Name: 5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells
Uploaded: 2021-05-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af midler fra Swiss National Science Foundation (projekttilskud 31003A_173188; www.snf.ch) og Universitetet i Bern (www.unibe.ch) til BS. Finansieringskilderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberede manuskriptet.

1. Fremstilling af reagenser og lagre til Click-it EdU assay
BEMÆRK: Se materialetabellen og tabel 1 for at få oplysninger om sættet og reagenser, der følger med sættet.
<ol><li>Bring hætteglassene til stuetemperatur, før du forbereder løsningerne.</li>
	<li>Klargør 10 mM EdU (komponent A) lageropløsning ved at tilsætte 2 mL dimethylsulfoxid (DMSO, komponent C). Bland godt og opbevares ved -20 °C.</li>
	<li>Forbered en arbejdsløsning af Alexa Fl...

<ol>
	<li>Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+across+the+eukaryotic+kingdom.">Cell cycle control across the eukaryotic kingdom.</a> Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).</li><li>Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle:+a+review+of+regulation,+deregulation+and+therapeutic+targets+in+cancer.">The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer.</a> Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).</li><li>Pardee, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restriction+point+for+control+of+normal+animal+cell+proliferation.">A restriction point for control of normal animal cell proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).</li><li>Gogendeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+causes+premature+differentiation+of+neural+and+intestinal+stem+cells.">Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells.</a> Nature Communications. 6, 8894 (2015).</li><li>Barnum, K. J., O'Connell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+regulation+by+checkpoints.">Cell cycle regulation by checkpoints.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).</li><li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine:+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication.">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218 (4571), 474-475 (1982).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+phosphohistone+H3+as+a+proliferation+marker+for+evaluating+invasive+breast+cancers:+A+comparative+study+with+Ki67.">The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67.</a> Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)+labeling+of+Drosophila+mitotic+neuroblasts.">EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).</li><li>Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms19+promotes+spindle+microtubule+assembly+in+Drosophila+neural+stem+cells.">Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells.</a> PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).</li><li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+Drosophila+larval+brain+tissue.">Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).</li><li>Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miranda,+a+protein+involved+in+neuroblast+asymmetric+division,+is+associated+with+embryonic+centrosomes+of+Drosophila+melanogaster.">Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster.</a> Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms19+is+a+mitotic+gene+that+permits+Cdk7+to+be+fully+active+as+a+Cdk-activating+kinase.">Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase.</a> Development. 145 (2), (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li><li>Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+Drosophila+larval+brain.">The development of the Drosophila larval brain.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).</li><li>Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NVX-412,+a+new+oncology+drug+candidate,+induces+S-phase+arrest+and+DNA+damage+in+cancer+cells+in+a+p53-independent+manner.">NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner.</a> PLoS One. 7, 45015 (2012).</li><li>Wyllie, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+phase+cell-cycle+arrest+following+DNA+damage+is+independent+of+the+p53/p21(WAF1)+signalling+pathway.">S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway.</a> Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DNA+replication+and+induction+of+S+phase+cell+cycle+arrest+by+G-rich+oligonucleotides.">Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).</li><li>Duronio, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+S-phase+control.">Developing S-phase control.</a> Genes &amp; Development. 26 (8), 746-750 (2012).</li><li>Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-phase+duration+is+the+main+target+of+cell+cycle+regulation+in+neural+progenitors+of+developing+ferret+neocortex.">S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).</li><li>Pereira, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cell+cycle+kinetics+by+EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity+analysis.">Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis.</a> Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li><li>Zielke, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly-FUCCI:+A+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues.">Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).</li><li>Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+profiling+cell+cycle+by+flow+cytometry+using+concurrent+staining+of+DNA+and+mitotic+markers.">Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers.</a> Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+and+transcriptome+analysis+of+drosophila+neural+stem+cells+reveals+a+role+for+Klumpfuss+in+self-renewal.">FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal.</a> Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).</li><li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing.">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li></ol>

EdU inkorporering og dens efterfølgende 'klik' reaktion med celle-permeable azide præsenterer praktiske fordele ved denne teknik i forhold til BrdU metode, der anvendes tidligere7. Denne reaktion er dog katalyseret af Cu (I) ioner, og flere farvestoffer kan være ustabile i nærværelse af denne kobberkatalysator, som det klart anbefales af Click-it EdU-kitproducenten. Når immunstaining eksperimenter var blevet udført efter udførelse af EdU detektion trin, den forventede signalintensitet blev...

