Name: 5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells
Uploaded: 2021-05-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل بتمويل من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (منحة المشروع 31003A_173188؛ www.snf.ch) وجامعة برن (www.unibe.ch) إلى بكالوريوس العلوم. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات، والتحليل، وقرار نشر المخطوطة، أو إعدادها.

1. إعداد الكواشف والمخزونات للنقرة عليه EdU المقايسة
ملاحظة: راجع جدول المواد والجدول 1 للحصول على تفاصيل حول المجموعة والكواشف المزودة مع المجموعة.
<ol><li>جلب قوارير إلى درجة حرارة الغرفة قبل إعداد الحلول.</li>
	<li>إعداد 10 MM EdU (المكون A) حل الأسهم بإضافة 2 مل من ثن...

<ol>
	<li>Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+across+the+eukaryotic+kingdom.">Cell cycle control across the eukaryotic kingdom.</a> Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).</li><li>Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle:+a+review+of+regulation,+deregulation+and+therapeutic+targets+in+cancer.">The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer.</a> Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).</li><li>Pardee, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restriction+point+for+control+of+normal+animal+cell+proliferation.">A restriction point for control of normal animal cell proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).</li><li>Gogendeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+causes+premature+differentiation+of+neural+and+intestinal+stem+cells.">Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells.</a> Nature Communications. 6, 8894 (2015).</li><li>Barnum, K. J., O'Connell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+regulation+by+checkpoints.">Cell cycle regulation by checkpoints.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).</li><li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine:+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication.">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218 (4571), 474-475 (1982).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+phosphohistone+H3+as+a+proliferation+marker+for+evaluating+invasive+breast+cancers:+A+comparative+study+with+Ki67.">The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67.</a> Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)+labeling+of+Drosophila+mitotic+neuroblasts.">EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).</li><li>Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms19+promotes+spindle+microtubule+assembly+in+Drosophila+neural+stem+cells.">Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells.</a> PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).</li><li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+Drosophila+larval+brain+tissue.">Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).</li><li>Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miranda,+a+protein+involved+in+neuroblast+asymmetric+division,+is+associated+with+embryonic+centrosomes+of+Drosophila+melanogaster.">Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster.</a> Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms19+is+a+mitotic+gene+that+permits+Cdk7+to+be+fully+active+as+a+Cdk-activating+kinase.">Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase.</a> Development. 145 (2), (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li><li>Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+Drosophila+larval+brain.">The development of the Drosophila larval brain.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).</li><li>Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NVX-412,+a+new+oncology+drug+candidate,+induces+S-phase+arrest+and+DNA+damage+in+cancer+cells+in+a+p53-independent+manner.">NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner.</a> PLoS One. 7, 45015 (2012).</li><li>Wyllie, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+phase+cell-cycle+arrest+following+DNA+damage+is+independent+of+the+p53/p21(WAF1)+signalling+pathway.">S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway.</a> Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DNA+replication+and+induction+of+S+phase+cell+cycle+arrest+by+G-rich+oligonucleotides.">Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).</li><li>Duronio, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+S-phase+control.">Developing S-phase control.</a> Genes &amp; Development. 26 (8), 746-750 (2012).</li><li>Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-phase+duration+is+the+main+target+of+cell+cycle+regulation+in+neural+progenitors+of+developing+ferret+neocortex.">S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).</li><li>Pereira, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cell+cycle+kinetics+by+EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity+analysis.">Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis.</a> Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li><li>Zielke, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly-FUCCI:+A+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues.">Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).</li><li>Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+profiling+cell+cycle+by+flow+cytometry+using+concurrent+staining+of+DNA+and+mitotic+markers.">Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers.</a> Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+and+transcriptome+analysis+of+drosophila+neural+stem+cells+reveals+a+role+for+Klumpfuss+in+self-renewal.">FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal.</a> Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).</li><li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing.">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li></ol>

إدراج EdU ورد الفعل اللاحق "انقر فوق" مع azide نفاذية الخلية يقدم مزايا عملية لهذه التقنية على طريقة BrdU المستخدمة في وقت سابق7. ومع ذلك ، يتم تحفيز رد الفعل هذا من قبل أيونات Cu(I) ، وقد تكون العديد من الأصباغ غير مستقرة في وجود هذا المحفز النحاسي ، كما ينصح بوضوح مصنع مجموعة Click-it EdU. عن?...

