Name: 5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells
Uploaded: 2021-05-04T15:00:00
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この研究は、スイス国立科学財団(プロジェクト補助金31003A_173188;www.snf.ch)とベルン大学(www.unibe.ch)からBSへの資金提供によって支えられました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集、分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。

1. クリックイットEdUアッセイ用試薬とストックの調製
注:キットに付属のキットと試薬の詳細については、 材料表 と 表1 を参照してください。
<ol><li>溶液を準備する前に、バイアルを室温にしてください。</li>
	<li>2 mLのジメチルスルホキシド(DMSO、C成分)を加えて10mM EdU(成分A)ストック液を調製します。よく混ぜて-20°Cで保存してください。</li>...

<ol>
	<li>Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+across+the+eukaryotic+kingdom.">Cell cycle control across the eukaryotic kingdom.</a> Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).</li><li>Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle:+a+review+of+regulation,+deregulation+and+therapeutic+targets+in+cancer.">The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer.</a> Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).</li><li>Pardee, A. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)+labeling+of+Drosophila+mitotic+neuroblasts.">EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).</li><li>Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms19+promotes+spindle+microtubule+assembly+in+Drosophila+neural+stem+cells.">Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells.</a> PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).</li><li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+Drosophila+larval+brain+tissue.">Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 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N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms19+is+a+mitotic+gene+that+permits+Cdk7+to+be+fully+active+as+a+Cdk-activating+kinase.">Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase.</a> Development. 145 (2), (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+phase+cell-cycle+arrest+following+DNA+damage+is+independent+of+the+p53/p21(WAF1)+signalling+pathway.">S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway.</a> Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DNA+replication+and+induction+of+S+phase+cell+cycle+arrest+by+G-rich+oligonucleotides.">Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).</li><li>Duronio, R. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cell+cycle+kinetics+by+EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity+analysis.">Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis.</a> Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li><li>Zielke, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly-FUCCI:+A+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues.">Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).</li><li>Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+profiling+cell+cycle+by+flow+cytometry+using+concurrent+staining+of+DNA+and+mitotic+markers.">Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers.</a> Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+and+transcriptome+analysis+of+drosophila+neural+stem+cells+reveals+a+role+for+Klumpfuss+in+self-renewal.">FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal.</a> Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).</li><li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing.">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li></ol>

EdU の組み込みとその続く細胞透過性アジドとの "クリック" 反応は、前の7で使用した BrdU メソッドよりもこの手法の実用的な利点を提示します。しかし、この反応はCu(I)イオンによって触媒され、いくつかの色素は、この銅触媒の存在下で不安定である可能性があり、Click-it EdUキットメーカーによって明確に助言される。EdU検出ステップを実行した後に免疫染色実験を行っ?...

