Name: rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi Keşif Projesi hibesi (DP180100111 to T.P. and N.E.S), National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 to N.E.S.) ve Research Fellowship (APP1135928 to T.P.) tarafından desteklendi. Yazarlar, Üniversite ve Federal Hükümet tarafından finanse edilen Avustralya Ulusal Üniversitesi İleri Mikroskopi Merkezi'ndeki Mikroskopi Avustralya'nın tesislerini kabul ediyorlar.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Formaldehit fiksasyonu, biyomoleküllerin10, 36 , 45 ,46,47,48'in hızlı in vivo çapraz bağlanmasının uygun ve popüler bir yöntemidir. Diğer potansiyel biyomolekül hedefleri ile karşılaştırıldığında, çeviri komplekslerinin başarılı bir şekilde yakalanması, hücrelerin veya diğer malzemelerin çıtlatma sırasında anında sabitlenmeyi gerektirir. Tanımlanmamış stabilizasyon olmadan, çeviriyle ilgili farklı süreçlerin devam etme potansiyeli vardır, karmaşık dağılımı bozulmamış in vivo durumdan uzağa kaydırır49. Diğer çevirisel arrest ve ribozomal kompleks stabilizasyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında, hücre zarları arasında formaldehit eyleminin hızlılığı ve çapraz bağlantıların ayrımsız doğası, çeviri karmaşık aralarının yerel olarak dağıtılmış durumlarına daha yakın maksimum çeşitliliğinin korunmasını vaat eder50.
Burada sunulan yaklaşım hem maya hem de memeli hücrelerinde oluşturulmuş ve optimize edilmiştir ve yöntemler artık tüm omurgalılarda (örneğin zebra balığı embriyoları) 10 , 38 ,39,49,51,52gibi daha çeşitli biyolojik materyallerde kullanılmak üzere diğer gruplar tarafından türetilmiştir. . Bu çalışmalar, yaklaşımın çok yönlülüğünü ve geniş uygulanabilirliğini topluca güvence altına alsa da, çeviri komplekslerinin hızlı formaldehit çapraz bağlanması, optimizasyon ve ayarlama ihtiyacı nedeniyle yeni biyolojik malzeme türlerine geçişinin biraz zor olduğu düşünülebilir.
Yöntemin başarısı için en önemli gereklilik formaldehit konsantrasyonunun ve hücre toplama ve bozulma tekniğinin yeniden optimizasyonudur. Daha az geçirgen, küçük ve yuvarlak maya hücreleri çok daha yüksek (en az 10 kat) formaldehit konsantrasyonu ve sabit hücrelerin fiziksel bozulmasını gerektirir. Buna karşılık, kültürdeki büyük ve düzleştirilmiş yapışık memeli hücreleri kolayca aşırı sabitlenebilir ve sabitleme sırasında nazik bir şekilde elleçleme gerektirebilirken, sabit komplekslerin çıkarılması deterjanlar kullanılarak membran bozulması ile kimyasal olarak gerçekleştirilebilir. Çapraz bağlamanın altı, daha az kararlı veya daha kısa ömürlü ara maddelerin daha sonraki bir duruma dağılmasına veya sızmasına izin verebilir. Aşırı çapraz bağlama ribozomal fraksiyonları izole etme ve inceleme yeteneğini olumsuz yönde etkileyebilir ve ağır komplekslerin daha derin tükenmesi gibi seçici önyargılar oluşturabilir. Gözlemimize göre, kullanılan yapışan insan hücrelerinin türü gibi küçük değişiklikler bile, kurtarılan çapraz bağlantılı komplekslerin verimini etkileyebilir ve çapraz bağlama rejiminin yeniden optimizasyonunu gerektirebilir. Ayrıca, bitki hücreleri gibi önemli ölçüde farklı geçirgenlik özelliklerine sahip hücrelerin, sabitleme koşullarının ek kapsamlı optimizasyonu gerektireceğini tahmin edebiliriz52. Yine de, yaklaşımla tamamen uyumsuz bir biyolojik malzeme türü hayal etmek zordur.
Memeli fiksasyon protokolü ile ilgili bir husus, giriş olarak kullanılan hücre malzemesinin yoğunluğu ve miktarıdır. Hücresel çeviri dinamikleri üzerinde dış etkilerden kaçınmak için hücrelerin en az 2 gün boyunca yeniden tohumlama veya diğer pertürbasyonlar olmadan sürekli büyümesi önerilir. Çoğu hücre tipi için geçerlidir, ancak bağlı hücrelerin çoğunluğu için sürekli olarak% 70'ten fazla olmayan birleşme seviyelerine ulaşılması, çeviri oranlarını olumsuz ve öngörülemez bir şekilde etkileyebilecek büyük temas inhibisyon etkilerinin olmamasını sağlayacaktır.
