöförändringar eller stressförhållanden.

Levande organismer är föremål för dynamiska intra- och extracellulära förändringar under hela sin livslängd, vilket kräver snabba svar för att upprätthålla homeostas och säkerställa överlevnad. För att möjliggöra miljöanpassning justerar eukaryota celler sin ämnesomsättning via genuttryckskontroll. Genuttryckskontroll kan utövas under transkription och/eller översättning; med translationella svar som i allmänhet förekommer snabbare1,2,3,4. Till exempel uppstår translationella förändringar vanligtvis inom 1-30 minuter från stressutbrottet, medan förändringar på transkriptionsnivå följer timmar efter stressexponering3,4,5. Ändringar av översättningsutmatningen uppnås snabbare på grund av den ihållande tillgången på budbärarmolekyler (m)RNA i cytoplasma. Omvänt, på transkriptionsnivå, måste nya mRNA-molekyler syntetiseras, och i eukaryoter, bearbetas och exporteras från kärnan, vilket ger omfattande förseningar i svarstiden2,4,6,7,8.
Akut translationellt svar på stress kännetecknas i allmänhet av en övergripande minskning av översättningsproduktionen, med selektiv uppreglering av proteiner som är nödvändiga för cellens överlevnad1,3,4,9. Att minska produktionen av protein anses vara avgörande på grund av de höga energikostnaderna för processen3,7. För att underlätta selektiv hämning och uppreglering betjänas translationella svar av en rad komplexa regleringsmekanismer. Reglering kan utövas i alla översättningsfaser: initiering, förlängning, upphörande av polypeptidbiosyntes och ribosomal återvinning10,11,12,13, men ställs starkast ut i inledningsfasen5,7,9,10,13. Under initieringen binder den lilla ribosomala underenheten (SSU), assisterad av eukaryota initieringsfaktorer (eIF), till och skannar 5' oöversatta regionen (UTR) av mRNA tills en startkodon känns igen2,5,6,8,11,12,13. Regleringsmekanismer riktar sig ofta mot eTI:er som påverkar bifogade filer, skanning och start av kodonigenkänning. Initieringsfaktorn eIF2, en väsentlig översättningsfaktor som bidrar till rekryteringen av en initiativtagare Met-tRNAiMet SSU, ofta är inriktad på eukaryoter under stressförhållanden4,6,11. I jäst kan fosforylering av denna faktor induceras under näringsbrist och osmotisk stress1,4,11,14,15, och i däggdjursceller, aminosyrasvält, endoplasmisk retikulum (ER), UV-stress, virusinfektion och förändrade syrenivåer kan utlösa detta svar8,9,11. Snabb uppreglering av specifika mRNA översättning är uppenbart i däggdjur cellen svar på hypoxi, som uppvisar en global snabb översättning hämning och selektiv uppreglering av hypoxi-inducible faktorer (HIFs) biosyntes. HIFs är transkriptionsfaktorer, som sedan framkallar mer långsiktig cellulär omprogrammering på DNA-transkriptionsnivå8,9,16. Liknande svar har observerats hos jäst under värmestress, med snabbt translationellt uttryck av värmechockproteiner (HSP) följt av fördröjda transkriptionssvar17,18. Förutom näringsbrist och värmechock har translationella reaktioner i jäst studerats under varierande syre8,19salinitet5, fosfat, svavel20,21 och kväve22,23 Nivåer. Denna forskning har omfattande konsekvenser för den industriella användningen av jäst, såsom bakning och jäsning24,25. Translationella svar kan också vara avgörande för att främja förståelsen av sjukdomar som neurodegenerativa sjukdomar och hjärtsjukdomar, som kännetecknas av intracellulära påfrestningar som oxidativ stress. Sammantaget är translationella svar integrerade i genuttryckskontrollen och underlättar snabb anpassning till ett brett spektrum av stressförhållanden i eukaryota organismer.