وتتألف دورة تقسيم الخلية من مرحلة G1 (مرحلة الفجوة الأولى)، ومرحلة متماثلة/S، ومرحلة G2 (مرحلة الفجوة الثانية)، ومرحلة M (ميتوتيك). يمر عبر هذه المراحل, الخلية يخضع لتغيرات جذرية في النسخ الخلوي, ترجمة, وإعادة تنظيم الآلات الهيكل الخلوي1,2. استجابة للإشارات التنموية والبيئية، قد تتوقف الخلايا مؤقتا عن الانقسام وتصبح هادئة (G0) أو تفرق وتتوقف نهائيا عن تقسيم3. سيناريوهات أخرى، مثل تلف الحمض النووي، قد يسبب التمايز المبكر أو موت الخلايا المبرمج3،4. تتم الاستجابة لمثل هذه الإشارات عن طريق نقاط التفتيش دورة الخلية، والتي تعمل كنظام مراقبة لضمان سلامة العمليات الخلوية الأساسية قبل أن تلتزم الخلية إلى المرحلة التالية من دورة التقسيم5. لذلك، تحتاج الدراسات على الجينات التي تنظم تكرار الحمض النووي ونقاط التفتيش والآلات الميتوتيكية إلى تحليل عيوب تطور دورة الخلية المحتملة التي قد تحدث في الخلايا المتحولة أو عند ضربة قاضية من هذه الجينات. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التحليلات لاختبار الصحة العامة للخلايا وكذلك الاستجابات الخلوية للعلاج من المخدرات.
5-برومو-2'-deoxyuridine (BrdU) هو التناظرية التي يتم دمجها في الحمض النووي أثناء النسخ المتماثل6. وقد استخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع لتحديد الخلايا في مرحلة S. ومع ذلك ، تخضع الخلايا بعد ذلك لإجراءات تشبع الحمض النووي القاسية للسماح بالكشف عن BrdU من خلال استخدام الأجسام المضادة المضادة ل BrdU6. قد يؤدي هذا العلاج القاسي إلى تلف الأسطح الخلوية ومنع المزيد من توصيف العينة من خلال التخبز المناعي. دمج EdU والكشف اللاحق من قبل النحاس الحفاز، 'انقر رد فعل' مع صغيرة، نفاذية الخلية، الأصباغ azide الموسومة فلوريا يلغي الحاجة إلى إجراءات التشبع قاسية7. ولذلك، برزت هذه الطريقة كبديل عملي أكثر لإدراج BrdU.
وعلاوة على ذلك، وقد وصفت pH3 كعلامة موثوق بها لخلايا المرحلة ميتوتيك / M8. الهستون H3 هو بروتين الهستون الأساسية المرتبطة بالحمض النووي الذي يصبح الفوسفوريلات في جميع أنحاء المرحلة المتأخرة G2 إلى مرحلة M في وقت مبكر ويتم إزالة الفوسفوريلات قرب نهاية anaphase8. يمكن استخدام العديد من الأجسام المضادة التجارية للكشف عن pH3 باستخدام بروتوكولات الاحتواء المناعي القياسية. ولذلك فإن التلطيخ المزدوج ل EdU وpH3 سيمكن من اكتشاف الخلايا في مرحلة S وكذلك في مرحلة M. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا في مرحلة G1 وG2 في وقت مبكر لا وصمة عار إيجابية لأي من علامات.
Drosophila الخلايا الجذعية العصبية أو الخلايا العصبية (NBs) تقدم نموذج الخلايا الجذعية تتميز جيدا حيث تنقسم الخلايا بشكل غير متماثل لإنتاج واحد متطابقة الذاتي تجديد NB وخلية الأم العقدة (GMC), الذي يقدر للتمايز9. بالإضافة إلى ذلك، العديد من الأدوات الوراثية والأجسام المضادة الخاصة NB جعل هذا النظام مناسبة للتلاعب الجيني والتصوير بالخلايا الحية. ونتيجة لذلك، استخدمت العديد من الدراسات NBs لدراسة الجينات التي تنظم الانقسامات غير المتماثلة وتحديد مصير الخلية9. توجد مجموعات متميزة من NBs في الدماغ المركزي (CB) والفص البصري (OL) في الدماغ اليرقات9؛ واستخدمت هيئة بناء الثقة في الدراسة الحالية. هذه اليرقات الإنستار الثالث CB NBs هي خلايا كبيرة مناسبة أيضا لدراسة العوامل التي تنظم تجميع المغزل الميتوتيكي. بروتوكول لتحليل عيوب تطور دورة الخلية سيكون أداة حيوية في مثل هذه الدراسات.
البروتوكولات التي نشرت في وقت سابق تستخدم مجموعات تجارية، مثل Click-iT EdU اليكسا فلور خلية انتشار كيت، والتي توفر العديد من مكونات التفاعل والأصباغ azide الموسومة مع مجموعة متنوعة من الأصباغ اليكسا فلور لدمج EdU والكشف10. ومع ذلك ، فإن الكواشف المزودة بهذه المجموعات غير متوافقة مع بعض العلامات الفلورية التي تستخدم في كثير من الأحيان مع الأجسام المضادة الثانوية. تم اختبار مجموعة الكشف عن EdU هذه (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit المزودة بصبغة أزيد فلور 647-المقترنة) في Drosophila الثالثة NBs اليرقات instar ، وجرت محاولة التلطيخ المشترك مع الأجسام المضادة ضد pH3 وميراندا ، وهي علامة ل NBs. وعلاوة على ذلك، استخدمت اليكسا فلور 568- أو Cy3 الموسومة الأجسام المضادة الثانوية للكشف عن وضع العلامات ميراندا على غشاء البلازما من NBs11. ومع ذلك، لم يلاحظ شدة الإشارة المتوقعة ونمط التلطيخ (النتائج غير المنشورة) مع هذه الأجسام المضادة الثانوية عندما تم إجراء التصبغ المناعي بعد الكشف عن EdU.