Formaldehit fiksasyonunun ayrım gözetmeyen reaktivitesinden kaynaklanan bir başka ilginç ve potansiyel olarak benzersiz olarak kullanışlı özelliği, karma taksonomi sistemlerindeki çeviri kompleksleri üzerindeki stabilizasyon etkisidir. Mitokondri, kloroplastlar ve farklı hücre içi parazitlerin bakteriyel ve daha da fazla çeviri komplekslerinin belirli çeviri inhibitörleri ile hedeflenebilmesi oldukça zor olmuştur. Buna karşılık, TCP-seq verilerinde, mitotranscriptome ile eşlenen ayak izleri38 , 39,50verilerinde kolayca gözlemlenebilir. Daha sonraki ilginç bir gelişme, güvenilir hızlı çevirisel tutuklama ve diğer yollarla karmaşık stabilizasyonun sorunlu olacağı toprak, su veya bağırsak örnekleri gibi tüm mikro komünitelerde çeviriyi araştırmak için yaklaşımın kullanılması olabilir.
Ayrıca, en karmaşık malzeme (sert ve/ veya hacimli dokular gibi) için, hücre bozulması ve malzeme homojenizasyonu üzerine formaldehit stabilizasyonunun kullanılmasını hiçbir şeyin engellemediği belirtilmelidir. Bu yaklaşım, belirli küçük molekül inhibitörleri33 , 53,54,55ile çeviri komplekslerini stabilize ederken hücre girişi gecikmesini gidermek için zaten sıklıkla kullanılır. Formaldehit fiksasyonunun geleneksel olarak elektron mikroskopisi 45 , 56,57,58gibi uygulamalarda ex vivo / in vitro numune stabilizasyonu için mükemmel sonuçlarla kullanıldığı göz önüne alındığında, bu durumda, özellikle çeviri komplekslerinin iyice sabitlenmiş hücrelerden zayıf çıkarılmasıyla ilişkili olanlar daha da az olumsuz etkiler bekleyebiliriz.
Bulgularımız, eIF4A gibi son derece geçici kompleksleri stabilize etmek için hızlı formaldehit fiksasyonunun kullanılabilirliğini doğrulamamaktadır. Memelilerin aksine, maya eIF4A'nın kapak bağlama kompleksi eIF4F ve sonuç olarak genel olarak çeviri kompleksleri ile çok daha zayıf bir şekilde ilişkili olması dikkat çekicidir. eIF4A genelliklemaya29,59, 60,61,62,63'tekiribozomal malzemenin herhangi bir kapsamlı saflaştırılması sırasında kaybolur. Bununla birlikte, in vivo -sabit maya malzemesinde,varlığının beklendiği çeviri komplekslerinin tüm fraksiyonlarında eIF4A'nın güvenilir zenginleştirilmesini sağlamak mümkündür. Daha önce yayınlanan Sel-TCP-seq verileri, ribozomlarla daha güçlü bir şekilde ilişkili olan eIF2 ve eIF3'ün zenginleştirilmesini göstermiştir (aynı zamanda geçici olarak meydana gelen ortak çevirisel protein kompleksi derlemesini de ortaya koymuştur)39. Bu nedenle, yöntem çeviri komplekslerinin hem daha güçlü hem de daha zayıf ekli bileşenlerinin tespiti için uygundur.
Özetlemek gerekirse, öncelikle çevirinin başlangıç aşamasında meydana gelen değişiklikler ve mRNA üzerinde minimal olarak pertüre ribozomal dağılım gerektiğinde içgörüler elde etmek için yararlı bir yaklaşım sunduk. Daha da önemlisi, yaklaşım eIF4A gibi çeviri komplekslerinin nispeten labile ve dinamik bileşenlerinin stabilizasyonu için uygundur ve gerekli optimizasyonlara tabi olarak yaygın olarak kullanılabilir. Ayrıca, çevirinin hızlı dinamik değişimi senaryolarında formaldehit fiksasyonunun yararlılığına dair kanıtlar sunduk, çevresel değişikliklere veya stres koşullarına hızlı hücresel tepkiler gibi araştırma alanlarını açtık.

Canlı organizmalar, yaşamları boyunca homeostazı korumak ve hayatta kalmayı sağlamak için hızlı yanıtlar gerektiren dinamik hücre içi ve hücre dışı değişikliklere maruz kalırlar. Çevresel adaptasyona izin vermek için ökaryotik hücreler gen ekspresyon kontrolü ile metabolizmalarını ayarlarlar. Gen ekspresyon kontrolü transkripsiyon ve/veya çeviri sırasında yapılabilir; çeviri yanıtları genellikle daha hızlımeydanagelen 1,2,3,4. Örneğin, çevirisel değişiklikler genellikle stres başlangıcından 1-30 dakika içinde ortaya çıkarken, transkripsiyon düzeyindeki değişiklikler strese maruz kalma3,4,5'den saatler sonra takip gelir. Çeviri çıktısındaki değişiklikler, haberci (m)RNA moleküllerinin sitoplazmadaki kalıcı kullanılabilirliği nedeniyle daha hızlı bir şekilde elde edilir. Tersine, transkripsiyon seviyesinde, yeni mRNA molekülleri sentezlenmeli ve ökaryotlarda, çekirdekten işlenmeli ve ihraç edilmeli ve yanıt süresi2, 4 ,6,7,8'debüyük gecikmeler üretilmelidir.