細胞分割サイクルは、G1相(第1ギャップ相)、複製/S相、G2(第2ギャップ相)、M(ミトティック)相で構成されています。これらの段階を経て、細胞は細胞転写、翻訳、および細胞骨格機構1,2の再構成において劇的な変化を起こします。発達的および環境的な手掛かりに応じて、細胞は一時的に分裂を停止し、静止(G0)になるか、分化し、永久に3を分割しなくなる。DNA損傷などの他のシナリオでは、早期分化またはアポトーシス3,4を引き起こす可能性があります。このようなキューへの応答は、細胞周期チェックポイントによって仲介され、細胞が分割サイクル5の次の段階にコミットする前に、本質的な細胞プロセスの完全性を確保するための監視システムとして機能する。したがって、DNA複製、チェックポイント、および有糸分裂性機械を調節する遺伝子に関する研究では、変異細胞またはこれらの遺伝子のsiRNAノックダウン時に起こり得る細胞周期進行欠陥を分析する必要があります。さらに、このような分析は、全体的な細胞の健康だけでなく、薬物治療に対する細胞応答をテストするために使用することができます。
5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)は、複製中にDNAに組み込まれるチミジンアナログ6.この方法は、S相の細胞を同定するために広く使用された。しかし、細胞は、抗BrdU抗体6を用いてBrdUを検出できるように、過酷なDNA変性手順を行う。この過酷な治療は、細胞エピトープを損傷し、免疫染色を介してサンプルのさらなる特性を防ぐことができます。銅触媒によるEdUの組み込みおよびその後の検出は、小さく、細胞透過性、蛍光タグ付きアジド染料による「クリック反応」は、過酷な変性手順7の必要性を排除する。したがって、この方法は、BrdUの組み込みに代わるより実用的な代替手段として浮上した。
また、pH3は、有糸分裂/M相細胞8に対する信頼できるマーカーとして説明されている。ヒストンH3は、G2後期から初期のM相の周囲でリン酸化されて、アナフェーズ8の終わりに向かって脱リン酸化されるDNA関連コアヒストンタンパク質である。いくつかの市販の抗体を使用して、標準的な免疫染色プロトコルを使用してpH3を検出することができます。したがって、EdUとpH3の二重染色は、M相と同様にS相の細胞の検出を可能にするであろう。さらに、G1およびG2初期期の細胞は、いずれのマーカーにも積極的に染色されないであろう。
ショウジョウバエ 神経幹細胞または神経芽細胞(NBs)は、細胞が非対称的に分裂して1つの同一の自己更新NBおよび神経節母細胞(GMC)を産生する、分化9のために運命づけられた十分に特徴付けられる幹細胞モデルを提供する。さらに、いくつかの遺伝子ツールとNB特異的抗体は、このシステムを遺伝子操作および生細胞イメージングに適しています。その結果、いくつかの研究は、非対称分裂および細胞運命決定9を調節する遺伝子を研究するためにNBを利用した。脳の中枢(CB)と幼虫脳の視頭葉(OL)に、異なる集団が存在する。CB NBは、現在の研究のために使用されました.これら第3のインスター幼虫CB NBは、有糸分裂性紡錘の組立を調節する因子を研究するのにも適している大細胞である。細胞周期の進行欠陥を分析するプロトコルは、このような研究において重要なツールとなるだろう。
先に公開されたプロトコルは、Click-iT EdU Alexa Fluor細胞増殖キットのような商用キットを採用しており、EdUの組み込みおよび検出用の様々なアレクサフルオール染料でタグ付けされたいくつかの反応成分とアジド染料を提供する。しかし、このようなキットに付属の試薬は、二次抗体とよく使用される蛍光タグと互換性がありません。このEdU検出キット(アレクサフルオール647-共役アジジド色素を供給するClick-iT EdU Alexa Fluor細胞増殖キット)をショ ウジョウバエ 第3のインスター幼虫NBで試験し、NBのマーカーであるpH3およびミランダに対する抗体を共染色実験した。また、Alexa Fluor 568-またはCy3タグ付き二次抗体をNBs11の血漿膜上でのミランダ標識の検出に用いた。しかし、期待されるシグナル強度および染色パターン(未発表の結果)は、EdU検出後に免疫染色を行った場合、これらの二次抗体では観察されなかった。
EdUの組み込みについては、DaulとDaulと同僚が説明したプロトコルは、EdUとブロモフェノールブルー(BPB)10と混合されたカンケル白培地で幼虫の供給を必要とした。幼虫は、幼虫の腸内で摂取すると青い色で見ることができるEdUとBPBスパイク食品に餌を与えました。この方法は、第3のインスター幼虫であるMms19機能喪失(Mms19P)のEdU組み込みには用いられたが、幼虫の腸内で青色の色がほとんど検出されなかったため、Mms19P幼虫は明らかにほとんど供給されなかった(未発表の結果)。Mms19P幼虫は劇的な発達の変形を示し、最終的に第3のインスター段階で逮捕する。これは、第3のインスター幼虫の摂食行動に何らかの影響を及ぼし、そのような場合にはEdU-給餌プロトコルを不適当にする可能性がある。
利用可能な文献を研究し、本質的なステップの標準化に広く取り組んだ後、幼虫にEdUを供給する必要のないショウジョウバエNBsのEdU / pH3デュアルラベリングのための代替アプローチが提案されました。以前の研究では、NBsの細胞周期を分析するために二重EdU / pH3染色を採用したが、詳細なプロトコル4は示さなかった。これは、このメソッドを実装しようとするラボにとって、不要なハードルを示します。さらに、各種試薬とEdUキットとの相溶性を評価し、さらなる最適化を行う場合には、時間のかかる処理が可能です。この論文では、解剖された幼虫脳におけるEdUの組み込みと抗pH3抗体による免疫染色をカバーするステップバイステップのプロトコルを提示し、続いて共焦点顕微鏡と画像分析を行い、G0/G1相、S相、S>G2/M(SからG2/Mへの進行)、およびM相の4つのカテゴリーにNBを割り当てる。最適化が必要な手順の概要と、大規模データセットの画像分析に関するヒントが示されています。さらに、野生型のNBsにおけるEdU/pH3読み出しは、分析され、最近報告されたMms19P NBsと比較され、細胞周期遅延11を示す。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>fly stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>#15477</td>
			<td>P-element insertion in the third exon of Mms19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;+; Mms19::eGFP, Mms19p</td>
			<td>Generated in house</td>
			<td></td>
			<td>eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>#3605</td>
			<td>wild-type stock (w;+;+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Miranda</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab197788</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-pH3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9701</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>112-165-167</td>
			<td>1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27034</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount mounting medium</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) fraction V</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Imagej)</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite (LAS X)</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM</td>
			<td>Graph pad software</td>
			<td>Version 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft office</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>water-soluble, non-fluorescing mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells

生体細胞 周期進行解析は、有糸分裂およびDNA複製を調節する遺伝子に関する研究において日常的に行われている。5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)は、複製/S相進行を調査するために利用されているのに対し、ホスホヒストンH3に対する抗体は、有核および細胞をマークするために利用されてきた。両方のラベルの組み合わせは、G0/G1(ギャップフェーズ)、S(複製)、およびM(有糸分裂)相の分類を可能にし、有糸分裂遺伝子のノックダウンまたはヌル突然変異体が細胞周期進行に及ぼす影響を評価する重要なツールとして機能する。しかし、EdU標識細胞をマークするために使用される試薬は、いくつかの二次抗体蛍光タグと互換性がありません。これは、一次およびタグ付き二次抗体がpH3陽性有糸分裂細胞をマークするために使用される免疫染色を複雑にします。本論文では、染色体 の幼虫 神経幹細胞におけるEdUとpH3の二重標識のステップバイステッププロトコルについて説明する。さらに、画像分析と定量化のために、G0/G1、S、S、S>G2/M(SからG2/Mへの進行)、およびM相の3つの異なるカテゴリーにラベル付けされたセルを割り当てるためのプロトコルが用意されています。

二葉性 ショウジョウバエ 第3次インスター幼虫脳は、基本的な細胞および発達過程9を研究するためのモデルシステムとして利用されてきた。現在の研究の焦点は、CB領域のEdU-およびpH3標識されたNBsにおける細胞周期進行の分析のためのプロトコルを提示することであった(図1)。CB NB はタイプ I とタイプ II にサブタイプ化され、特性非対称分割?...

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5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells (Video) | JoVE 

5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびホスホヒストンH3(pH3)標識による細胞周期解析は、広範な最適化を必要とし得る多段階の手順である。ここでは、異なる細胞周期段階で細胞を区別するための画像解析および定量化を含む、この手順のすべてのステップを説明する詳細なプロトコルを提示する。

5-エチニル-2'-デオキシウリジン/ホスホヒストンH3細胞周期進行解析用二重標識プロトコル

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ...