Celledelingscyklussen omfatter en G1-fase (første hulfase), en replikativ/S-fase, en G2 (anden hulfase) og en M-fase (mitotisk) fase. Passerer gennem disse faser, cellen gennemgår dramatiske ændringer i cellulære transskription, oversættelse, og re-organisation af cytoskeletal maskiner1,2. Som reaktion på udviklings- og miljømæssige signaler kan cellerne midlertidigt ophøre med at opdele og blive hvilende (G0) eller differentiere og permanent ophøre med at opdele3. Andre scenarier, såsom DNA-skader, kan forårsage for tidlig differentiering eller apoptose3,4. Reaktion på sådanne signaler medieres af cellecykluskontrolpunkter, der fungerer som et overvågningssystem for at sikre integriteten af vigtige cellulære processer, før cellen forpligter sig til næste fase afdivisionscyklussen 5. Derfor, undersøgelser af gener, der regulerer DNA-replikation, checkpoints, og mitotiske maskiner nødt til at analysere mulige celle cyklus progression defekter, der kan forekomme i mutantceller eller på siRNA knockdown af disse gener. Derudover kan sådanne analyser anvendes til at teste den samlede celle sundhed samt cellulære reaktioner på narkotikabehandling.
5-bromo-2'-deoxyuridin (BrdU) er en thymidin analog, der er indarbejdet i DNA under replikation6. Denne metode blev brugt i vid udstrækning til at identificere celler i S-fase. Cellerne udsættes dog derefter for barske DNA-denatureringsprocedurer for at muliggøre påvisning af BrdU ved hjælp af anti-BrdU antistoffer6. Denne barske behandling kan beskadige cellulære epitoper og forhindre yderligere karakterisering af prøven gennem immunstaining. EdU inkorporering og efterfølgende påvisning af en kobber-katalyseret, 'klikreaktion' med små, celle-gennemtrængelige, fluorescerende mærkede azid farvestoffer eliminerer behovet for barske denaturering procedurer7. Denne metode viste sig derfor at være et mere praktisk alternativ til BrdU-inkorporering.
Endvidere er pH3 blevet beskrevet som en pålidelig markør for mitotiske/M faseceller8. Histone H3 er en DNA-associeret kerne histone protein, der bliver fosforyleret i omkring den sene G2 fase til begyndelsen af M fase og er af-fosforyleret mod slutningen af anaphase8. Flere kommercielle antistoffer kan bruges til at opdage pH3 ved hjælp af standard immunstaining protokoller. Dobbeltfarvning af EdU og pH3 vil derfor gøre det muligt at detektere celler i S-fase såvel som M-fase. Derudover ville celler i G1 og begyndelsen af G2 fase ikke plette positivt for nogen af markører.
Drosophila neurale stamceller eller neuroblaster (NBs) tilbyder en velkarakteriseret stamcellemodel, hvori celler deler asymmetrisk for at producere en identisk selvfornyende NB og en ganglion modercelle (GMC), som er skæbnebestemt til differentiering9. Derudover, flere genetiske værktøjer og NB-specifikke antistoffer gør dette system egnet til genetisk manipulation og levende celle billeddannelse. Derfor har flere undersøgelser brugt NBs til at studere gener, der regulerer asymmetriske divisioner og celle skæbne bestemmelse9. Der findes forskellige populationer af NBs i den centrale hjerne (CB) og den optiske lap (OL) i larvehjernen9; CB NBs blev anvendt til den aktuelle undersøgelse. Disse tredje instar larval CB NBs er store celler, der også er egnede til at studere faktorer, der regulerer mitotisk spindel samling. En protokol til at analysere cellecyklus progression defekter ville være et vigtigt redskab i sådanne undersøgelser.
Protokoller offentliggjort tidligere ansat kommercielle kits, såsom Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, som giver flere reaktion komponenter og jad farvestoffer mærket med en række Alexa Fluor farvestoffer til EDU inkorporering og detektion10. De reagenser, der leveres med sådanne kits, er dog ikke kompatible med nogle fluorescerende tags, der ofte bruges med sekundære antistoffer. Denne EdU detektion kit (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit leveres med Alexa Fluor 647-konjugeret azide farvestof) blev testet i Drosophila tredje instar larval NBs, og co-farvning blev forsøgt med antistoffer mod pH3 og Miranda, en markør for NBs. Yderligere, Alexa Fluor 568- eller Cy3-tagged sekundære antistoffer blev brugt til påvisning af Miranda mærkning på plasmamembranen af NBs11. Den forventede signalintensitet og farvningsmønster (ikke-offentliggjorte resultater) blev imidlertid ikke observeret med disse sekundære antistoffer, når immunstaining blev udført efter EdU-påvisning.
For EdU inkorporering krævede protokollen beskrevet af Daul og kolleger fodring af larverne med Kankel-White medium blandet med EdU og bromophenolblå (BPB)10. Larverne fodret på EdU og BPB-spiked mad, som kunne ses af sin blå farve ved indtagelse i larve tarm. Selv om denne metode blev brugt til EDU inkorporering i Mms19 tab af funktion (Mms19P) tredje instar larver, mms19P larver tilsyneladende ikke foder som næsten ingen blå farve blev opdaget i larve tarm (ikke-offentliggjorte resultater). Mms19P larverne viser drastiske udviklingsmæssige deformiteter og i sidste ende anholde i den tredje instar fase. Dette kan på en eller anden måde påvirke fodringsadfærden hos de tredje instar larver og gøre EdU-fodringsprotokollen uegnet til sådanne tilfælde.
Efter at have studeret den tilgængelige litteratur og arbejdet indgående med standardiseringen af væsentlige trin blev der foreslået en alternativ tilgang til EdU/pH3 dual-labeling i Drosophila NBs, som ikke kræver fodring af EdU til larver. En tidligere undersøgelse anvendte dobbelt EdU/pH3 farvning til at analysere cellecyklussen i NBs, men fremlagde ikke en detaljeret protokol4. Dette udgør en unødvendig forhindring for laboratorier forsøger at gennemføre denne metode. Desuden kan evaluering af kompatibiliteten af forskellige reagenser med EdU-sættet og udførelse af yderligere optimering være en tidskrævende proces. Dette papir præsenterer en trin-for-trin protokol, der dækker EDU inkorporering i dissekerede larvehjerner og immunstaining med anti-pH3 antistoffer, efterfulgt af konfokal mikroskopi og billedanalyse for at tildele NBs til fire forskellige kategorier: G0 / G1 fase, S fase, S>G2 / M (progression fra S til G2 / M), og M fase. De trin, der skal optimeres, er skitseret, og tip til billedanalyse af store datasæt. Derudover analyseres EdU/pH3-udlæsningen i wild-type NBs og sammenlignes med Mms19P NBs, som for nylig blev rapporteret til at vise en cellecyklusforsinkelse11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>fly stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>#15477</td>
			<td>P-element insertion in the third exon of Mms19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;+; Mms19::eGFP, Mms19p</td>
			<td>Generated in house</td>
			<td></td>
			<td>eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>#3605</td>
			<td>wild-type stock (w;+;+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Miranda</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab197788</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-pH3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9701</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>112-165-167</td>
			<td>1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27034</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount mounting medium</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) fraction V</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Imagej)</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite (LAS X)</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM</td>
			<td>Graph pad software</td>
			<td>Version 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft office</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>water-soluble, non-fluorescing mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells

