Name: 5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells
Uploaded: 2021-05-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Swiss National Science Foundation (prosjektstipend 31003A_173188; www.snf.ch) og Universitetet i Bern (www.unibe.ch) til BS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.

1. Utarbeidelse av reagenser og aksjer for Click-it EdU-analyse
MERK: Se materialtabellen og tabell 1 hvis du vil ha mer informasjon om settet og reagensene som følger med settet.
<ol><li>Sørg for at hetteglassene har romtemperatur før du klargjør løsningene.</li>
	<li>Forbered 10 mM EdU (komponent A) lagerløsning ved å tilsette 2 ml dimetylsulfoksid (DMSO, komponent C). Bland godt og oppbevar ved -20 °C.</li>
	<li>Forbered en arbeidsløsning av Alex...

<ol>
	<li>Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+across+the+eukaryotic+kingdom.">Cell cycle control across the eukaryotic kingdom.</a> Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).</li><li>Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle:+a+review+of+regulation,+deregulation+and+therapeutic+targets+in+cancer.">The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer.</a> Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).</li><li>Pardee, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restriction+point+for+control+of+normal+animal+cell+proliferation.">A restriction point for control of normal animal cell proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).</li><li>Gogendeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+causes+premature+differentiation+of+neural+and+intestinal+stem+cells.">Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells.</a> Nature Communications. 6, 8894 (2015).</li><li>Barnum, K. J., O'Connell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+regulation+by+checkpoints.">Cell cycle regulation by checkpoints.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).</li><li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine:+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication.">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218 (4571), 474-475 (1982).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+phosphohistone+H3+as+a+proliferation+marker+for+evaluating+invasive+breast+cancers:+A+comparative+study+with+Ki67.">The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67.</a> Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)+labeling+of+Drosophila+mitotic+neuroblasts.">EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).</li><li>Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms19+promotes+spindle+microtubule+assembly+in+Drosophila+neural+stem+cells.">Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells.</a> PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).</li><li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+Drosophila+larval+brain+tissue.">Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).</li><li>Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miranda,+a+protein+involved+in+neuroblast+asymmetric+division,+is+associated+with+embryonic+centrosomes+of+Drosophila+melanogaster.">Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster.</a> Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms19+is+a+mitotic+gene+that+permits+Cdk7+to+be+fully+active+as+a+Cdk-activating+kinase.">Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase.</a> Development. 145 (2), (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li><li>Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+Drosophila+larval+brain.">The development of the Drosophila larval brain.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).</li><li>Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NVX-412,+a+new+oncology+drug+candidate,+induces+S-phase+arrest+and+DNA+damage+in+cancer+cells+in+a+p53-independent+manner.">NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner.</a> PLoS One. 7, 45015 (2012).</li><li>Wyllie, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+phase+cell-cycle+arrest+following+DNA+damage+is+independent+of+the+p53/p21(WAF1)+signalling+pathway.">S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway.</a> Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DNA+replication+and+induction+of+S+phase+cell+cycle+arrest+by+G-rich+oligonucleotides.">Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).</li><li>Duronio, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+S-phase+control.">Developing S-phase control.</a> Genes &amp; Development. 26 (8), 746-750 (2012).</li><li>Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-phase+duration+is+the+main+target+of+cell+cycle+regulation+in+neural+progenitors+of+developing+ferret+neocortex.">S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).</li><li>Pereira, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cell+cycle+kinetics+by+EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity+analysis.">Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis.</a> Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li><li>Zielke, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly-FUCCI:+A+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues.">Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).</li><li>Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+profiling+cell+cycle+by+flow+cytometry+using+concurrent+staining+of+DNA+and+mitotic+markers.">Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers.</a> Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+and+transcriptome+analysis+of+drosophila+neural+stem+cells+reveals+a+role+for+Klumpfuss+in+self-renewal.">FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal.</a> Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).</li><li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing.">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li></ol>

EdU inkorporering og dens påfølgende "klikk" reaksjon med cellegjennomtrengelig azide presenterer praktiske fordeler med denne teknikken over BrdU-metoden som ble brukt tidligere7. Imidlertid er denne reaksjonen katalysert av Cu (I) ioner, og flere fargestoffer kan være ustabile i nærvær av denne kobberkatalysatoren, som det tydelig anbefales av Click-it EdU-settprodusenten. Når immunsendende eksperimenter hadde blitt utført etter å ha utført EdU-deteksjonstrinnet, ble den forventede sign...