För att studera translationella svar krävs metoder som ger minimalt förvrängda ögonblicksbilder av översättningslandskapet. Polysomprofilering är ett klassiskt tillvägagångssätt som används vid studier av översättning över mRNA, som inbegriper separation av poly(ribo)somala fraktioner av mRNA via ultracentrifugation genom sackaros gradienter26,27. Metoden kan användas för att utforska översättningsnivåer för enskilda mRNAs (med detektionsmetoder som omvänd transkription och polymeraskedjereaktion, RT-PCR26), eller globalt i kombination med höggenomströmningstekniker (mikroarray eller RNA-seq28,29). Ett mer utvecklat tillvägagångssätt är ribosomprofilering, som gör det möjligt att studera positioner av långsträckta ribosomer längs en mRNA-molekyl i en genomomfattande skala, liksom slutsatsen av effektiviteten av översättning över transkriptom och användning av de viktigaste och alternativa startplatserna30,31. Ribosom profilering innebär isolering och sekvensering av mRNA fragment skyddas av ribosomal närvaro över dem. Ribosomprofilering har gett betydande inblick i översättningsdynamiken under ett antal förhållanden, inklusive hypoxisk stress, värmechock och oxidativ stress31,32. Tekniken har anpassats till flera källmaterialtyper, inklusive jäst och däggdjursceller.
Medan polysom- och ribosomprofilering har varit grundläggande för att utöka förmågan till forskning inom översättning, innehåller översättningsprocessen olika translationella intermediärer och komplex som är svåra att fånga med dessa metoder11,13. En ytterligare begränsning härrör från bristen på förmåga att studera snabbsvarstyper, eftersom translationella komplex antingen stabiliseras in vivo genom tillsats av specifika översättningshämmare (antibiotika), vilket leder till vissa ribosomfördelningsartefakter, eller ex vivo på celllys specifikt (antibiotika) eller ospecificerat (höga salt- eller magnesiumjoner), vilket leder till berövande av de kortare eller mindre stabila intermediärerna33, 34,35.
Formaldehyd används ofta för att korslänka nukleinsyror och proteiner, såsom i kromatinimmunprecipitation (ChIP) och korslänkande immunoprecipitation (CLIP) studier. Dess lilla storlek och utmärkta cellgenomsläpplighet möjliggör en snabb in vivo-åtgärd 36. Baserat på den snabba korslänkningen av formaldehyd har ribosomprofileringsmetoden utökats med translation komplex profilsekvensering (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, som först utvecklades i jäst, gör det möjligt att fånga alla översättningsmediärer, inklusive skannings- eller efterterminering av SSU-komplex och flera ribosomkonfigurationer37,38,41,42. Metoden har använts i flera studier10,38,39,41,42, varav några använder en kombinatorisk metod av både översättningshämmare och formaldehydkorslänkning för att underlätta gripandet av översättning. En ytterligare modifierad version av tekniken, selektiv TCP-seq39, har nyligen använts för att inkludera immunspurifiering av de tvärbundna komplexen, vilket breddar omfattningen av TCP-seq-applikationerna. Den snabba, effektiva och reversibla karaktären hos formaldehydkrysslänkning gör dessa metoder lämpliga för att studera transienta mRNA: översättning komplexa interaktioner, särskilt i samband med mycket dynamiska översättning-nivå svarsvägar.