Strese akut çevirisel yanıt genellikle hücre sağkalımı için gerekli proteinlerin seçici olarak yukarı doğruülmesi ile çeviri çıktısında genel bir azalma ile karakterize edilir.1,3,4,9. Protein üretim üretiminin azaltılmasının, prosesin yüksek enerji gideri nedeniyle çok önemli olduğu düşünülmektedir.3,7. Seçici inhibisyon ve upregülasyonu kolaylaştırmak için, çevirisel yanıtlar bir dizi karmaşık düzenleyici mekanizma tarafından servis edilir. Düzenleme çevirinin tüm aşamalarında uygulanabilir: başlatma, uzama, polipeptid biyosentezinin sonlandırılması ve ribozomal geri dönüşüm10,11,12,13, ancak başlatma aşamasında en güçlü şekilde sergilendi5,7,9,10,13. Başlatma sırasında, ökaryotik başlatma faktörlerinin (eIF' ler) yardımıyla küçük ribozomal alt bira (SSU), bir başlangıç kodonu tanınana kadar mRNA'nın 5' çevrilmemiş bölgesine (UTR) bağlanır ve tarar2,5,6,8,11,12,13. Düzenleyici mekanizmalar genellikle bağlanmayı, taramayı ve kodon tanımayı başlatan eIF'leri hedefler. Örneğin, başlatıcı Met-tRNA'nın işe alınmasına yardımcı olan temel bir çeviri faktörü olan eIF2 başlatma faktörüiMet SSU'ya, stres koşulları altında ökaryotlarda sıklıkla hedef edilir4,6,11. Mayada, bu faktörün fosforilasyonu besin yoksunluğu ve ozmotik stres altında indüklenebilir.1,4,11,14,15ve memeli hücrelerinde amino asit açlığı, endoplazmik reticulum (ER) stresi, UV stresi, viral enfeksiyon ve değiştirilmiş oksijen seviyeleri bu yanıtı tetikleyebilir8,9,11. Spesifik mRNA çevirisinin hızlı bir şekilde yukarılanması, hipoksiye karşı memeli hücre yanıtında belirgindir, bu da hipoksi indüksiyonunun ve hipoksi-indükleyici faktörlerin (HIF' ler) biyosentezinin seçici olarak yukarılasyonunu gösterir. HIF'ler transkripsiyon faktörleridir, bu da DNA transkripsiyon düzeyinde daha uzun süreli hücresel yeniden programlamayı ortaya çıkarır8,9,16. Isı stresi altındaki mayada da benzer tepkiler gözlenmiştir, Isı Şok Proteinlerinin (HSP' ler) hızlı çevirisel ekspresyonu ve ardından gecikmiş transkripsiyon seviyesi yanıtları17,18. Besin yoksunluğu ve ısı şokuna ek olarak, mayadaki çevirisel yanıtlar değişen oksijen altında incelenmiştir.8,19tuzluluk5, fosfat, kükürt20,21 ve azot22,23 Düzey. Bu araştırmanın mayanın endüstriyel kullanımları üzerinde pişirme ve fermantasyon gibi yaygın etkileri vardır.24,25. Çevirisel yanıtlar, oksidatif stres gibi hücre içi streslerle karakterize olan nörodejeneratif bozukluklar ve kalp hastalıkları gibi hastalıkların anlaşılmasında da etkili olabilir. Genel olarak, çevirisel yanıtlar gen ekspresyon kontrolünün ayrılmaz bir parçası ve ökaryotik organizmalarda çok çeşitli stres koşullarına hızlı adaptasyonu kolaylaştırır.