Celledelingssyklusen består av en G1-fase (første gapfase), en replikerings-/S-fase, en G2 -fase (andregapfase) og en M-fase (mitotisk). Gjennom disse fasene gjennomgår cellen dramatiske endringer i cellulær transkripsjon, oversettelse og reorganisering av cytoskeletal maskiner1,2. Som svar på utviklings- og miljøsignaler kan celler midlertidig slutte å dele seg og bli passiv (G0) eller differensiere og permanent slutte å dele3. Andre scenarier, for eksempel DNA-skade, kan forårsake for tidlig differensiering eller apoptose3,4. Respons på slike signaler formidles av cellesykluskontrollpunkter, som fungerer som et overvåkingssystem for å sikre integriteten til essensielle cellulære prosesser før cellen forplikter seg til neste fase av divisjonssyklusen5. Derfor må studier på gener som regulerer DNA-replikasjon, sjekkpunkter og mitotiske maskineri analysere mulige cellesyklusprogresjonsfeil som kan oppstå i mutantceller eller ved siRNA-nedslag av disse genene. I tillegg kan slike analyser brukes til å teste generell cellehelse samt cellulær respons på narkotikabehandling.
5-bromo-2'-deoksyuridin (BrdU) er en tymidanalog som er innlemmet i DNA under replikasjon6. Denne metoden ble mye brukt til å identifisere celler i S-fase. Cellene blir imidlertid utsatt for harde DNA-denatureringsprosedyrer for å tillate deteksjon av BrdU ved bruk av anti-BrdU-antistoffer6. Denne harde behandlingen kan skade cellulære epitoper og forhindre ytterligere karakterisering av prøven gjennom immunstaining. EdU-inkorporering og påfølgende deteksjon av en kobberkaalysert, "klikkreaksjon" med små, cellegjennomtrengelige, fluorescerende merkede azidefarger eliminerer behovet for harde denatureringsprosedyrer7. Denne metoden dukket derfor opp som et mer praktisk alternativ til BrdU-innlemmelse.
Videre har pH3 blitt beskrevet som en pålitelig markør for mititotiske / M faseceller8. Histone H3 er et DNA-assosiert kjerne histone protein som blir fosforylatert rundt slutten av G2-fasen til tidlig M-fase og er de-fosforilert mot slutten av anafase8. Flere kommersielle antistoffer kan brukes til å oppdage pH3 ved hjelp av standard immundempende protokoller. Dobbel farging av EdU og pH3 vil derfor muliggjøre deteksjon av celler i S-fase så vel som M-fase. I tillegg vil celler i G1 og tidlig G2-fase ikke farge positivt for noen av markørene.
Drosophila nevrale stamceller eller nevroblaster (NBs) tilbyr en godt karakterisert stamcellemodell der cellene deler seg asymmetrisk for å produsere en identisk selvfornyende NB og en ganglion morcelle (GMC), som er skjebnebestemt for differensiering9. I tillegg gjør flere genetiske verktøy og NB-spesifikke antistoffer dette systemet egnet for genetisk manipulasjon og levende celleavbildning. Følgelig har flere studier brukt NBs til å studere gener som regulerer asymmetriske divisjoner og celle skjebnebestemmelse9. Distinkte populasjoner av NBs eksisterer i den sentrale hjernen (CB) og den optiske loben (OL) i larvalhjernen9; CB NBs ble brukt til den nåværende studien. Disse tredje instar larval CB NBs er store celler som også er egnet for å studere faktorer som regulerer mitotisk spindelmontering. En protokoll for å analysere cellesyklusprogresjonsfeil ville være et viktig verktøy i slike studier.
Protokoller publisert tidligere brukte kommersielle sett, for eksempel Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, som gir flere reaksjonskomponenter og azidefarger merket med en rekke Alexa Fluor-fargestoffer for EdU-inkorporering ogdeteksjon 10. Reagensene som leveres med slike sett er imidlertid ikke kompatible med noen fluorescerende koder som ofte brukes med sekundære antistoffer. Dette EdU-deteksjonssettet (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit levert med Alexa Fluor 647-konjugert azidefarge) ble testet i Drosophila tredje instar larval NBs, og co-farging ble forsøkt med antistoffer mot pH3 og Miranda, en markør for NBs. Videre ble Alexa Fluor 568- eller Cy3-taggede sekundære antistoffer brukt til påvisning av Miranda-merking på plasmamembranen til NBs11. Forventet signalintensitet og fargingsmønster (upubliserte resultater) ble imidlertid ikke observert med disse sekundære antistoffene da immunstaining ble utført etter EdU-deteksjon.
For EdU-inkorporering krevde protokollen beskrevet av Daul og kolleger fôring av larver med Kankel-White medium blandet med EdU og bromophenol blå (BPB)10. Larvene matet på EdU og BPB-spiked mat, som kunne ses av sin blå farge ved inntak i larval tarmen. Selv om denne metoden ble brukt til EdU-inkorporering i Mms19 funksjonstap (Mms19P) tredje instar larver, matet Mms19P larver tilsynelatende ikke da knapt noen blå farge ble oppdaget i larval tarmen (upubliserte resultater). Mms19P larver viser drastiske utviklingsdeformiteter og til slutt arrestasjon i tredje instar-stadium. Dette kan på en eller annen måte påvirke fôringsatferden til de tredje instar larver og gjøre EdU-fôringsprotokollen uegnet for slike tilfeller.
Etter å ha studert tilgjengelig litteratur og arbeidet mye med standardisering av viktige trinn, ble det foreslått en alternativ tilnærming for EdU / pH3 dual-labeling i Drosophila NBs, som ikke krever fôring av EdU til larver. En tidligere studie benyttet dobbel EdU / pH3 farging for å analysere cellesyklusen i NBs, men presenterte ikke en detaljert protokoll4. Dette presenterer et unødvendig hinder for laboratorier som prøver å implementere denne metoden. Videre kan evaluering av kompatibiliteten til ulike reagenser med EdU-settet og utføre ytterligere optimalisering være en tidkrevende prosess. Dette dokumentet presenterer en trinnvis protokoll som dekker EdU-inkorporering i dissekerte larvalhjerner og immunoppfatning med anti-pH3-antistoffer, etterfulgt av konfokal mikroskopi og bildeanalyse for å tildele NBer til fire forskjellige kategorier: G0/G1-fase, S-fase, S>G2/M (progresjon fra S til G2/M) og M-fase. Trinnene som trenger optimalisering er skissert og tips gitt for bildeanalyse av store datasett. I tillegg analyseres EdU/pH3-avlesningen i wild-type NBer og sammenlignes med Mms19P NBs, som nylig ble rapportert å vise en cellesyklusforsinkelse11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>fly stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>#15477</td>
			<td>P-element insertion in the third exon of Mms19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;+; Mms19::eGFP, Mms19p</td>
			<td>Generated in house</td>
			<td></td>
			<td>eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>#3605</td>
			<td>wild-type stock (w;+;+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Miranda</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab197788</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-pH3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9701</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>112-165-167</td>
			<td>1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27034</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount mounting medium</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) fraction V</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Imagej)</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite (LAS X)</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM</td>
			<td>Graph pad software</td>
			<td>Version 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft office</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>water-soluble, non-fluorescing mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells

In vivo cellesyklusprogresjonsanalyse utføres rutinemessig i studier på gener som regulerer mitose og DNA-replikasjon. 5-Ethynyl-2'-deoksyuridin (EdU) har blitt brukt til å undersøke replikerings-/S-faseprogresjon, mens antistoffer mot fosfo-histon H3 har blitt brukt til å markere mititotiske kjerner og celler. En kombinasjon av begge etikettene vil gjøre det mulig for klassifiseringen av G0/G1 (Gap fase), S (replikeringsmiddel) og M (mitotic) faser og tjene som et viktig verktøy for å evaluere effekten av mititotiske gen knockdowns eller null mutanter på celle syklus progresjon. Reagensene som brukes til å markere EdU-merkede celler er imidlertid inkompatible med flere sekundære antistoff-fluorescerende koder. Dette kompliserer immunstaining, der primære og taggede sekundære antistoffer brukes til å markere pH3-positive mititotiske celler. Dette dokumentet beskriver en trinnvis protokoll for dobbeltmerking av EdU og pH3 i Drosophila larval nevrale stamceller, et system som brukes mye til å studere mititotiske faktorer. I tillegg er det gitt en protokoll for bildeanalyse og kvantifisering for å tildele merkede celler i 3 forskjellige kategorier, G0/G1, S, S>G2/M (progresjon fra S til G2/M) og M-faser.