بالنسبة لدمج EdU ، يتطلب البروتوكول الذي وصفه Daul وزملاؤه تغذية اليرقات مع متوسط Kankel-White مختلط مع EdU وbroophenol blue (BPB)10. تتغذى اليرقات على EdU و BPB - ارتفعت المواد الغذائية ، والتي يمكن رؤيتها بلونها الأزرق عند الابتلاع في القناة الهضمية اليرقات. على الرغم من أن هذه الطريقة كانت تستخدم لدمج EdU في Mms19 فقدان الوظيفة(Mms19P) يرقات النجوم الثالثة ، إلا أن يرقات Mms19P لم تتغذى على ما يبدو حيث لم يتم اكتشاف أي لون أزرق في الأمعاء اليرقات (نتائج غير منشورة). تظهر يرقات Mms19P تشوهات تنموية شديدة وتعتقل في نهاية المطاف في المرحلة الثالثة من النجوم. قد يؤثر هذا بطريقة أو بأخرى على سلوك التغذية ليرقات النجوم الثالثة ويجعل بروتوكول تغذية EdU غير مناسب لمثل هذه الحالات.
بعد دراسة الأدبيات المتاحة والعمل على نطاق واسع على توحيد الخطوات الأساسية ، تم اقتراح نهج بديل لوضع العلامات المزدوجة EdU/pH3 في Drosophila NBs ، والتي لا تتطلب تغذية EdU إلى اليرقات. استخدمت دراسة سابقة تلطيخ ثنائي EdU/pH3 لتحليل دورة الخلية في NBs ، ولكنها لم تقدم بروتوكولا مفصلا4. وهذا يمثل عقبة لا داعي لها للمختبرات التي تحاول تنفيذ هذه الطريقة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون تقييم توافق الكواشف المختلفة مع مجموعة أدوات EdU وإجراء المزيد من التحسين عملية تستغرق وقتا طويلا. تقدم هذه الورقة بروتوكولا خطوة بخطوة يغطي دمج EdU في أدمغة اليرقات المتشرذم والتبويب المناعي بالأجسام المضادة لpH3 ، يليه المجهر الكونفوج وتحليل الصورة لتخصيص NBs لأربع فئات متميزة: مرحلة G0/G1 ، مرحلة S ، S>G2 / M (التقدم من S إلى G2 / M) ، ومرحلة M. يتم تحديد الخطوات التي تحتاج إلى التحسين والنصائح المقدمة لتحليل الصور لمجموعات البيانات الكبيرة. بالإضافة إلى ذلك، يتم تحليل قراءات EdU/pH3 في NBs البرية من النوع ومقارنة مع MMS19P NBs، والتي تم الإبلاغ عنها مؤخرا لإظهار تأخير دورة الخلية11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>fly stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>#15477</td>
			<td>P-element insertion in the third exon of Mms19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;+; Mms19::eGFP, Mms19p</td>
			<td>Generated in house</td>
			<td></td>
			<td>eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>#3605</td>
			<td>wild-type stock (w;+;+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Miranda</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab197788</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-pH3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9701</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>112-165-167</td>
			<td>1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27034</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount mounting medium</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) fraction V</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Imagej)</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite (LAS X)</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM</td>
			<td>Graph pad software</td>
			<td>Version 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft office</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>water-soluble, non-fluorescing mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells

في الجسم الحي تحليل تطور دورة الخلية يتم إجراؤها بشكل روتيني في الدراسات على الجينات التي تنظم الانقسام وتكرار الحمض النووي. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) وقد استخدمت للتحقيق في تطور النسخ المتماثلة / S-المرحلة, في حين استخدمت الأجسام المضادة ضد فوسفو-هيستون H3 للاحتفال نواة ميتوتيك والخلايا. ومن شأن الجمع بين كلا التسميتين أن يمكن من تصنيف مراحل G0/G1 (مرحلة الفجوة) و S (النسخ المتماثل) و M (mitotic) وأن يكون بمثابة أداة هامة لتقييم آثار الضربات المسقطة للجينات الميتوتيكية أو المسوخ الخالية على تطور دورة الخلية. ومع ذلك ، فإن الكواشف المستخدمة لوضع علامة على الخلايا الموسومة ب EdU لا تتوافق مع العديد من العلامات الثانوية الفلورية للأجسام المضادة. وهذا يعقد التثقين المناعي، حيث تستخدم الأجسام المضادة الثانوية الأولية والموسومة لوضع علامة على الخلايا الميتوتيكية الإيجابية لhH3. تصف هذه الورقة بروتوكولا تدريجيا لوضع العلامات المزدوجة ل EdU و pH3 في الخلايا الجذعية العصبية يرقات Drosophila ، وهو نظام يستخدم على نطاق واسع لدراسة العوامل الميتوتيكية. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير بروتوكول لتحليل الصورة وتحديد كميتها لتخصيص الخلايا المسماة في 3 فئات متميزة، G0/G1، S، S>G2/M (التقدم من S إلى G2/M)، ومراحل M.