Çeviri yanıtlarını incelemek için, çeviri ortamının en az bozuk anlık görüntülerini sağlayan yöntemler gereklidir. Polisome profilleme, mRNA genelinde çeviri çalışmasında kullanılan, mRNA'nın poli(ribo)somal fraksiyonlarının sakkaroz gradyanları26,27aracılığıyla ultrasantrifüjleme yoluyla ayrılmasını içeren klasik bir yaklaşımdır. Yaklaşım, bireysel mRNA'lar için çeviri düzeylerini (ters transkripsiyon ve polimeraz zincir reaksiyonu, RT-PCR26gibi algılama yöntemleriyle) veya küresel olarak yüksek verimli tekniklerle (microarray veya RNA-seq28,29)birlikte araştırmak için kullanılabilir. Daha gelişmiş bir yaklaşım ribozom profillemedir, bu da mRNA molekülü boyunca bir mRNA molekülü boyunca uzun ribozomların genom çapında pozisyonlarının incelenmesine ve ayrıca transkriptom genelinde çevirinin verimliliğinin çıkarımına ve ana ve alternatif başlangıç sitelerinin kullanımına izin verir30,31. Ribozom profilleme, üzerlerinde ribozomal varlıkla korunan mRNA parçalarının izolasyonu ve dizilimini içerir. Ribozom profilleme, hipoksik stres, ısı şoku ve oksidatif stres31,32dahil olmak üzere bir dizi koşulda çeviri dinamikleri hakkında önemli bir fikir sağlamıştır. Teknik, maya ve memeli hücreleri de dahil olmak üzere birden fazla kaynak malzeme türüne uyarlanmıştır.
Polisome ve ribozom profilleme, çevirideki araştırma yeteneklerini genişletmede temel olsa da, çeviri süreci bu yöntemlerle yakalanması zor çeşitli çeviri ara ve komplekslerini içerir11,13. Ek bir sınırlama, çeviri kompleksleri belirli çeviri inhibitörlerinin (antibiyotikler) eklenmesiyle in vivo olarak stabilize edildiğinden, belirli ribozom dağıtım eserlerine yol açtığından veya hücre lizisinde özellikle (antibiyotikler) veya spesifik olmayan (yüksek tuz veya magnezyum iyonları) eks vivo olduğundan, daha kısa ömürlü veya daha az kararlı ara33'ün yoksunluğuna yol açan hızlı yanıt türlerini inceleme yeteneğinin eksikliğindenkaynaklanmaktadır. 34,35.
Formaldehit, kromatin immünöteritasyon (ChIP) ve çapraz bağlantı immün önkupitasyon (CLIP) çalışmaları gibi nükleik asitleri ve proteinleri çapraz bağlamak için yaygın olarak kullanılır. Küçük boyutu ve mükemmel hücre geçirgenliği hızlı bir in vivo eylem sağlar36. Hızlı formaldehit çapraz bağlamaya dayanarak, ribozom profil oluşturma yaklaşımı Çeviri Kompleksi Profil Sıralaması (TCP-seq)10, 36,37 , 38,39,40ile genişletilmiştir. İlk olarak mayada geliştirilen TCP-seq, tarama veya sonlandırma sonrası SSU kompleksleri ve birden fazla ribozomal yapılandırma37 , 38,41,42dahil olmak üzere tüm çeviri aralarınınyakalanmasınısağlar. Yöntem çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır10,38,39,41,42, bazıları çevirinin tutuklanmasını kolaylaştırmak için hem çeviri inhibitörlerinin hem de formaldehit çapraz bağlantısının kombinatoryal yaklaşımını kullanır. Tekniğin başka bir değiştirilmiş sürümü olan seçici TCP-seq39,son zamanlarda TCP-seq uygulamalarının kapsamını genişleterek çapraz bağlantılı komplekslerin immünpurifikasyonunu dahil etmek için sunuldu. Formaldehit çapraz bağlantısının hızlı, verimli ve geri dönüşümlü doğası, bu yaklaşımları geçici mRNA:çeviri karmaşık etkileşimlerini, özellikle de son derece dinamik çeviri düzeyinde yanıt yolları bağlamında incelemek için uygun hale getirir.