In vivo cellecyklus progression analyse udføres rutinemæssigt i undersøgelser af gener, der regulerer mitose og DNA-replikation. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) er blevet brugt til at undersøge replikativ/S-fase progression, mens antistoffer mod fosfo-histone H3 er blevet brugt til at markere mitotiske kerner og celler. En kombination af begge etiketter vil gøre det muligt at klassificere G0/G1 (Gap fase), S (replikativ), og M (mitotisk) faser og tjene som et vigtigt redskab til at vurdere virkningerne af mitotiske gen knockdowns eller null mutanter på celle cyklus progression. De reagenser, der anvendes til at mærke EDU-mærkede celler, er imidlertid uforenelige med flere sekundære antistof-fluorescerende tags. Dette komplicerer immunstaining, hvor primære og mærkede sekundære antistoffer bruges til at markere pH3-positive mitotiske celler. Dette papir beskriver en trin-for-trin protokol for dual-mærkning af EdU og pH3 i Drosophila larval neurale stamceller, et system, der anvendes i vid udstrækning til at studere mitotiske faktorer. Derudover er der fastsat en protokol til billedanalyse og kvantificering for at allokere mærkede celler i 3 forskellige kategorier, G0/G1, S, S>G2/M (progression fra S til G2/M) og M-faser.