Den bi-lobed Drosophila tredje instar larval hjernen har blitt brukt som et modellsystem for å studere grunnleggende cellulære og utviklingsmessige prosesser9. Fokuset i den nåværende studien var å presentere en protokoll for analyse av cellesyklusprogresjon i EdU- og pH3-merkede NBs i CB-regionen (figur 1). CB NBs er delt inn i type I og type II, og de viser det karakteristiske asymmetriske divisjonsmønsteret9. Hver type I NB-di...

Watch this Scientific Journal Video about 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells at JoVE.com 

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells (Video) | JoVE 

Cellesyklusanalyse med 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) og fosfo-histon H3 (pH3) merking er en flertrinnsprosedyre som kan kreve omfattende optimalisering. Her presenterer vi en detaljert protokoll som beskriver alle trinnene for denne prosedyren, inkludert bildeanalyse og kvantifisering for å skille celler i forskjellige cellesyklusfaser.

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Fosfo-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for cell cycle progresjonsanalyse i Drosophila Neural Stamceller

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ...

I denne protokollen gir vi ikke bare en detaljert forklaring av hvert trinn i EDU-inkorporering og immunstaining, men forklarer også bildeinnhenting, bildebehandling og gir noen tips for å analysere store datasett. Denne teknikken gjør det mulig å fordele celler i G1-, S- og M-faser. Dette vil være spesielt nyttig for cellesyklusanalyse på studier på ikke-mutasjoner som påvirker mititotiske gener.Vi forventer at folk vil slite i to til tre måneder hvis de ikke har forkunnskaper eller erfaring med denne teknikken. Til å begynne med, legg Schneiders disseksjonsmedium eller SM til to påfølgende depresjoner av en glansflekkplate og legg PBS til den påfølgende depresjonen. Bruk et par tang, velg vandrende tredje instar larver og legg dem på et vev ratted med PBS for å rense av fluematrester.Plasser larven i depresjonen med PBS etterfulgt av den påfølgende depresjonen som inneholder SM. Neste under et disseksjonsmikroskop, bruk fine tang for å fjerne tre fjerdedeler av larvens underkropp. Ta deretter forsiktig tak i larvemunnkrokene med ett par tang og hold neglebåndet i den andre enden med det andre par tang. Vri larvehodet ut og inn ved å skyve munnkrokene innover og samtidig skrelle av vevet i den andre enden.Vær oppmerksom på larvalhjernen med vedlagte imaginale plater. Fjern andre vev festet til hjernen og overfør hjernen til den påfølgende påfølgende depresjonen med SM. Tilsett 100 mikroliter 100 mikromolar EDU SM-oppløsning til en annen depresjon på Pyrex-platen og inkuber omtrent 5 til 10 dissekerte hjerner i denne løsningen i 2 timer ved 25 grader Celsius. Etter fiksering og immunstaining fjern PBST og legg til EDU-deteksjonscocktailen til de dissekerte hjernene.Deretter inkuberer du dem ved romtemperatur i mørket på et neutater. Etter 30 minutter, vask prøvene to ganger med PBST i 10 minutter per vask i mørket. For DNA-farging, lag 5 mikrogram per milliliter Hoechst 33342 løsning.Fjern PBST etter den andre vasken og tilsett 500 mikroliter av Hoechst-løsningen til de dissekerte hjernene, og inkuber dem deretter i mørket. Etter 10 minutter, fjern Hoechst og vask prøvene med PBST i 10 minutter. Trykk på røret på labbenken og la hjernen slå seg ned.Fjern PBST fra røret, og la det være 50 til 100 mikroliter. Klipp enden av en 200 mikroliter mikropipetspiss og bruk den til å overføre hjernen til en ren glasssklie. Fjern tilgangs-PBST fra lysbildet ved å blåse det opp med filterpapirstrimler.Ikke la filterpapiret berøre hjernen. Sett en dråpe av et vannløselig, ikke fluorescerende monteringsmedium på hjernen og orienter hjernen slik at ventral nerveledning vender mot lysbildet og lobene vender oppover. Ordne hjernen i en enkelt fil slik at det er lettere å avbilde hjernene serielt.Legg forsiktig en dekselslipp på toppen av hjernen og inkuber lysbildet over natten ved 2 til 6 grader Celsius. Velg