Burada, kapsamlı çeviri karmaşık stabilizasyonu ve izolasyonu amacıyla in vivo formaldehit çapraz bağlama süreçlerini detaylandırıyoruz. Maya ve memeli hücreleri için nüanslı ayrı protokoller sağlıyoruz (Şekil 1). Ayrıca, çapraz bağlantı stabilize malzemenin(Şekil 1),immünblotting (batı blotting), immün destekli saflaştırma (veya 'immün önseçikleme' kullanılarak birlikte saflaştırılmış protein faktörü tespiti gibi) kullanımının örneklerini özetliyoruz; IP) ve belirli ilgi faktörleri, elektron mikroskopisi ve RNA dizilimi içeren çeviri komplekslerinin zenginleştirilmesi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> Şekil 1: Tipik deneysel kuruluma genel bir bakış gösteren şematik. Çeviri komplekslerinin in vivo formaldehit stabilizasyonunun ana adımları, gerekli temel araçlar hakkında bilgilerle desteklenmiş bir akış çizelgesi olarak tasvir edilir. Çapraz bağlantılı malzemenin potansiyel aşağı akış uygulamaları, RNA'nın SPRI boncuk saflaştırılması, RNA dizilimi ve kütle spektrometresi gibi bu protokolde başarıyla kullanılan ancak doğrudan kapsanmayan örnekler de dahil olmak üzere özetlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Merck, Sigma-Aldrich</td>
			<td>49139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0607-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>F11635-500ML</td>
			<td>ACS reagent, 37&#160;wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen&#8482; byThermo Fischer Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion&#8482; RNase I, cloned, 100 U/&#181;L</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#8226;In&#8482; RNase Inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1944-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>11033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Merck; Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham&#8482;&#160;Hybond&#174; P Western blotting membranes, PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE10600023</td>
			<td>PVDF membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt&#8482; 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>Protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt&#8482; LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td>&#160;LDS sample loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#8482; Kaleidoscope&#8482; Prestained Protein Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt&#8482; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td>PAGE runninjg buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept&#174; (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-70001</td>
			<td>Odyssey Blcoking buffer (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye&#174; 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>92632211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen&#8482; by ThermoFischer Sientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>84097</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>43816</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1CC/mL</td>
			<td>Terumo Syringe</td>
			<td>878499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding jar</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM400 mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BRN-BR-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices</td>
			<td>Eppendorf Safe-Lock</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>(Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>A25977</td>
			<td>PAGE running tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC5030</td>
			<td>Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td>
			<td>Cambridge Scientific</td>
			<td>15566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-90K</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 175cm2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA lobind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaking Incubator</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frezco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA lo-bind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#174; Protein LoBind tubes</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator, 150 L</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>328822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe with Luer Lok tip</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>302113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 16 mm Hypodermic Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TUAN2516R1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo fixation and isolation of translational complexes from eukaryotic cells