Den bi-fligede Drosophila tredje instar larval hjernen er blevet udnyttet som et modelsystem til at studere grundlæggende cellulære og udviklingsmæssige processer9. Fokus for den aktuelle undersøgelse var at fremlægge en protokol til analyse af cellecyklus progression i EdU- og pH3-mærket NBs af CB-regionen (figur 1). CB-NB'erne er opdelt i type I og type II, og de viser det karakteristiske asymmetriske opdelingsmønster9. Hver t...

Watch this Scientific Journal Video about 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells at JoVE.com 

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells (Video) | JoVE 

Cellecyklusanalyse med 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) og fosfo-histone H3 (pH3) mærkning er en flertrinsprocedure, der kan kræve omfattende optimering. Her præsenterer vi en detaljeret protokol, der beskriver alle trin for denne procedure, herunder billedanalyse og kvantificering for at skelne celler i forskellige cellecyklusfaser.

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin/Fosfo-Histone H3 Dobbeltmærkning protokol for Cell Cycle Progression Analyse i Drosophila neurale stamceller

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ...

I denne protokol giver vi ikke kun en detaljeret forklaring på hvert trin i EDU-inkorporering og immunstaining, men forklarer også billedopsamling, billedbehandling og giver nogle tips til analyse af store datasæt. Denne teknik giver mulighed for tildeling af celler i G1-, S- og M-faser. Dette vil især være nyttigt for cellecyklusanalyse af undersøgelser af ikke-mutationer, der påvirker mitotiske gener.Vi forventer, at folk kæmper i to til tre måneder, hvis de ikke har forudgående viden eller erfaring med denne teknik. Til at begynde med skal du tilføje Schneiders dissektionsmedium eller SM til to på hinanden følgende fordybninger af en glanspletplade og tilføje PBS til den efterfølgende depression. Ved hjælp af et par sammentak, pluk vandrende tredje instar larver og læg dem på et væv ratted med PBS for at rense flyve madrester.Placer larven i depressionen med PBS efterfulgt af den på hinanden følgende depression indeholdende SM. Næste under en dissektion mikroskop, bruge fine sammenkævninger til at fjerne tre fjerdedele af underkroppen af larven. Derefter forsigtigt gribe larve mund kroge med et par sammentrak og holde neglebånd i den anden ende med de andre par sammentakkerne. Drej larvehovedet vrangen ud ved at skubbe mundkrogene indad og samtidig skrælle vævet af i den anden ende.Overhold larvehjernen med vedhæftede imaginale diske. Fjern andre væv knyttet til hjernen og overføre hjernen til den efterfølgende på hinanden følgende depression med SM. Tilsæt 100 mikroliter af 100 mikromolar EDU SM opløsning til en anden depression på Pyrex plade og inkubere ca 5 til 10 dissekeret hjerner i denne løsning i 2 timer ved 25 grader Celsius. Efter fiksering og immunstainning fjerne PBST og tilføje EDU detektion cocktail til dissekeret hjerner.Inkuber dem derefter ved stuetemperatur i mørket på et kastrater. Efter 30 minutter vaskes prøverne to gange med PBST i 10 minutter pr. vask i mørke. Til DNA-farvning skal du forberede 5 mikrogram pr. milliliter Hoechst 33342-opløsning.Fjern PBST efter den anden vask og tilsæt 500 mikroliter af Hoechst-opløsningen til de dissekerede hjerner, og inkuber dem derefter i mørket. Efter 10 minutter skal du fjerne Hoechst og vaske prøverne med PBST i 10 minutter. Tryk røret på laboratoriebænken og lad hjernen slå sig ned.Fjern PBST fra røret og efterlad 50 til 100 mikroliter. Skær slutningen af en 200 mikroliter mikropipet spids og bruge den til at overføre hjerner på en ren glas slide. Fjern adgang PBST fra diaset ved blotting det med filter papirstrimler.Lad ikke filterpapiret røre hjernen. Sæt en dråbe af en vandopløselig, ikke fluorescerende montering medium på hjernen og orientere hjernen sådan, at ventral nerve ledningen vender dias og lapper ansigt opad. Arranger hjernen i en enkelt fil, så det er lettere at afbilde hjernerne serielt.Placer forsigtigt et dæksel slip oven på hjernen og inkubere dias natten over ved 2 til 6 grader Celsius. Vælg 