وقد استخدمت ثنائي الفصوص Drosophila الدماغ اليرقات نجمة الثالثة كنظام نموذجيلدراسةالعمليات الخلوية والإنمائية الأساسية 9 . وكان محور الدراسة الحالية لتقديم بروتوكول لتحليل تطور دورة الخلية في EDU- وHH3 المسمى NBs من منطقة CB (الشكل 1). وينقسم البنك المركزي إلى نوعي?...

Watch this Scientific Journal Video about 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells at JoVE.com 

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells (Video) | JoVE 

تحليل دورة الخلية مع 5-إيثيل-2'-deoxyuridine (EdU) وفوسفو-هيستون H3 (pH3) وضع العلامات هو إجراء متعدد الخطوات التي قد تتطلب التحسين واسعة النطاق. هنا، نقدم بروتوكول مفصل يصف جميع الخطوات لهذا الإجراء بما في ذلك تحليل الصورة وتحديد كميتها لتمييز الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة.

5-إيثينيل-2'-Deoxyuridine/فوسفو-هيستون H3 بروتوكول وضع العلامات المزدوجة لتحليل تطور دورة الخلية في الخلايا الجذعية العصبية Drosophila

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ...

في هذا البروتوكول، نحن لا نقدم فقط شرحا مفصلا لكل خطوة من خطوات دمج وحدة EDU واحتواء المناعة، ولكن أيضا نشرح الحصول على الصور ومعالجة الصور وتقديم بعض النصائح لتحليل مجموعات البيانات الكبيرة. تسمح هذه التقنية لتخصيص الخلايا في G1 و S و M مراحل. وسيكون هذا مفيدا بشكل خاص لتحليل دورة الخلية على الدراسات المتعلقة بالطفرات غير التي تؤثر على الجينات الميتوتيكية.نتوقع من الناس أن يكافحوا لمدة شهرين إلى ثلاثة أشهر إذا لم يكن لديهم معرفة مسبقة أو خبرة في هذه التقنية. للبدء ، أضف وسيط تشريح شنايدر أو SM إلى منخفضين متتاليين من لوحة بقعة اللمعان وإضافة PBS إلى الاكتئاب اللاحق. باستخدام زوج من ملقط، واختيار تجول يرقات نجمة الثالثة ووضعها على نسيج ملطخة برنامج تلفزيوني لتنظيف بقايا الطعام يطير.ضع اليرقة في الاكتئاب مع PBS متبوعة بالاكتئاب المتتالي الذي يحتوي على SM. بعد ذلك تحت مجهر تشريح ، استخدم ملقط ناعم لإزالة ثلاثة أرباع الجزء السفلي من الجسم من اليرقة. ثم الاستيلاء بلطف على خطاطيف الفم اليرقات مع زوج واحد من ملقط وعقد لطيف من الطرف الآخر مع الزوج الآخر من ملقط. بدوره رأس اليرقات من الداخل الى الخارج عن طريق دفع خطاطيف الفم إلى الداخل وتقشير في وقت واحد قبالة الأنسجة في الطرف الآخر.مراقبة الدماغ اليرقات مع أقراص التصوير المرفقة. إزالة الأنسجة الأخرى المرتبطة الدماغ ونقل الدماغ إلى الاكتئاب المتتالية اللاحقة مع SM. إضافة 100 ميكرولتر من 100 ميكرومولار EDU SM حل للاكتئاب آخر على لوحة Pyrex واحتضان ما يقرب من 5 إلى 10 تشريح العقول في هذا الحل لمدة 2 ساعة في 25 درجة مئوية. بعد التثبيت والتضمين المناعي إزالة PBST وإضافة كوكتيل الكشف عن EDU إلى العقول تشريح.ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة في الظلام على خصية. بعد 30 دقيقة، اغسل العينات مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لكل غسل في الظلام. لتلطيخ الحمض النووي، وإعداد 5 ميكروغرام لكل محلول Hoechst 33342 ملليلتر.إزالة PBST بعد غسل الثاني وإضافة 500 ميكرولتر من الحل Hoechst إلى العقول تشريح، ثم احتضانها في الظلام. بعد 10 دقائق، قم بإزالة Hoechst وغسل العينات باستخدام PBST لمدة 10 دقائق. اضغط على الأنبوب على مقاعد البدلاء المختبر والسماح للأدمغة يستقر.إزالة برنامج تلفزيوني من الأنبوب، تاركا وراءه 50 إلى 100 ميكرولتر. قطع نهاية تلميح micropipet 200 ميكرولتر واستخدامه لنقل العقول على شريحة زجاجية نظيفة. قم بإزالة الوصول إلى PBST من الشريحة عن طريق نقعه بشرائط ورق التصفية.لا تدع ورقة التصفية تلمس الأدمغة. وضع قطرة من الماء للذوبان، غير مفلور تصاعد المتوسطة على العقول وتوجيه العقول بحيث يواجه الحبل العصبي البطني الشريحة والفص الوجه صعودا. ترتيب العقول في ملف واحد بحيث يكون من الأسهل لتصوير العقول بشكل متسلسل.ضع بلطف زلة غطاء على رأس الدماغ واحتضان الشريحة بين عشية وضحاها في 2-6 درجات مئوية. من برنامج الاستحواذ حدد الهدف 63 مرة. وضع قطرة من زيت الغمر على الغطاء زلة فقط فوق العقول التي شنت لجعله أسهل لتحديد موقع الأنسجة من خلال العدسة.