Messenger(m)RNA'nın hızlı bir şekilde yeniden dağıtılmasını ve mRNA çevirisinin değiştirilmesini içeren hızlı yanıtlar, hücrelerin devam eden homeostatik ayarlamalarıyla ilgilidir. Bu ayarlamalar, dalgalanan besin ve tuzluluk seviyeleri, sıcaklık ve çeşitli kimyasal ve radyasyon stresleri sırasında ökaryotik hücrenin hayatta kalabilmesi ve 'hasar kontrolü' için kritik öneme sahiptir. RNA düzeyindeki yanıtların son derece dinamik doğası ve RNA:RNA ve RNA:protein aralarının çoğunun kararsızlığı nedeniyle, sitoplazmik RNA durumunun anlamlı bir anlık görüntüsünü elde etmek ancak sınırlı sayıda yöntemle mümkündür. Transkriptome çapında, RNA-seq tabanlı ribozom profilleme tipi deneyler çevirinin kontrolü için en bilgilendirici veri kaynakları arasındadır. Bununla birlikte, tek tip bir RNA ve RNA:protein ara stabilizasyonunun olmaması, özellikle hızlı hücresel yanıt yollarında farklı önyargılara yol açabilir. Bu makalede, RNA ve RNA:protein ara stabilizasyonuna yardımcı olmak için farklı geçirgenliğe sahip ökaryotik hücreler için geçerli olan hızlı fiksasyonun ayrıntılı bir protokolünü sunuyoruz. Ayrıca stabilize RNA:protein komplekslerinin ribozomal ve poli(ribo)somal fraksiyonlarla birlikte çökeltilmesine dayalı izolasyon örnekleri sunuyoruz. Ayrılmış stabilize malzeme daha sonra Çeviri Karmaşık Profil dizilimi (TCP-seq) yaklaşımı ve türevleri gibi ribozom profil oluşturma türü deneylerin bir parçası olarak kullanılabilir. TCP-seq tarzı yöntemlerin çok yönlülüğü artık çeşitli organizmalarda ve hücre türlerinde uygulamalar tarafından gösterilmiştir. Stabilize kompleksler ayrıca benzeşim saflaştırılabilir ve elektron mikroskopisi kullanılarak görüntülenebilir, farklı poli (ribo)somal fraksiyonlara ayrılabilir ve çapraz bağlantının tersine çevrilmesinin kolaylığı nedeniyle RNA dizilimine tabi tutulabilir. Bu nedenle, sedimasyon bazlı veya diğer RNA:protein kompleksi zenginleştirme türüne dayanan snap-chilling ve formaldehit fiksasyonuna dayanan yöntemler, canlı hücrelerdeki hızlı RNA:protein kompleksi dinamiklerinin daha ince ayrıntılarını araştırmak için özellikle ilgi çekici olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Canlı maya ve memeli hücrelerinde formaldehit çapraz bağlama ile çevirisel (protein biyosentez) kompleksleri hızla stabilize etmek için bir teknik sunuyoruz. Yaklaşım, geçici ara maddelerin ve dinamik RNA:protein etkileşimlerinin parçalanarak parçalanmasını sağlar. Çapraz bağlantılı kompleksler, derin sıralama tabanlı profil oluşturma yöntemleri, mikroskopi ve kütle spektrometresi gibi birden fazla aşağı akış uygulamasında kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

İş akışı, kesinlikle kontrol edilen çevre koşullarında büyüyen hücrelerden oluşur, eriyen su / buz kullanarak hızla soğutur ve önceden optimize edilmiş formaldehit ve kuluçka süresi konsantrasyonu ile sabitler. Fiksasyon reaksiyonu daha sonra glisine veya tryps gibi birincil amino grup içeren bileşiklerin fazlalığı kullanılarak söndürülür. Hücreler toplanır, yıkanır ve dondurularak saklanabilir.Sabit hücreler mekanik veya kimyasal olarak lize edilebilir ve lizat, ribozomal fraksiyonların moleküler boyutlarına, tortulama özelliklerine veya benzeşim belirteçlerine göre ayrılması için kullanılır. Yaklaşım, elektron mikroskopisinde spesifik faktörler içeren komplekslerin zenginleştirilmesi ve immün destekli saflaştırma ve tespiti için kullanılabilir çok yönlü malzeme ile sonuçlanır. Çapraz bağlantılı derin blokaj, RNA amplifikasyonu veya hibridizasyon bazlı analizler üzerine RNA dizilimi ve kütle spektrometresi mümkün hale gelir.600 nanometrede 0,05 emici üniteden fazla olmayan başlangıç optik yoğunluğuna sahip bir yörüngesel çalkalayıcıda bir litrelik maya kültürü kurun ve 30 santigrat derecede pepton ve dekstroz ortamı kullanın. Dört santigrat derecede 5000 G'deki maya hücrelerinin sıvı süspansiyonunun peletlenerek uyumlu rotor ve santrifüj şişeleri ile bir hazırlık santrifüjü kurun. Büyüyen hücrelerin optik yoğunluğunun kaydını tutun.Üstel büyüme aşaması ilgi çekiciyse, toplama sırasında 0,6 ila 0,8 emici ünite ve 600 nanometre arasında olmalıdır. Hücreler hazır olduğunda, kimyasal duman kaputunun içine 250 gram temiz ezilmiş su buzu içeren bir fırıncı ile bir buz kutusu kurun ve ayrıca 25 mililitre tripsin ve yeni satın alınan metanol stabilize 37% formaldehit çözeltisini kaputun içinde gösterin. En son hücre kültürünü buzu içeren fırıncıya dökün.Daha sonra hacim üzerinde% 2.2 ağırlık üzerinde son konsantrasyona 75 mililitre% 37 formaldehit ekleyin, buz eriyene kadar karışımı yoğun bir şekilde karıştırın. Buz eridikten sonra, 10 dakika süreyle bir zamanlayıcı kurun 10 dakika kuluçkadan sonra, kültürü önceden soğutulmuş santrifüj şişelerine