Här beskriver vi processerna för in vivo formaldehyd tvärbindning i syfte att omfattande översättning komplex stabilisering och isolering. Vi tillhandahåller separata protokoll nyanserade för jäst och däggdjursceller (figur 1). Vi beskriver vidare exempel på den efterföljande användningen av det tvärlänkstabiliserade materialet (figur 1), såsom för samrenad proteinfaktordetektering med immunoblotting (western-blotting), immunassisterad rening (eller "immunoprecipitation"; IP) och anrikning av translationella komplex som innehåller specifika intressefaktorer, elektronmikroskopi och RNA-sekvensering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> Bild 1: Schematisk som visar en översikt över den typiska experimentella installationen. Huvudstegen för in vivo-formaldehydstabilisering av translationella komplex beskrivs som ett flödesschema, kompletterat med information om de viktigaste nödvändiga instrumenten. Potentiella nedströmsapplikationer av det tvärbundna materialet beskrivs, inklusive exempel som framgångsrikt har använts men inte direkt omfattas av detta protokoll, såsom SPRI-pärlarening av RNA, RNA-sekvensering och masspektrometri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

Snabba svar som involverar snabb omfördelning av messenger(m)RNA och ändringar av mRNA översättning är relevanta för pågående homeostatic justeringar av cellerna. Dessa justeringar är avgörande för eukaryota cellöverlivbarhet och "skadekontroll" under fluktuerande närings- och salthaltsnivåer, temperatur och olika kemiska och strålningsspänningar. Tack vare den högt dynamiska naturen av RNA-jämna svar, och instabiliteten av många av RNA:RNAEN och RNA:proteininteriärerna, erhålla en meningsfull ögonblicksbild av cytoplasmic RNAen påstår är endast möjligheten med ett inskränkt numrerar av metoder. Transkriptomomfattande, RNA-seq-baserade ribosomprofileringsexperiment är bland de mest informativa källorna till data för kontroll av översättning. Avsaknad av ett enhetligt RNA och RNA:protein mellanliggande stabilisering kan dock leda till olika fördomar, särskilt i de snabba cellulära svarsvägarna. I den här artikeln tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för snabb fixering tillämpligt på eukaryota celler av olika permeabilitet, för att hjälpa till i RNA och RNA:protein mellanliggande stabilisering. Vi ger ytterligare exempel på isolering av stabiliserade RNA: protein komplex baserat på deras co-sedimentation med ribosomal och poly (ribo)somal fraktioner. Det separerade stabiliserade materialet kan därefter användas som en del av ribosomprofileringsexperiment, till exempel i TCP-seq-metoden (Translation Complex Profile sekvensering) och dess derivat. Mångsidigheten hos TCP-seq-stilmetoderna har nu visats av applikationerna i en mängd olika organismer och celltyper. De stabiliserade komplexen kan också dessutom affinitetrenas och avbildas med hjälp av elektronmikroskopi, separeras i olika poly(ribo)somala fraktioner och utsättas för RNA-sekvensering, på grund av hur lätt tvärlänkåterföringen är. Därför kan metoder baserade på snap-kylning och formaldehydfixering, följt av sedimenteringsbaserad eller annan typ av RNA:proteinkomplex berikning, vara av särskilt intresse för att undersöka finare detaljer om snabb RNA:proteinkomplex dynamik i levande celler.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Vi presenterar en teknik för att snabbt stabilisera translationella (protein biosyntes) komplex med formaldehyd tvärbindning i levande jäst och däggdjursceller. Metoden gör det möjligt att dissekera transienta intermediärer och dynamiska RNA:proteininteraktioner. De tvärlänkade komplexen kan användas i flera nedströms program, till exempel i djup sekvenseringsbaserade profileringsmetoder, mikroskopi och masspektrometri.