本プロトコルでは、EDUの組み込みと免疫染色の各ステップの詳細な説明を提供するだけでなく、画像取得、画像処理、および大規模データセットを分析するためのヒントを提供します。この手法により、G1、S、M の各相でセルを割り当てることができます。これは、有糸分裂遺伝子に影響を及ぼす非突然変異に関する研究における細胞周期解析に特に有用である。私たちは、人々がこの技術の事前の知識や経験を持っていない場合、2〜3ヶ月間苦労することを期待します。まず、シュナイダーの解剖培地またはSMを光沢スポットプレートの2つの連続したくぼみに加え、その後のうつ病にPBSを加えます。鉗子のペアを使用して、3番目のインスター幼虫をさまようを選び、フライ食品残渣をきれいにするためにPBSでラットされた組織の上に置きます。PBSでうつ病に幼虫を入れ、続いてSMを含む連続したうつ病を行う。次に解剖顕微鏡の下で、幼虫の下半身の4分の3を取り除くために細かい鉗子を使用する。その後、そっと鉗子のペアで幼虫の口のフックをつかみ、他の端のキューティクルをもう一方の鉗子で保持します。口のフックを内側に押し込み、同時にもう一方の端の組織を剥がすことによって、幼虫の頭を裏返しにします。取り付けられた想像力ディスクを持つ幼虫の脳を観察します。脳に取り付けられた他の組織を削除し、SMで後続のうつ病に脳を転送します。.100マイクロモルEDU SM溶液の100マイクロモルEDU SM溶液の100マイクロリットルをパイレックスプレートの別のうつ病に加え、この溶液中の約5〜10の解剖された脳を摂氏25度で2時間インキュベートします。固定および免疫染色後、PBSTを除去し、EDU検出カクテルを解剖した脳に加える。その後、ニューアテーターの暗闇の中で室温でそれらをインキュベートします。30分後、PBSTで2回、暗い所で10分間洗浄します。DNA染色の場合は、1ミリリットルのHoechst 33342溶液あたり5マイクログラムを調製します。2回目の洗浄後にPBSTを取り除き、解剖された脳にHoechst溶液の500マイクロリットルを加え、暗闇の中でインキュベートします。10分後、Hoechstを取り出し、PBSTで10分間洗浄します。ラボベンチにチューブをタップし、脳が落ち着くようにします。チューブからPBSTを取り出し、50~100マイクロリットルを残します。200マイクロピペットチップの端をカットし、きれいなガラススライドに脳を転送するためにそれを使用しています。フィルターペーパーストリップでブロッティングしてスライドからアクセスPBSTを取り除きます。フィルター用紙が脳に触れないようにしてください。水溶性の非蛍光実装媒体を脳に一滴入れ、腹側神経コードがスライドに面し、ローブが上向きになるように脳を向けます。脳を連続的に画像化しやすいように、脳を単一のファイルに配置します。脳の上にカバースリップをそっと置き、一晩2〜6度でインキュベートします。取得ソフトウェアから63倍の目標を選択します。取り付けられた脳のすぐ上のカバースリップに浸漬油を一滴入れ、接眼を通して組織を見つけやすくします。ダッピーHoechst 33342チャンネルを使用して、接眼眼を通して脳を見つけ、ソフトウェアの取得モードに切り替えます。画像Hoechst 33342、アレクサフロア4 8 8、アレクサフロア5 6、8、およびAlexaフロア6 4 7に4チャンネルを設定します。選択した染料励起レーザーとエミッション フィルタを自動的に設定するには、染料アシスタント ツールを使用します。脳葉全体を包含するような視野を設定する。この税金を0.8ミクロン離して取得することによって、脳ローブの全容を画像化します。イメージ セッションのすべてのイメージを、ドット L I F ライブラリ形式で保存します。画像解析の場合は、フィジーを開いてドラッグし、LIF ファイルをフィジーにドロップします。スタック表示タブからデータブラウザを選択し、バイオフォーマットプラグインのメモリ管理タブから仮想スタックを使用します。イメージ J.のマルチチャンネル画像を観察します。画像、色、チャンネルツールを使用して、メニューバーからチャンネルの色を変更します。そして、ミランダ標識神経芽細胞を監視します, 中央脳領域に大きな丸い細胞として表示されます.神経芽細胞を2回数えないように、各神経芽細胞の上に楕円ツールを使用して関心のある領域を描画します。イメージ J メニュー バーから、分析、ツール、および ROI マネージャを選択します。現在のZセクション内のすべての神経芽細胞をマークし、各セルをマーキングした後にTを押します。現在のZセクションのすべての神経芽細胞がマークされたら、チャネルをpH3およびEDUに変更し、EDU陽性神経芽細胞、pH3陽性神経芽細胞、EDUおよびpH3陽性神経芽細胞、および神経芽細胞の数を手動でカウントします。神経芽細胞とその後のZセクションを検索し、古いROIを削除し、新しいROIを追加して、異なるスタック内の神経芽細胞を数えます。スプレッドシートを作成し、各ローブの4つのカテゴリすべてに存在する神経芽細胞の割合を計算します。スプレッドシート ソフトウェアを使用して棒グラフを作成し、各カテゴリの神経芽細胞のパーセンテージのプール データを表示します。ミランダ、EDU、およびpH3でマークされた第3のインスター幼虫脳からの中枢脳神経芽細胞がここに示されている。G1/G0、S、SG2/M、Mの各相にセルを割り当てた。EDU pH3分析では、MMS19の有意に高い割合で、野生型神経芽細胞と比較して、機能神経芽細胞の消失がM相で見られた。MMS19:関数バックグラウンドのMMS19消失におけるeGFP発現は、野生型レベルにM相の細胞の割合を救った。その後のステップのために損傷した脳を使用しないことが重要です。そして、EDソリューションは、解剖を開始する前に新たに準備する必要があります。この資産は、特定の細胞周期段階の欠陥を識別するための迅速な初期スクリーニングとして使用できます。その後、特定のフェーズのより詳細な分析を行うことができます。

Research

JoVE Journal

Biology

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Counting Human Neural Stem Cells

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Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

免疫細胞：ヒト神経幹細胞

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Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth (Video) | JoVE 

ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長のビデオバイオインフォマティクス解析

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

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哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors (Video) | JoVE 

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) Using Retroviral Vector with GFP (Video) | JoVE 

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry (Video) | JoVE 

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

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Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition (Video) | JoVE 

間葉転換を誘導し、上皮の分析

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Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus (Video) | JoVE 

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR (Video) | JoVE 

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...