aktarın ve hücreleri dört santigrat derece, beş dakika boyunca 5000 G'de santrifüjleme ile peletleyin. Dönüş sırasında, 50 mililitrelik bir tüpü önceden soğutun ve buzda kalan formaldehitleri nötralize etmek için taze hazırlanmış glisin içeren A tamponunu saklayın.Santrifüjlemeden sonra, santrifüj tüplerini buzla temas eden pelet tarafı ile buza yerleştirin. Tüpleri duman kaputuna getirin ve süpernatantı formaldehit atık kabına atın. 25 mililitrelik bir şerit kullanarak ve 50 mililitrelik bir tüpe aktararak eski tüplerden gelen hücre peletini 20 mililitrelik A tamponunda yeniden askıya alın.A tamponu ile hacmi 40 mililitreye kadar yapın ve yıkama hücrelerini dört santigrat derece, beş dakika boyunca 5000 G santrifüjleme ile toplayın. Süpernatant atın ve hücre peletini 40 mililitre tampon A'da yeniden askıya alın, bu da glisin kontaminasyonunu gidermek için glisin içermeyen A tamponudur. Hücreleri tekrar 4 santigrat derecede santrifüjlemeyle peletleyin, 5000 G beş dakika.Yıkamaları A tamponu ile bir kez daha tekrarlayın. Süpernatant atın ve hücre peletini buza yerleştirin. Tüpü peletle tartın, ıslak hücre kütlesi hücre kültürünün bir litresi başına yaklaşık bir gram olmalıdır.Polistireni sıvı azotlu alüminyum folyo ile kaplı kutudan yaklaşık üç santimetre derinliğe kadar doldurun. Kutuya 50 mililitrelik tüpe dik olarak yerleştirin. Peletin 550 mikrolitre tampon A iki'de 10 saniye boyunca pipetleme ve girdaplama ile yeniden askıya alın.Mikrolitre RNaz inhibitörü başına 40 üniteden oluşan 10 mikrolitre ve 10 saniye boyunca tekrar girdap ekleyin. Bir mililitre pipet kullanarak, hücre süspansiyonu sıvı nitrojen içeren 50 mililitrelik ikiye damlatın. Bir sonraki adıma hazırlanmak için, kuru buz üzerinde 1,5 mililitre çekirdeksiz tüpleri ve 10 mililitre paslanmaz çelik taşlama kavanozlarını önceden soğutun.Donmuş hücre süspansiyon damlacığı temiz bir steril spatula kullanarak kavanozlara aktarın. Taşlama kavanozlarını bir dakika boyunca sıvı nitrojene batırın ve sıvı fazın bağlantının üzerinde kalmasını sağlayın. Bir dakikalığına ajitasyon için 27 Hertz'de bir Cryo karıştırma değirmeni kurun.27 Hertz'deki mühürlü taşlama kavanozlarını mikser fabrikasında bir dakika ajite edin. Kavanozları daha önce olduğu gibi sıvı nitrojende yeniden soğutun ve bir dakika daha çalkalayın. Kavanozları 1,5 mililitre çekirdeksiz tüplerle birlikte kuru buz içeren buz kutusuna aktarın.Küçük bir çelik spatula kullanarak, yastıklı öğütme tarihindeki sonuçları tüplere aktarın. Sonra tüpleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. İki T175 Şişesinde HEK 293 hücresi %60 ila %70 birışıklığa ve Dalbeko'nun modifiye Eagle orta ve %10 fetal sığır serumu 37 derece ve %5 karbondioksite kadar büyütür.İstenilen sabitleme süresinden en az üç saat önce, T175 şişesinin medyasını tam olarak 30 mililitre önceden ısıtılmış komple ortamla değiştirin. Ezilmiş su buzu ile ağzına kadar bir buz kutusu hazırlayın ve gerekli tamponlar ve aynı zamanda bir buz ile birlikte duman kaputunda tutun. Hücreleri soğutmak için, T175 şişesini inkübatörden çıkarın ve maksimum yüzey teması sağlamak için resmen buza bastırın.Kimyasal duman kaputunun içinde, matarayı yan tarafına yatırın, böylece ortam hücrelerin karşısındaki tarafta toplar. Pipet 168 mikrolitre 37% hacim formaldehit tarafından doğrudan havuzlanmış ortama tartılır. %0.2 formaldehit konsantrasyonu vermek.Hemen karıştırın. Şişeleri 10 dakika daha buzda kuluçkaya yatır. Ortamı, hücrelerin karşısındaki şişe tarafından uygun bir atık kabına dökün.Bir striptiz kullanarak, Dalbeko'nun fosfat tamponlu salinin 30 mililitresinde kalsiyum ve magnezyum iyonları olmadan pipet ve ayrıca hücrelerin karşısındaki tarafta hafifçe 50 milimoler glisin içerir. Şişeyi sallayarak karıştırın, flaşı yatay konuma getirin ve buzda 10 dakika daha kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi hücrenin karşısındaki şişe tarafından dökün ve hücreleri ayırmak ve yeniden askıya almak için yedi mililitre standart% 0.25 tripsin EDTA çözeltisi ekleyin.