målsettingen 63 ganger fra anskaffelsesprogramvaren. Sett en dråpe nedsenkningsolje på dekselslippet like over de monterte hjernene for å gjøre det lettere å finne vevet gjennom okularet.Bruk dappy Hoechst 33342-kanalen til å finne hjernen gjennom okularet og bytt deretter til anskaffelsesmodus i programvaren. Sett opp 4 kanaler til bilde Hoechst 33342, Alexa etasje 4 8 8, Alexa etasje 5 6, 8 og Alexa etasje 6 4 7. Bruk fargeassistentverktøyet til automatisk å sette opp de valgte fargestoffene eksitasjonslasere og utslippsfiltre.Sett synsfeltet slik at det omfatter hele hjerneloben. Bilde hele volumet av hjernen lobe ved å anskaffe denne skatten fordelt 0.8 mikron fra hverandre. Lagre alle bilder fra en bildeøkt i et dot L I F-bibliotekformat.For bildeanalyse åpner du Fiji, drar og slipper LIF-filene i Fiji. Velg nettleser fra kategorien for stakkvisning og bruk virtuell stakk fra kategorien minnebehandling i plugin-modulen for bioformater. Legg merke til flerkanalsbildet som vises i bilde J.Endre fargen på kanalene fra menylinjen ved hjelp av bilde-, farge- og kanalverktøyet.Og overvåk Miranda-merkede nevroblaster, som fremstår som store runde celler i den sentrale hjerneregionen. Tegn en interesseregion ved hjelp av ellipseverktøyet over hver nevroblass for å unngå å telle nevroblåseren to ganger. Velg analyse, verktøy og avkastningsbehandling på menylinjen for bilde J.Merk alle nevroblaster i gjeldende Z-seksjon og trykk på T etter å ha merket hver celle. Når alle nevroblaster i den nåværende Z-delen er merket, endrer du kanalene til pH3 og EDU og teller manuelt antall EDU-positive nevroblaster, pH3-positive nevroblaster, EDU og pH3 positive nevroblaster og nevroblaster som ikke flekker for noen av markørene. Søk etter nevroblaster og påfølgende Z-seksjoner, slett gamle ROIer og legg til nye ROIer for å telle nevroblaster i forskjellige stabler.Forbered et regneark og beregn prosentandeler av nevroblaster som finnes i alle fire kategoriene for hver lobe. Klargjør en stolpediagram ved hjelp av regnearkprogramvaren, som viser utvalgsdataene for prosenter av nevroblaster i hver kategori. Sentrale hjerne-nevroblaster fra tredje instar larvalhjerner merket med Miranda, EDU og pH3 vises her.Celler ble tildelt G1/G0-, S-, SG2/M- og M-faser. I EDU pH3-analyse, en betydelig høyere andel mms19, ble tap av funksjon nevroblaster funnet i M-fasen sammenlignet med vill type nevroblaster. MMS19:eGFP-uttrykk i MMS19-tapet av funksjonsbakgrunn reddet andelen celler i M-fase til villtype.Det er viktig å ikke bruke skadede hjerner for etterfølgende trinn. Og ED-oppløsning bør tilberedes ferskt før disseksjoner påbegynnes. Denne ressursen kan brukes som en rask innledende screening for å identifisere feil i bestemte cellesyklusfaser.Dette kan da følges opp av en mer detaljert analyse av en bestemt fase.

Research

JoVE Journal

Biology

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth (Video) | JoVE 

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells (Video) | JoVE 

Analyse av Cell Cycle Posisjon i pattedyrceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors (Video) | JoVE 

Fenotypeanalyser og Isolering av murine hematopoetiske stamceller og Lineage-engasjerte stamfedre

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) Using Retroviral Vector with GFP (Video) | JoVE 

Omprogrammering Menneskelige Somatiske celler i Utførte pluripotent stamceller (iPSCs) Bruke retrovirale Vector med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Måling cellesyklusprogresjon Kinetics med metabolsk Merking og flowcytometrisystemer

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition (Video) | JoVE 

Induksjon og analyse av Epiteliale til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus (Video) | JoVE 

Effektiv Generation Menneskelig indusert pluripotent stamceller fra menneskelige somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR (Video) | JoVE 

Profilering Individuell humane embryonale stamceller ved kvantitativ RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...