63 gange målsætningen fra anskaffelsessoftwaren. Sæt en dråbe nedsænkning olie på dækslet slip lige over de monterede hjerner for at gøre det lettere at finde vævet gennem okularet.Ved hjælp af dappy Hoechst 33342 kanal, finde hjernen gennem okularet og derefter skifte til erhvervelse tilstand i softwaren. Konfigurer 4 kanaler til at afbilde Hoechst 33342, Alexa gulv 4 8 8, Alexa gulv 5 6, 8 og Alexa gulv 6 4 7. Brug farveassistentværktøjet til automatisk at konfigurere de valgte farve excitationslasere og emissionsfiltre.Sæt synsfeltet, sådan at det omfatter hele hjernelap. Billede hele mængden af hjernen lap ved at erhverve denne skat fordelt 0,8 mikron fra hinanden. Gem alle billeder fra en billedsession i et dot L I F-biblioteksformat.Hvis du vil have vist billedanalyse, skal du åbne Fiji og derefter trække og slippe LIF-filerne til Fiji. Vælg databrowser fra fanen visning af stakken, og brug virtuel stak under fanen hukommelsesstyring i plugin'et til bioformater. Overhold det multikanalbillede, der vises i billedet J.Ændre farven på kanalerne fra menulinjen ved hjælp af billed-, farve- og kanalværktøjet.Og overvåge Miranda mærket neuroblaster, der vises som store runde celler i den centrale hjerne region. Tegn et område af interesse ved hjælp af ellipseværktøjet over hver neuroblast for at undgå at tælle neuroblast to gange. Vælg analyser, værktøjer og ROI Manager på menulinjen Billede J.Marker alle neuroblaster i den aktuelle Z-sektion, og tryk på T efter markering af hver celle. Når alle neuroblaster i den nuværende Z-sektion er markeret, ændre kanalerne til pH3 og EDU og manuelt tælle antallet af EDU positive neuroblaster, pH3 positive neuroblaster, EDU og pH3 positive neuroblaster, og neuroblaster ikke farvning for enten markør. Søg efter neuroblaster og efterfølgende Z-sektioner, slet gamle INVESTERINGSAFKAST, og tilføj nye INVESTERINGSAFKAST for at tælle neuroblaster i forskellige stakke.Forbered et regneark og beregne procentdele af neuroblaster til stede i alle fire kategorier for hver lap. Forbered en søjlegraf ved hjælp af regnearkssoftwaren, der viser puljedataene for procentdele af neuroblaster i hver kategori. Centrale hjerne neuroblaster fra tredje instar larval hjerner markeret med Miranda, EDU, og pH3 er vist her.Cellerne blev allokeret til G1/G0-, S-, SG2/M- og M-faser. I EDU pH3 analyse, en betydeligt højere andel af MMS19, tab af funktion neuroblaster blev fundet i M fase i forhold til vilde type neuroblaster. MMS19:eGFP-udtrykket i MMS19-tab af funktionsbaggrund reddede andelen af celler i M-fase til vilde typeniveauer.Det er vigtigt ikke at bruge beskadigede hjerner til efterfølgende trin. Og ED-opløsning skal tilberedes frisk, før dissektionerne påbegyndes. Dette aktiv kan bruges som en hurtig indledende screening til at identificere fejl i specifikke cellecyklusfaser.Dette kunne så følges op af en mere detaljeret analyse af en bestemt fase.

Research

JoVE Journal

Biology

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth (Video) | JoVE 

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells (Video) | JoVE 

Analyse af Cell Cycle Position i pattedyrceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors (Video) | JoVE 

Fænotypisk analyse og isolering af murine hæmatopoietiske stamceller og Lineage-progenitorer

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) Using Retroviral Vector with GFP (Video) | JoVE 

Omprogrammering humane somatiske celler i induceret pluripotente stamceller (IPSC&#39;er) under anvendelse af retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Måling cellecyklusprogression Kinetics med metabolisk mærkning og Flowcytometri

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition (Video) | JoVE 

Induktion og analyse af Epithelial til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus (Video) | JoVE 

Effektiv Generation Menneskelige induceret pluripotente stamceller fra humane somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR (Video) | JoVE 

Profilering Individuelle humane embryonale stamceller ved kvantitativ RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...