باستخدام قناة dappy Hoechst 33342 ، ابحث عن الدماغ من خلال العدسة ثم انتقل إلى وضع الاستحواذ في البرنامج. إعداد 4 قنوات لتصوير Hoechst 33342، اليكسا الكلمة 4 8 8، اليكسا الكلمة 5 6، 8، واليكسا الكلمة 6 4 7. استخدام أداة مساعد صبغ لإعداد تلقائيا الليزر الإثارة الأصباغ المختارة والمرشحات الانبعاثات.تعيين مجال الرؤية، بحيث أنه يشمل فص الدماغ بأكمله. صورة الحجم الكامل للفص الدماغ عن طريق الحصول على هذه الضريبة متباعدة 0.8 ميكرون وبصرف النظر. تخزين كافة الصور من جلسة تصوير بتنسيق مكتبة L I F نقطة.لتحليل الصور، افتح فيجي، ثم اسحب ملفات LIF وأسقطها في فيجي. حدد مستعرض البيانات من علامة التبويب عرض المكدس واستخدم المكدس الظاهري من علامة التبويب إدارة الذاكرة في المكون الإضافي للتنسيقات الحيوية. مراقبة الصورة متعددة القنوات المعروضة في الصورة J.Change لون القنوات من شريط القائمة، وذلك باستخدام الصورة واللون، وأداة القنوات.ورصد ميراندا المسمى الخلايا العصبية، والتي تظهر كخلايا مستديرة كبيرة في منطقة الدماغ المركزية. رسم منطقة الاهتمام باستخدام أداة القطع الناقص على كل neuroblast لتجنب عد neuroblast مرتين. من شريط القائمة J للصورة، حدد التحليل والأدوات ومدير عائد الاستثمار.ضع علامة على جميع الخلايا العصبية في القسم Z الحالي واضغط على T بعد وضع علامة على كل خلية. بمجرد وضع علامة على جميع الخلايا العصبية في القسم Z الحالي ، قم بتغيير القنوات إلى pH3 و EDU واحص يدويا عدد الخلايا العصبية الإيجابية EDU ، والخلايا العصبية الإيجابية pH3 ، وEDU وpH3 الخلايا العصبية الإيجابية ، والخلايا العصبية التي لا تلطخ لأي علامة. البحث عن الخلايا العصبية وأقسام Z اللاحقة، وحذف ROIs القديمة وإضافة ROIs جديدة لحساب الخلايا العصبية في أكوام مختلفة.إعداد جدول وحساب النسب المئوية للخلايا العصبية الموجودة في جميع الفئات الأربع لكل فص. قم بإعداد رسم بياني شريطي باستخدام برنامج جداول البيانات، يعرض بيانات التجمعات بالنسبة المئوية للخلايا العصبية في كل فئة. تظهر هنا الخلايا العصبية المركزية للدماغ من أدمغة يرقات النجوم الثالثة المعلمة ميراندا وEDU وpH3.وخصصت الخلايا لمراحل G1/G0 وS وSG2/M و M. في تحليل EDU pH3 ، تم العثور على نسبة أعلى بكثير من MMS19 ، وفقدان الخلايا العصبية وظيفة في المرحلة M مقارنة مع الخلايا العصبية البرية نوع. MMS19: التعبير eGFP في فقدان MMS19 من خلفية وظيفة إنقاذ نسبة الخلايا في المرحلة M إلى مستويات نوع البرية.من المهم عدم استخدام الأدمغة التالفة للخطوات اللاحقة. وينبغي إعداد حل ED طازجا قبل البدء في التشريح. يمكن استخدام هذا الأصل كفحص أولي سريع لتحديد العيوب في مراحل دورة الخلية المحددة.ويمكن بعد ذلك متابعة ذلك بتحليل أكثر تفصيلا لمرحلة معينة.

Research

JoVE Journal

Biology

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Counting Human Neural Stem Cells

عد الخلايا الجذعية العصبية البشرية

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

كيمياء سيتولوجية مناعية : الخلايا الجذعية العصبية البشرية

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth (Video) | JoVE 

الفيديو المعلوماتية الحيوية تحليل النمو البشري الخلية الجذعية الجنينية كولوني

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells (Video) | JoVE 

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors (Video) | JoVE 

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) Using Retroviral Vector with GFP (Video) | JoVE 

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية المستحثة إلى الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) استخدام ناقلات فيروسات الرجعية مع GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry (Video) | JoVE 

قياس حركية تقدم دورة الخلية مع وصفها الأيض والتدفق الخلوي

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition (Video) | JoVE 

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus (Video) | JoVE 

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR (Video) | JoVE 

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...