Snabb in vivo-fixering och isolering av translationella komplex från eukaryota celler

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Arbetsflödet består av odling av celler under strikt kontrollerade miljöförhållanden, som snabbt kyler dem med smältande vatten/is och fixerar med föroptimerad koncentration av formaldehyd och inkubationstid. Fixeringsreaktionen släcks sedan med hjälp av överskott av primära aminogruppinnehållande föreningar, såsom glycin eller tryps. Celler samlas in, tvättas och kan förvaras frysta.Fasta celler kan vara mekaniskt eller kemiskt lyserade, och lysat används för separation av ribosomalfraktionerna baserat på deras molekylära storlek, sedimenteringsegenskaper eller affinitetsmarkörer. Tillvägagångssättet resulterar i mångsidigt material som kan användbart för immuno assisterad rening och detektion, anrikning av komplex som innehåller specifika faktorer i elektronmikroskopi. Vid korslänkad djupblockering blir RNA-förstärkning eller hybridiseringsbaserade analyser, RNA-sekvensering och masspektrometri möjliga.Sätt upp en enlitersjästkultur i en orbital shaker med en start optisk densitet på högst 0,05 absorbansenheter på 600 nanometer och använd pepton- och dextrosmedier vid 30 grader celsius. Sätt upp en preparativ centrifug med kompatibla rotor- och centrifugflaskor för pelletering av den flytande suspensionen av jästceller vid 5000 G vid fyra grader celsius. Håll register över de växande cellernas optiska densitet.Det måste vara mellan 0,6 och 0,8 absorbansenheter och 600 nanometer vid insamlingstillfället om den exponentiella tillväxtfasen är av intresse. När cellerna är klara sätter du upp en frysbox inuti den kemiska rökhuven med en bagare som innehåller 250 gram ren krossad vattenis och visar dig också 25 milliliter trypsin och nyinköpt metanolstabiliserad 37% formaldehydlösning inuti huven. Häll den senaste cellkulturen i bagaren som innehåller isen.Tillsätt sedan 75 milliliter 37% formaldehyd till en slutlig koncentration av 2,2% vikt över volymen omrör blandningen intensivt tills isen smälter. När isen har smält, sätt upp en timer i 10 minuter Efter inkubation i 10 minuter, överför kulturen till de förkylda centrifugflaskorna och pellet cellerna genom centrifugering vid fyra grader celsius, 5000 G i fem minuter. Medan spinn är, på förkyla ett 50 milliliter rör och håll nyberedd buffert A som innehåller glycin för att neutralisera eventuell återstående formaldehyd på is.Efter centrifugering placerar du centrifugrören på is med pelletssidan i kontakt med isen. Ta in rören i rökhuven och kasta supernatanten i en behållare för formaldehydavfall. Suspendera cellpelleten från gamla rör i 20 ml buffert A med en 25 ml rand och överföras till ett 50 ml rör.Gör upp volymen till 40 milliliter med buffert A och samla tvättcellerna genom centrifugering av fyra grader celsius, 5000 G i fem minuter. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten i 40 ml buffert A, som är buffert A som inte innehåller glycin för att avlägsna glycinförorening. Pellet cellerna igen genom centrifugering vid fyra grader celsius, 5000 G fem minuter.Upprepa tvättarna med buffert A en gång till. Kassera supernatanten och placera cellpelleten på is. Väg röret med pelleten, den våta cellmassan ska vara ungefär ett gram per liter av cellkulturen.Fyll upp polystyren från låda fodrad med aluminiumfolie med flytande kväve till ett djup av cirka tre centimeter. Placera vid 50 ml rör upprätt i lådan. Suspendera pelleten i 550 mikroliter buffert A två genom pipettering och virvel i 10 sekunder.Tillsätt 10 mikroliter på 40 enheter per mikroliter RNase-hämmare och virvel igen i 10 sekunder. Droppa cellupphängningen i de 50 ml som innehåller det flytande kvävet med en milliliter. För att förbereda dig för nästa steg, förkyla 1,5 milliliter kärnfria rör på torris och 10 milliliter rostfria slipburkar.