Şişeyi oda sıcaklığında beş, maksimum 10 dakika kuluçkaya bırakın. Şişeyi dikey olarak ve bir striptiz kullanarak bulun, şişe duvarlarından kalanları hafifçe yıkayarak müstakil hücreleri toplayın ve süspansiyonu buz üzerinde kurulu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Toplanan süspansiyon çözeltisini hemen 20 mililitre tam ortamla tamamlayın ve tüpü hafifçe çevirerek karıştırın.Tüpü 100 G'de beş dakika ve dört santigrat derece santrifüjleyarak hücreleri peletleyin. Hücre peleli açıkça görülebiliyor olmalıdır. Medyayı dökün ve peleti 10 mililitre Dalbeko'nun fosfat tamponlu salininde glisinsiz olarak hafifçe yeniden askıya alın.Tüpü beş dakika ve dört santigrat derecede tekrar 100 G'de santrifüjleyin Yıkama tamponunu dökün ve peletin 800 mikrolitre buz gibi Dalbeko'nun glisin içermeyen, ancak magnezyum ve kalsiyum iyonları içeren fosfat tamponlu salininde yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücreleri 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne yeni bir düşük protein bağlamaya aktarın. Tüpü 100 G'de 4 santigrat derecede üç dakika santrifüjleyin.Bir mililitre pipetter kullanarak süpernatantı dikkatlice atın. Bu aşamada, hücre pelezi eksi 80 santigrat derecede dondurulabilir veya hücre liziz adımına ilerleyebilir. Bir biyogüvenlik kabininde, iyonik olmayan, denatüre olmayan deterjana dayalı 300 mikrolitre lizis tamponu ve yedi mikrolitre arginaz inhibitörü ekleyin ve bir mililitre ucu kullanarak pipetleme yaparak iyice karıştırın.Bir ila üç mililitre şırıngaya 25 kalibrelik bir iğneyi dikkatlice takın ve en az yedi yavaş yukarı doğru alım ve hızlı aşağı egzoz darbeleri kullanarak karışımı kuvvetlice pipetleyin. Şırıngayı ve iğneyi keskinin kutusuna atın ve işlemi 31 kalibrelik bir iğne ve 0,3 mililitre şırınga ile tekrarlayın. Şırıngayı ve iğneyi kesicinin kutusuna atın.Hücre kalıntılarını gidermek için tüpü 12.000 G'de 4 derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatantı yeni bir düşük protein bağlayıcı 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarın. Hem hücre kalıntılarını hem de lisatları eksi 80 santigrat derecede saklayın.Çeviri kompleksleri tamponların iyonik bileşimine duyarlıdır. Magnezyum klorürün atlanması ve EDTA'nın eklenmesi yüksek sedimentasyon özelliklerini yok etti ve kalsiyum klorür daha iyi sonuç zirveleriyle sonuçlanırken, iyileşme marjinaldi. Böylece tampon 1'i seçtik.Hacim formaldehit tarafından% 2.2 ağırlık polizomları mükemmel bir şekilde korudu ve hacim formaldehit tarafından% 4 ağırlığa kıyasla genel verimi düşürmedi. Memeli hücrelerinde, hacim olarak% 0.2 ağırlıkta çok daha düşük bir formaldehit konsantrasyonu kullanılmıştır. Daha yüksek konsantrasyonlar önemli poliribozomal malzeme kaybına neden oldu.Lizate eklenen 15 milimoler EDTA ve sonraki tüm tamponlar, sabit hücrelerden elde edilen polizomal fraksiyonlar üzerinde belirgin şekilde daha az istikrarsızlaştırma etkisi gösterdi. Ve bu etki kısmen 50 milimolar EDTA ile% 4 sabit hücreden gelen malzeme ile çoğaltıldı, direndi, daha iyi açıldı. Glikoz tükenmesi maya üzerindeki en dramatik ve hızlı çevirisel inhibitör etkilerden birini ortaya çıkarır.Hem sinir eklendi hem de lokal olarak neden olduğu durumlar neden oldu polizom demontajı hafifçe, ancak açıkça daha fazla polisomes düşük ilave glikozda tutuldu. Daha da önemlisi, sabit hücrelerden elde edilen polizomal malzeme, aç ve aç olmayan hücreler arasında, formaldehit fiksasyonunun dinamik çeviri süreçlerindeki farklılıkları korumaya uygunluğunu gösteren yüksek bir ayrım göstermektedir. Tacy paysake gibi yaklaşımlarda, iki aşamalı bir ultrasantrifüjleme kullandığımız tam rizomlarla iyi yerleşmeyen küçük ribozomal alt ünlemlerin kaldırılması, SSU, LSU, RS, RNaz dirençli diazomlar, DS ve sabit fraksiyonların elektron mikroskopisi ile onaylanan yüksek sıralı polizomların izolasyonunu sağlamak da anlayışlı olabilir.Sabit olmayan hücrelerle karşılaştırıldığında, sabit hücrelerden elde edilen malzeme, en hızlı çökelten ribozomal fraksiyonlarda labile eIF4A'nın yüksek varlığını gösterdi. Manyetik IDG boncuklu kompleksler içeren eIF4A'yı yakalamak ve zenginleştirmek için eIF4A tapi suşundan sabit malzeme kullanarak, EIF4A'nın SSU ve RS'deki beta-aktinin ile karşılaştırıldığında seçici zenginleştirilmesini gözlemleyebildik, ancak RNase'nin bir sökülmesinde ikinci degradeden LSU fraksiyonlarını gözlemleyemedik. Diğer çevirisel dinlenme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, hücre zarları arasında formaldehit eyleminin hızlılığı ve çapraz bağlantıların ayrımsız doğası, çeviri karmaşık aralarının maksimum çeşitliliğinin korunmasını vaat eder.Bulgularımız, çevresel değişikliklere veya stres koşullarına hızlı hücresel yanıt senaryolarında son derece geçici kompleksleri ve kanıtların yararlılığını stabilize etmek için hızlı formaldehit fiksasyonunun kullanılabilirliğine uygundur.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Karbon Fiksasyon Potansiyel bir Kimyasal Tabakalı Antarktika Gölü ve Ölçme Mikrobiyal Ökaryotik Zenginleştirme Kültürlerinin Kurulması

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Bir In vivo</emŞu Protein Kompleksler yalıtmak için> Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Ökaryotik Hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel DNA genom Arıtma

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...