Överför de frysta cellfjädringsdropparna i burkarna med en ren steril spatel. Doppa slipburkarna i flytande kväve i en minut, vilket säkerställer att vätskefasen förblir ovanför korsningen. Sätt upp en Cryo blandningsfabrik vid 27 Hertz för omrörning i en minut.Omrör de förseglade slipkanorna vid 27 Hertz i en minut i mixerkvarnen. Kyl burkarna i flytande kväve som tidigare och skaka ytterligare en minut. Överför burkarna till islådan som innehåller torris tillsammans med de 1,5 milliliter kärnfria rören.Använd en liten stålspatel överför resultaten i vadderat slipdatum till rören. Förvara sedan rören på minus 80 grader celsius. I två T175-flaskor växer HEK 293 celler till 60 till 70% sammanflöde och Dalbekos modifierade Eagle medium och 10% fetala nötkreatur serum vid 37 grader och 5%koldioxid.Minst tre timmar före önskad fixeringstid, byt ut T175-kolvens media med exakt 30 ml förvärmt helmedium. Förbered en frysbox till brädden med krossad vattenis och håll i rökhuven tillsammans med nödvändiga buffertar, även en is. För att kyla cellerna, ta bort T175-kolven från inkubatorn och tryck den formellt mot isen för att säkerställa maximal ytkontakt.Luta kolven på sidan inuti en kemisk rökhuv så att mediet samlas på sidan mittemot cellerna. Pipetten 168 mikroliter på 37% vägda med volymformaldehyd direkt i det poolade mediet. Ger en slutlig koncentration på 0,2% formaldehyd.Blanda omedelbart. Inkubera kolvarna på is i ytterligare 10 minuter. Häll av mediet i en lämplig avfallsbehållare genom kolvsidan mittemot cellerna.Pipetten i 30 milliliter av Dalbekos fosfatbuffrade saltlösning utan kalcium- och magnesiumjoner och innehåller dessutom 50 millimoler glycin försiktigt på sidan mittemot cellerna. Blanda genom att gunga kolven, sätt tillbaka blixten till horisontellt läge och inkubera i 10 minuter mer på is. Häll av lösningen genom kolvsidan mittemot cellen och tillsätt försiktigt sju milliliter standard 0,25% trypsin EDTA-lösning för att lossa och suspendera cellerna igen.Inkubera kolven i rumstemperatur i fem, maximalt 10 minuter. Placera kolven vertikalt och använd en strippa, samla upp de lossnade cellerna genom att försiktigt tvätta eventuella återstående från kolvväggarna och överför suspensionen till ett 50 ml-rör som är inställt på is. Komplettera omedelbart den insamlade suspensionslösningen med 20 ml komplett media och blanda genom att försiktigt vända röret.Pellet cellerna genom att centrifugera röret vid 100 G i fem minuter och fyra grader celsius. Cellpelleten måste vara väl synlig. Häll av mediet och suspendera försiktigt pelleten i 10 milliliter av Dalbekos fosfatbuffrade saltlösning utan glycin.Centrifugera röret igen vid 100 G i fem minuter och vid fyra grader Celsius Häll av tvättbufferten och suspendera pelleten i 800 mikroliter iskall Dalbekos fosfatbuffrade saltlösning utan glycin, men innehållande magnesium och kalciumjoner. Överför de igen suspenderade cellerna till ett nytt lågproteinbindningsrör på 1,5 milliliter mikrocentrifuger. Centrifugera röret vid 100 G i tre minuter vid fyra grader celsius.Kassera supernatanten försiktigt med hjälp av en milliliter pipa. I detta skede kan cellpelleten frysas vid minus 80 grader celsius eller fortsätta till celllyssteget. I ett biosäkerhetsskåp tillsätt 300 mikroliter lysbuffert baserad på icke-joniskt, icke-denaterande tvättmedel och sju mikroliter arginashämmare och blanda väl genom pipettering med en milliliterspets.Fäst försiktigt en 25 gauge nål på en en till tre milliliter spruta och rör försiktigt blandningen med minst sju långsamma uppåtgående intag och snabba nedåtriktade avgasslag. Kasta sprutan och nålen i vassens behållare och upprepa proceduren med en 31 gauge nål och 0,3 milliliter spruta. Kasta sprutan och nålen i vassens behållare.Centrifugera röret vid 12 000 G i fem minuter vid fyra grader för att ta bort cellskrotet. Överför supernatanten till ett nytt lågproteinbindningsrör på 1,5 milliliter mikrocentrifuger. Förvara både cellskräpet och lysate på minus 80 grader celsius.Translationella komplex är känsliga för buffertarnas joniska sammansättning. Omittance av magnesiumklorid och tillsats av EDTA abrogerade höga sedimenteringsegenskaper, och medan kalciumklorid resulterade i bättre resultattoppar, var förbättringen marginell. Vi valde alltså buffert ett.2,2% vikt i volym formaldehyd utmärkt bevarade polysomerna och minskade inte den totala avkastningen jämfört med 4% vikt i volym formaldehyd. I däggdjursceller användes en mycket lägre koncentration av formaldehyd på 0,2 volymprocent. Eftersom högre koncentrationer resulterade i betydande polyribosomal material förlust.15 millimolar EDTA läggs till lysat och alla efterföljande buffertar uppvisade särskiljande mindre destabiliseringseffekt på polysomala fraktioner, härledda från de fasta cellerna. Och denna effekt replikerades delvis med 50 millimolar EDTA med material från 4%fasta celler, motstå, utvecklas bättre. Glukos utarmning framkallar en av de mest dramatiska och snabba translationella hämmande effekterna på jäst.Både nerv tillsatt och lokalt orsaka villkor inducerad polysome demontering var något, men uppenbarligen mer polysomer kvar i låg tillsatt glukos. Viktigt är att polysomalt material från de fasta cellerna visar en hög skillnad mellan de svältande och icke-svältande cellerna som indikerar lämpligheten av formaldehyd fixering för att bevara skillnader i dynamiska translationella processer. I tillvägagångssätt som tacy paysake kan det dessutom vara insiktsfullt att ta bort små ribosomala underenheter som inte sambesätter sig bra med de kompletta rhizomerna för vilka vi använde en tvåstegs ultracentrifugation, vilket möjliggör isolering av SSU, LSU, RS, RNase resistenta diazomer, DS och högordningspolysomer som bekräftas av elektronmikroskopi av de fasta fraktionerna.Jämfört med de icke-fasta cellerna visade material från de fasta cellerna förhöjd förekomst av labile eIF4A i de snabbaste sedimenterande ribosomal fraktionerna. Med hjälp av fast material från eIF4A tapi stam för att fånga och berika eIF4A som innehåller komplex med magnetiska IDG pärlor, kunde vi observera selektiv berikning av eIF4A jämfört med beta-aktin i SSU och RS, men inte LSU fraktioner från den andra gradienten på RNase en demontering. Jämfört med andra metoder för translationell vila lovar snabbheten i formaldehydverkan över cellmembran och den urskillningslösa karaktären hos korslänkar bevarandet av den maximala mångfalden av översättningskomplex intermediärer.Våra resultat överensstämmer användbarheten av snabb formaldehyd fixering att stabilisera mycket övergående komplex och bevis"användbarhet i scenarierna för snabba cellulära svar på miljöförändringar eller stress villkor.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolering av labil Multi-proteinkomplex av In vivo Kontrollerad Cellular tvärbindning och Immuno-magnetiska affinitetskromatografi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Fastställande av mikrobiella Eukaryota anrikning kulturer från ett kemiskt Stratifierad Antarktis Lake och bedömning av Carbon Fixering Potential

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv och snabb isolering av tidigt stadium embryon från<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frön

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifiering av posttranslationella modifieringar av växtproteinkomplex

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Ett In vivo Tvärbindning metod att isolera proteinkomplex från Drosophila Embryon

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolering och Funktionell analys av mitokondrier från odlade celler och mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Genomvid Rening av extrakromosomala cirkulär DNA från eukaryota celler

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering av nukleinsyror: En enkel och snabb DNA-extraktion metod

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...